1. INTERACCIONES ANTIGENO-
ANTICUERPO, ENSAYOS INMUNES Y
SISTEMAS EXPERIMENTALES

2. INTRODUCCIÓN
• La utilización de la reacción in vitro entre
antígenos y anticuerpos séricos (serología)
sirve de base para muchos ensayos inmunes.
• Debido a la notable especificidad de la
respuesta inmune, la interacción entre
antígeno y anticuerpo in vitro se utiliza
ampliamente con propósitos diagnósticos,
para la detección bien sea de antígenos o de
anticuerpos. Ejemplo serotipificación de
diversos microorganismos utilizando
antisueros específicos.

4. • La interacción de antígenos multivalentes con
anticuerpos con al menos sitios de
combinación por molécula, que generan
ligamiento cruzado (ver Figura), puede
resultar en:
• - precipitación (si el antígeno es soluble)
• - aglutinación (si el antígeno es particulado)
• - activación del complemento

5. Se utilizan otros ensayos inmunes en la
evaluación y el estudio de los componentes
celulares del sistema inmune, como son:
- métodos de rutina para medir la función
linfocitaria (métodos para medir la
inmunocompetencia humoral y de células T).
- sistemas de cultivo celular
- técnicas de ADN recombinante

6. 1. Interacciones Primarias Entre Antígeno y
Anticuerpo
• Las fuerzas de unión entre un anticuerpo y un
epítope son por enlaces no-covalentes y por
tanto relativamente débiles. Involucran
fuerzas de van der Waals, electrostáticas e
hidrofóbicas.
• Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden
disociar fácilmente por:
• - Cambio de pH
• - Concentraciones salinas altas
• - iones caotrópicos (cianatos que interfieren con los
puentes de hidrógeno de las moléculas de agua)

7. 1.1 Constante de Asociación, Afinidad y Avidez
• Es una medida de afinidad de un anticuerpo
monovalente por un epítope del antígeno o un
hapteno.
• La afinidad de unión de un anticuerpo anti-A
con un antígeno multivalente A puede ser
varias veces mayor que la afinidad con un
antígeno univalente A (ver Figura).
• La asociación entre un antígeno y anticuerpos
depende de:
• - la afinidad de cada epítope y su anticuerpo
correspondiente
• - la suma de las afinidades de todos los epítopes
involucrados.

10. • El termino avidez se utiliza para denotar la
energía de unión promedio entre anticuerpos
y un antígeno multivalente.
• En general, anticuerpos IgM tienen mayor
avidez que anticuerpos IgG, aunque la unión
de cada Fab en el anticuerpo IgM puede tener
la misma afinidad que el Fab de un IgG.

12. 2. Interacciones Secundarias entre Antígeno y
Anticuerpo
2.1 Reacciones de Aglutinación
• La reacción de un anticuerpo con un antígeno
multivalente que es particulado (ejemplo, una
partícula insoluble) resulta en el ligamiento
cruzado de varias partículas antígenos por los
anticuerpos. El ligamiento cruzado resulta
eventualmente en la aglutinación de los
antígenos por los anticuerpos.

13. Aglutinación

14. 2.1.1 Título.
El ensayo de aglutinación.
• - es un método que algunas veces se utiliza para
medir el nivel de un anticuerpo sérico especifico para
un antígeno particulado.
• - El título aglutinante de un suero determinado es
una expresión semicuantitativa de los anticuerpos
presentes en el suero.
• - se realiza mezclando diluciones séricas con una
concentración fija de antígeno. Diluciones altas no
causan aglutinación del antígeno. La dilución más
alta de un suero que alcanza aglutinación visible del
antígeno se denomina título.

15. • Tubos con altas concentraciones de suero que
no causan aglutinación representan una
prozona. Por qué no aglutina? por exceso de
anticuerpos, cada epítope de una partícula se
une únicamente a una sola molécula de
anticuerpo, por lo que se previene el
ligamiento cruzado entre diferentes partículas.
• Debido al fenómeno de prozona es imperativo
que el antisuero se pruebe en diferentes
diluciones.

16. 2.1.2 Potencial Zeta.
• Ciertos antígenos partículados pueden poseer una
carga eléctrica, ejemplo, carga neta negativa de
eritrocitos debido al ácido siálico.
• Partículas cargadas suspendidas en solución salina
generan un potencial eléctrico llamado potencial
zeta, que impide estén muy cerca la una de la otra.
• Debido al potencial zeta, anticuerpos con brazos Fab
cortos (IgG) puede que no aglutinen antígenos,
mientras que anticuerpos como IgM con Fab más
largos y pentavalentes si lo pueden hacer.
• ¿Cómo aglutinar antígenos de eritrocitos con
anticuerpos IgG?

18. 2.1.3 El Test de Coombs
• El termino denota, la detección usando anti-
inmunoglobulinas, de cualquier Ig unida a un
antígeno
- Emplea anticuerpos contra inmunoglobulinas (por
eso también se llama el test anti-inmunoglobulina).
- Se basa en dos hechos importantes:
i) inmunoglobulinas de una especie son inmunogénicas
cuando se inyectan en otra especie
ii) muchas de las anti-inmunoglobulinas (ejemplo, IgG
de conejo anti-humano) se unen a la porción Fc del
anticuerpo, dejando libre las porciones Fab para que
reaccionen con el antígeno.

19. • Cuando se utiliza por ejemplo, IgG humano
contra antígenos de eritrocitos exhibiendo
potencial zeta no hay aglutinación, pero al
adicionar IgG de conejo contra IgG humano
éste se une a Fc y puede hacer ligamiento
cruzado de IgG humanos sobre eritrocitos
relativamente distantes (ver Figura).
• Incluso la adición de anti-inmunoglobulina
puede causar aglutinación en caso de
concentración alta de anticuerpos dirigidos
contra eritrocitos (fenómeno de prozona).

21. Hay dos versiones del Test de Coombs.
1. Test directo.
• Detecta anticuerpos unidos.
• - se adicionan anti-inmunoglbulinas a las partículas
(ejemplo, eritrocitos) que se sospecha tienen
anticuerpos unidos a antígenos sobre sus superficies.
• - Ejemplo: recién nacido con sospecha de
enfermedad hemolítica. Si el Test de Coombs
utilizando una suspensión con eritrocitos de un bebé
aglutina significa que presenta la enfermedad.

23. 2. Test indirecto.
• Detecta anticuerpos en suero.
- se utiliza para detectar la presencia, en el suero, de
anticuerpos específicos contra antígenos particulados.
- anticuerpos séricos si se adicionan a partículas
puede que no las aglutinen debido al potencial zeta. La
adición subsiguiente de anti-Ig causará aglutinación.
- Ejemplo: detección de anticuerpos IgG anti-Rh en
la sangre de mujeres Rh-negativas.

25. 2.1.4 Aglutinación Pasiva.
• Si el antígeno es un constituyente natural de
una partícula, la reacción de aglutinación se
conoce como aglutinación directa.
• Si la reacción de aglutinación ocurre entre
anticuerpos y antígenos solubles que se han
adherido a una partícula insoluble, se conoce
como aglutinación pasiva.

26. • La reacción de aglutinación (directa o pasiva,
sin o con el Test de Coombs) se utiliza
ampliamente en clínica. Ejemplos:
- tipificación de eritrocitos en bancos de sangre
- diagnóstico de diversas enfermedades hemolíticas
mediadas inmunológicamente (anemia auto-hemolítica
inducida por droga)
- tests para el factor reumatoide (IgM humana contra
IgG humana)
- test confirmatorio para sífilis
- test látex de embarazo (detección de HCG en la orina
de una mujer embarazada)

27. ENSAYOS DE AGLUTINACIÓN
Hemaglutinación de Isoantígenos
• En la tipificación sanguínea, los anticuerpos se
adicionan a células sanguíneas rojas dando una
reacción positiva cuando se amontonan las células o
"hemaglutinación".
• Los reactivos se preparan en una solución coloreada
para observar más facilmente los agregados RBC. De la
misma manera, en un suero de paciente, se le puede
probar al anticuerpo, la capacidad de generar
hemaglutinación de RBCs debido a la presencia del
anticuerpo que reconoce isoantígenos que no están
presentes en los RBCs del propio paciente.

28. - Personas con el tipo de sangre
A tienen anticuerpos anti-B;
-Personas con el tipo de sangre
B tienen anticuerpos anti-A;
- Personas con el tipo de sangre
O tienen anticuerpos anti-A y
anti-B;
- Personas con el tipo de sangre
AB no tienen anticuerpos que
reconozcan ningún isoantígeno.
Por tanto, la prueba es un
método rápido para determinar
si un paciete tiene niveles
normales de anticuerpos típicos
basados en el tipo de sangre
sanguíneo

29. • Prueba de Aglutinación en Látex
• El test de aglutinación en látex es uno de los
diversos tipos de aglutinación por anticuerpos
que detectan antígenos en una muestra
utilizando anticuerpos unidos a una cama u otro
material visible.
• Detecta la presencia de antígenos bacterianos
que están presentes como reactivos en el
sistema, unidos a la superficie de camas azules
de látex. Una reacción positiva causa la
agrupación de las camas. Las camas agrupadas
se pueden ver a simple vista. Una reacción
negativa deja las camas de látex en solución y
de aspecto azul lechoso.

30. 2.2 Reacciones de Precipitación
• 2.2.1 Reacciones en soluciones.
• Ocurren cuando se mezclan anticuerpos y
antígenos solubles.
• La precipitación de complejos antígeno-
anticuerpo ocurre debido a que anticuerpos
divalentes cruzan ligadamente antígenos
multivalentes formando un enrejado, que
cuando alcanza un determinado tamaño
precipita (reacción de precipitina).

31. Precipitación
• Una reacción de precipitación ocurre como
resultado de la combinación de anticuerpos
en solución con sustancias solubles con las
que los anticuerpos reaccionan.
• Si ocurre in vivo una reacción de
precipitación en las articulaciones o en el
riñón, ocasiona inflamación debido a que
los complejos inmunes en esas áreas son
filtrados hacia afuera causando irritación.

33. Precipitación (continuación)
• En un test de precipitina sérica, se combinan
las diluciones del antígeno el anticuerpo en
solución acuosa hasta que ocurre una reacción
de precipitacion y particulas visibles se
acumulan.
• Con un nefelometro se puede medir la
cantidad de "flocculation“, midiendo las
propiedades de dispersión de la luz de
particulas en agregación. La prueba "Gold
Standard" para la sífilis tiene como base una
reacción inmunológica de floculación.

34. Precipitación en Solución
• Es dificil de lograr la “Zona de Equivalencia”
precisa donde hay una concentración perfecta
tanto de antígeno como de anticuerpo en
solución.
• Se requerirían preparar muchos tubos con
diversas concentraciones de anticuerpos y
antígenos para lograr justo la cantidad
apropiada.
• Únicamente después de la centrifugación el
anillo delgado se hace más visible.

37. • En la práctica, las reacciones de precipitación
se preparan generalmente, como reacciones
de difusión en agar, para hacer más visible el
precipitado.

38. Inmunodifusión en Geles de Agar
• Se utiliza un gel de agarosa como matrix para
combinar difusión con precipitación. Los
reactivos difunden a través del gel resultando en
precipitación cuando se alcanzan los puntos de
equivalencia.
• Un solo antígeno puede dar lugar a una sola línea
de precipitación en la presencia de su anticuerpo
homólogo. Cuando hay dos antígenos presentes
en un sistema, cada uno se comporta
independientemente. Por lo tanto, si se detectan
varias bandas de precipitación, equivalen al
menos a un número igual de combinaciones
antígeno-anticuerpo.

40. • Los anticuerpos séricos no son homogéneos(uno
tiene anticuerpos que reconocen todo tipo de
organismos infecciosos y de alergénos).
• Es dificil obtener un solo antígeno aun en las
preparaciones más puras, de modo que hay
diversas reacciones posibles antígeno-anticuerpo
en una sola mezcla.
• La difusión en gel permite examinar dichos
sistemas múltiples debido a que la técnica
permite la separación de las reacciones.
• Como los componentes individuales en un
sistema reaccionan independientemente, los
tests de precipitación en agar se denominan
"inmunodifusión doble " o simplemente
inmunodifusión (anteriormente se denominaba
de Ouchterlon).

41. • El color blanco espeso de la matrix sólida de agar
permite visualizar la reacción de precipitación. El
método se utiliza clinicamente en
inmunología/reumatología.
• Esta técnica tiene diversas y diferentes
aplicaciones; ejemplos incluyen:
• - Determinación de la homogeneidad de sistemas
antígeno-anticuerpo.
• - Diagnosticar enfermedades autoinmunes
especificas.
• - Después de la purificación de una mezcla de
antígenos.
• - Elucidar las reacciones entre antígenos
relacionados serológicamente.

42. La precipitación aparece
como una línea continua en la
forma de un ángulo entre los
dos pozos y el pozo 3.
Esta banda sin ninguna
proyección en el angulo se
denomina banda de
identidad.

43. Si se coloca en el pozo 1 una
solución con antígenos X y Y, en el
pozo 2 una solución con solo
antígeno X, y en el pozo 3 antisuero
con anticuerpos especificos tanto
para X como para Y, se observa una
reacción similar a la de la Fig.
Note que hay una proyección de
reacción hacia el pozo XY, lo que
indica que están relacionados los
dos materiales antigénicos de los
pozos 1 y 2, pero que el material
en el pozo 1 posee una
especificidad antigénica que no
posee el material en el pozo 2. esto
indica una identidad parcial.

44. Si el material en los pozos 1 y
2 no poseen antígenos en
común y el antisuero en el
pozo 3 posee especificidades
para ambos materiales, la
reacción aparece como dos
líneas que se cruzan.

46. Inmunoelectroforesis (IEP)
• La (IEP) es un procedimiento que combina la
separación de antígenos por electroforesis de
zona con la difusion de anticuerpos precipitantes
en angulos rectos hacia la dirección de la
migración del antígeno.
• La extensión de la migración de cualquier
proteína depende del buffer de electroforesis,
tiempo, voltaje, y punto isoeléctrico de la
proteína. En especial, el pH determina la
separación de una proteína de otra.
• La diferencia neta entre el punto isoeléctrico de
una determinada proteína y el pH del buffer de
electroforesis determina la extensión de la
migración hacia el catodo o el anodo.

47. • Este método inmunológico se utiliza para
detectar anormalidades en proteínas séricas
especificas y para identificar inmunoglobulinas
especificas utilizando reactivos anticuerpos anti-
humanos.
• Los reactivos anticuerpos anti-humanos se han
preparado contra fracciones purificadas de
globulinas humanas y se obtienen
comercialmente para propósitos de investigación
o biomédicos.

49. WESTERN BLOT

50. RADIOINMUNOENSAYO

55. ELISA

56. CLASIFICADOR DE
CELULAS ACTIVADO
POR FLUORESCENCIA

57. Anticuerpos Monoclonales

58. Método de Inmunofluorescencia
• Su propósito es detectar la localización y la
abundancia relativa de cualquier proteína para la
cual se tiene un anticuerpo.
• Utilizando anticuerpos para la proteína, puede
conocer donde esa proteína se localiza.
• Por ejemplo, si va a utilizar anticuerpos para la
bomba calcio ATPasa, que se localiza en el
reticulo endoplasmático de la célula debe tener
presente:
• - que el anticuerpo utilizado reconoce la calcio
ATPasa de gallina.
• - la inmunofluorescencia se puede utilizar para
cualquier proteína.

59. • La clave para éste método es la habilidad para
visualizar el anticuerpo cuando se mira a
través de un microscopio.
• Como los anticuerpos son más pequeños que
las calcio ATPasas, el anticuerpo no se puede
ver directamente.
• Por lo que se usa un marcador fluorescente
unido covalentemente al anticuerpo.
• Cuando una luz ilumina el marcador
fluorecente, este absorve la luz y emite una
luz de color diferente que es visible para el
investigador y se puede fotografiar.

60. Figure. Illustration of the direct and indirect methods for immunofluorescence.

61. Figura. In most immunofluorescence
experiments, two antibodies are
employed.
The first one, called the primary antibody,
is typically generated in a mouse and
binds to your favorite protein, which in
this case is the chicken calcium ATPase
(shown as a series undulating striped line
that zigzags through the ER membrane 10
times).
The secondary antibody was purchased
from a company that sells antibodies that
bind to mouse antibodies and have a
fluorescent dye covalently attached to it.
As illustrated here, the secondary
antibodies can bind to multiple sites on
the primary antibody and thus produce a
brighter signal since more dyes are
brought to a single location.

62. Figura.
This immunofluorescence
micrograph shows the ER being
labeled with a monoclonal
antibody against the chicken
calcium ATPase.
This chicken cell was fixed,
permeablilized, and processed for
immunofluorescence.
White indicates the location of the
fluorescent antibody and thus the
calcium ATPase to which the
antibody was bound.

63. Immunofluorescence image of the Immunofluorescence - Axons of the
eukaryotic cytoskeleton. Actin filaments Drosophila CNS antibody [BP102]
are shown in red, microtubules in green, (ab12455)
and the nuclei in blue.

64. RATONES TRANSGÉNICOS
Genes responsible for particular traits
or disease susceptibility are chosen
and extracted. Next they are injected
into fertilized mouse eggs. Embryos
are implanted in the uterus of a
surrogate mother. The selected genes
will be expressed by some of the
offspring.
Since the first gene transfers into mice
were successfully executed in 1980,
transgenic mice have allowed
researchers to observe experimentally
what happens to an entire organism
during the progression of a disease.
Transgenic mice have become models
for studying human diseases and their
treatments.

66. The image shows transgenic mice that carry Transgenic mouse lines expressing GFP,
the piggyBac transposon that has caused known as "green mice." FEBS Lett, 407,
their cells to express red fluorescent 313-9 (1997)
protein. (Credit: Howard Hughes Medical
Institute (HHMI), Yale University).

67. RATONES
KNOCKOUT

68. N2KO mice created by the PI in 1997,
that contain a targeted deletion of the
Nhlh2 transcription factor (Good et al,
1997).
These animals develop an adult onset
overweight phenotype, characterized by
increased body weight and body fat
after 7 (females) to 12 (males) weeks of
age.
Weight gain is not due to increased food
intake but due, rather, to failure to
partake in high levels of physical activity.
Thus, failure to exercise leads to adult-
onset obesity in N2KO mice (Coyle et al.,
2002).
This problem extends directly to
humans, as being overweight is a
worldwide problem that affects nearly
60% of the U.S. adult population, due in
part to sedentary lifestyles.