2. • El término “secuencia” designa la
composición de nucleótidos en un
trozo de ADN.
• Ese trozo de ADN puede
corresponder a un gen, un
genoma, o una parte de ellos.
• Secuenciar permite determinar el
tipo y orden de sus nucleótidos.
• Para obtener el genoma basta
secuenciar una sola copia del
ADN.
• En el humano se secuencian
aprox. 3.400 millones de pb.
Imágenes:
http://www.unidaddebiofisica.org/juanma/seminario1/sem1.htm
http://www.genytec.cl/secuenciacion.html
3. • 1976-1977, Allan Maxam y Walter
Gilbert desarrollan un método para
secuenciar ADN basado en la
modificación química del ADN y
posterior escisión en bases
específicas
• 1975, Sanger presenta un método
de secuenciación enzimática
• 1980, Sanger y Gilbert reciben el
premio Nobel de Química.
Imágenes:
http://www.xtimeline.com/evt/view.aspx?id=131758
4. • Se usa P radioactivo para marcar el ADN
• Se fracciona con reacciones específicas para cada base
• 4 alícuotas de la misma muestras se tratan en
condiciones diferentes (DMS (G), ácido fórmico (A+G),
hidrazina (C+T) e hidrazina más sales (C) )
• Tratamiento con piperidina rompe en la base modificada
• Los productos se separan en gel por electroforesis según
su tamaño
6. • El método de secuenciación ideado por Sanger está
basado en el empleo de dideoxinucleótidos
• Cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una
cadena de DNA en crecimiento, esta cadena no puede
continuar elongándose.
• Esto es así ya que la DNA polimerasa necesita un grupo
terminal 3’ OH para añadir el siguiente nucleótido y el
dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo
hidroxilo
7. • Se aísla y se clona el DNA que se desea secuenciar.
• Se emplea una sola hebra para la secuenciación.
• Se utiliza un “primer” que se encarga de suministrar el
terminal 3’OH que necesita la DNA polimerasa para
comenzar a elongar.
• Se preparan cuatro tubos de reacción, cada uno con el
DNA molde de hebra sencilla que se desea secuenciar,
con DNA polimerasa, con el “primer” y con los cuatro
nucleótidos trifosfatados.
8. • A cada tubo se le añade dideoxinucleótido trifosfato;
ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP.
• En cada tubo se producen cadenas de DNA de distintas
longitudes.
• Los productos de las 4 reacciones, son cargados en un
gel y sometidos a electroforesis.
• Así, obtendremos un patrón de bandas en orden, del que
deducir la secuencia del ADN introducido.
Imagen:
http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm
9. Imagénes:
MOLECULAR BIOLOGY IN INFECTIOUS DISEASES. PART I. DEVELOPMENT AND
METHODOLOGIES, ALEJANDRO CORVALÁN R
http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm
10. • Existen algunas modificaciones en
la metodología
• Se pueden usar cebadores
marcados por fluorencencia o
ddNTPs marcados
• Facilitan la detección de los
nucleótidos.
• Permite realizar una sola reacción.
Imagen:
http://universe-review.ca/R11-16-
DNAsequencing.htm
11. • Método de secuenciación de
ADN en tiempo real.
• Basado en la liberación de los
pirofosfatos (PPi) en la
reacción de polimerización
del ADN a partir de sus
dNTPs.
• No requiere correr en un gel
los fragmentos de ADN
generados.
• A medida que la reacción
transcurra, se obtiene una
serie de picos de señal en el
pirograma
Imagen:
https://www-eng.llnl.gov/bio_tech/bio_tech_pyro.html
12. Tres pasos:
• Adición de uno de los 4 dNTPs , si es el complementario
a la base de la hebra molde que toca copiar, será
procesado, liberando un PPi.
• PPi es convertido a ATP al reaccionar con adenosina 5’-
fosfosulfato por medio de la ATP-sulforilasa.
• Emisión de radiación como consecuencia de la oxidación
de la luciferina a oxiluciferina catalizada por la luciferasa
de consumiendo el ATP
13. • La altura de los picks se
correlaciona con la cantidad
de nucleótidos agregados.
• A mayor altura mayor
número de nucleótido
agregados de forma
consecutiva.
Imágenes:
http://www.bdigital.unal.edu.co/8691/1/1186308.2010.pdf
https://www-eng.llnl.gov/bio_tech/bio_tech_pyro.html
14. • Desarrollado por Tabor y Fueller en Harvard.
• Permite secuenciar más de mil nucleotidos
• Este método permitió la caracterización del
Genoma Humano entre 1990 y 2000
• El desarrollo de la
bioinformática es clave en
las metodologías masivas.
Imagen:
http://bioinformatica.uab.es/base/base.asp?sitio=ensayosgenetica&anar=
pgh
15. • El ADN fragmentado se
clona en un Vector.
• Se amplifica y se puede
purificar a partir de las
células bacterianas.
• los fragmentos purificados
se secuencian
completamente
• El ensamblaje se realiza
de manera computacional
en una secuencia larga y
contigua identificando las
secuencias que se
solapan entre sí.
Imagen:
http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm
17. • La secuenciación es la herramienta que permitió
caracterizar el material genético.
• Permite leer ordenar una gran cantidad de información,
contenida en el material biológico.
• Estos grandes avances siguen teniendo limitantes en
cuanto a costos al tiempo de duración del análisis de
datos.
• Esto representa un desafío multidisciplinario desde la
biología y el desarrollo informático.
18. Premio Arconte X:
• 10 millones de dólares al "primer equipo que pueda
construir un dispositivo y utilizarlo para secuenciar 100
genomas humanos en 10 días o menos, con una
exactitud no menor a un error por cada 100.000 bases
secuenciadas, con secuencias que cubran
correctamente al menos el 98% del genoma, y a un
coste no mayor de USD1.000 por genoma."
19. Bibliografía
• Bautista R. , Las tres generaciones de la Secuenciación,
Universidad de Málaga, España, 2010.
• Trelles P., Secuenciación de ADN, universidad de Málaga, España,
2011.
• Martínez F., Secuenciación a gran escala, una carrera sin límite a la
vista, 2009.
Sitios de interés:
https://www-eng.llnl.gov/bio_tech/bio_tech_pyro.html
http://universe-review.ca/R11-16-DNAsequencing.htm
