1. Universidad Nacional Autónoma de Honduras
Facultad de Ciencias
Escuela de Microbiología
Seminario análisis clínico (MB-215)
Tema del seminario:
“Métodos de laboratorio para estudio de resistencia a antibióticos”
Alumno:
Joel Saamir García
Tegucigalpa MDC, 13 de Febrero del 2014

2. Las pruebas de susceptibilidad a los
antibióticos, una estrategia para frenar la expansión
de la resistencia bacteriana.

3. Desde el año de 1995, la Organización Panamericana de la Salud (OPS)
inició un programa que permite realizar la vigilancia de los agentes
bacterianos y su correspondiente prueba de susceptibilidad a los antibioticos
(PSA)
PSA y vigilancia epidemiológica
Según la OMS los métodos para el estudio de la resistencia microbiana se
puede clasificar en tres tipos:
1) In vitro: P ejem: Difusión en disco, dilución en caldo, etc
2) In vivo: P ejem: Vigilancia de la resistencia a los medicamentos antipalúdicos.
3) Moleculares: En base a la genómica/proteómica y se han utilizado para detectar
resistencia genotípica en bacterias.
*No hay un método estandarizado que se use de manera internacional y que
sea único.

4. Métodos de laboratorio para estudiar resistencia a
antibióticos

5. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Algunas infecciones se trataban exitosamente en base en la experiencia
clínica pasada de los clínicos (terapia empírica), esto cada vez se vuelve
más difícil y poco práctico.
Resistencia a muchos
antibióticos
Variedad de antibióticos
disponibles
Clínicos más pendientes de los datos de las pruebas de sensibilidad que se
practican in vitro, esto pone en relieve la importancia del laboratorio de
diagnóstico en la práctica clínica.
La prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de las tantas armas con
las que contamos en el laboratorio para ayudar a los profesionales en
medicina controlar los procesos infecciosos que se desarrolla en los
pacientes.

6. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
¿Qué principios debe cumplir una metodología para poder ser
utilizada como un ensayo de sensibilidad?
 Facilidad de realización
 Flexibilidad
 Coste
 Reproducibilidad
 Fiabilidad
 Exactitud
 Adaptación a los sistemas
automatizados o semiautomatizados
¿Qué directrices o estándares regulan las pruebas de sensibilidad a
los antibióticos y su interpretación?
 Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI/NCCLS, EE. UU.)
 Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC, Reino Unido)
 Comité de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiología (CASFM,
Francia)
 Instituto Alemán de Normativas (DIN, Alemania), entre otros.

7. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
¿Cuáles son los métodos disponibles para probar la sensibilidad a los
antibióticos?
Métodos de difusión
 Difusión en disco
 E-Test
Métodos de dilución
 Macro dilución en caldo
 Micro dilución en caldo
 Dilución en medio sólido
con agar
Otros métodos
 Métodos moleculares
 Métodos automatizados

8. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Método de difusión en disco
Difusión de un antibiótico a una determinada concentración a partir de
discos, que se depositan en un medio de cultivo sólido que ha sido
sembrado con el aislamiento del inóculo seleccionado en cultivo aséptico.
Zona de inhibición del crecimiento es
proporcional a la sensibilidad de la bacteria frente
al antibiótico presente en el disco.
Difusión de un antibiótico en un medio de cultivo
inoculado crea un gradiente de la sustancia
antibiótica.
Diámetro zona de inhibición corresponde a la MIC.

9. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Método de difusión en disco
> zona de inhibición, < es la concentración del antibiótico que se
requiere para inhibir el crecimiento de la bacteria.
Considerar el tamaño de la zona de inhibición.
Sus principales ventajas son:
Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba
cuando así se requiera.
Bajo coste.
Se puede utilizar como una prueba de detección frente a gran número
de aislamientos.

10. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Métodos microbiológicos para la detección de BLEE
Método de sinergia de doble disco. (Recomendado por la NCCLS en 1998).
Discos de CTX (30 μ g), CAZ (30 μ g) y
AMC (20/10 μ g) en una placa de agar
Müeller-Hinton. Las placas se incuban 18-
24 h a 37 C en atmósfera aeróbica.
Ensanchamiento en la zona de inhibición
comprendida entre los discos de CTX o
CAZ y AMC.
Positivo para BLEE

11. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Método de tiras Épsilon (E test)
Combina la simplicidad y flexibilidad de las
pruebas de disco-difusión con la capacidad para
cuantificar la CIM de las técnicas de dilución.
Tira de plástico no poroso con un gradiente
predefinido.
CMI será el valor obtenido en el punto de
intersección de la elipse de inhibición con la tira.
Técnica fácil de realizar, reproducible y de rápida
interpretación.

12. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Macro dilución en caldo
Cada agente bacteriano se prueba en un
rango de concentraciones que suele
expresarse en ug de fármaco activo/mL de
caldo (ug/mL).
La concentración de prueba para un fármaco
puede variar según la bacteria y las
resistencias asociadas que se intenta detectar
con la prueba.
16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 ug/ml (Rangos típicos de concentraciones).
CMI = Menor concentración de antibiótico que inhibe por completo el
crecimiento bacteriano observable.
Ventajas: Aportan resultados de CMI y CMB

13. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Micro dilución en caldo
Técnica de dilución en medio
líquido, pero realizada en placas de
poliestireno, con micropocillos en lugar
de tubos.
Los pocillos de cada columna tienen
concentraciones crecientes de un
antibiótico.
Generalmente alrededor de 200 ul de medio por pocillo
(Inóculo).
Se determinar la CIM, como en la macro dilución.
Hay paneles comercializados de ayuda para la interpretación de los
resultados.

14. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Dilución en medio sólido con agar
Concentraciones variadas de antibióticos, en un
medio solidificado con agar, utilizando
generalmente diluciones seriadas dobles.
Los resultados derivados de estos ensayos se
consideran como los más fiables para la
determinación del valor MIC
Las ventajas son:
Capacidad de ensayar simultáneamente varias
bacterias
CIM para N. gonorrhoeae.
Ensayo estandarizado para bacterias difíciles de cultivar.

15. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Métodos moleculares
Detección de los genes de resistencia a los
antibióticos
Predecir los fenotipos de resistencia a los
antibióticos por la vía de la identificación y la
caracterización de los genes conocidos que
codifican los mecanismos de resistencia específicos.
PCR en tiempo real, piro secuenciación de ADN, espectrometría de
masas (MALDI-TOF), micro arreglos de ADN y Bioinformática, son
ejemplos de las nuevas herramientas desarrolladas.

16. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Métodos moleculares
Estos métodos se desarrollan mediante diferentes estrategias:
A) Hibridación ADN-ADN con sonda de ADN marcada con
fluo-rescencia.
B) Amplificación por PCR de un gen específico.
C) Polimorfismos de fragmentos largos de restricción (RFLP)
D) Secuenciación nucleotídica del ADN.
La meta es el diseño de nuevos y mejores fármacos dirigidos a blancos
previos y otros que inhiban de manera específica el crecimiento
bacteriano.
Datos epidemiológicos para la detección rápida de genes en bacterias
multirresistentes.

17. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Métodos automatizados
Información correcta depende de la metodología de trabajo.
Brindan información cuantitativa o semi cuantitativa (concentraciones
indicadoras) dependiendo de la configuración antibiótica del dispositivo y
organismo (por ejemplo CIM: < de 0.5 ug/ml).
Incluyen los puntos de corte de acuerdo a las normas del CLSI o
EUCAST.
En algunos casos, se incorporan los datos de las cepas salvajes (“wild
type”), necesarios para los puntos de corte epidemiológicos.
Los mas utilizados son:

18. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Métodos automatizados
MicroScan (Siemens). Vitek II (BioMerieux).

19. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Métodos automatizados
Phoenix (Becton Dickinson Diagnostic System).
Estos equipos Manejan información demográfica de los pacientes y
permiten realizar informes epidemiológicos de gran riqueza.

20. Estudio laboratorial de la resistencia a
antibióticos
Métodos automatizados
Estos informes permiten:
A) Control de las infecciones intrahospitalarias.
B) Detección de brotes
C) Mecanismos de resistencias inusuales
D) Agentes patógenos emergentes y unirlos a la vigilancia de la resistencia
a los antibióticos.
Todos los fabricantes utilizan metodologías diferentes para el mismo fin.
Brindan información de la identificación bacteriana en tiempos cercanos
a las 4 horas y de PSA (Prueba de Sensibilidad a antibióticos) entre 6 a
16 horas.