1. CROMATOGRAFÍA DECROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOSLÍQUIDOS
en columnaen columna

3. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columna
según los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/o
absorción, por baja o alta performance.absorción, por baja o alta performance.
Aparatos:Aparatos:
 materialesmateriales: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas.: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas.
 formas;formas; cuadradas, circulares, cilíndricas y elípticas, la más apropiada es la decuadradas, circulares, cilíndricas y elípticas, la más apropiada es la de
sección circular.sección circular.
 dimensiones :dimensiones : El tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, peroEl tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, pero
debe ser la relación longitud/ diámetro bastante mayor que uno.debe ser la relación longitud/ diámetro bastante mayor que uno.
Le Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columna esLe Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columna es
independiente del diámetroindependiente del diámetro
 funcionamientofuncionamiento ::
AscendenteAscendente
Vertical: con flujoVertical: con flujo DescendenteDescendente
En formaEn forma HorizontalHorizontal
InclinadaInclinada
La aceleración de la gravedadLa aceleración de la gravedad
Por acción de Presión aplicada en la parte de entradaPor acción de Presión aplicada en la parte de entrada
Succión a la salidaSucción a la salida

4. Es importante la forma de rellenado:Es importante la forma de rellenado:
Empaque HúmedoEmpaque Húmedo
SecoSeco
El método “húmedo” asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.El método “húmedo” asegura el equilibrio entre las fases estacionaria y móvil.
Se introduce como una papilla con el eluyente.Se introduce como una papilla con el eluyente.
Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro.Previamente se elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro.
Se elimina el exceso de disolvente.Se elimina el exceso de disolvente.
El método en “seco” colocar un elemento de sustentación del relleno (por ejemplo lana, vidrio);El método en “seco” colocar un elemento de sustentación del relleno (por ejemplo lana, vidrio);
Tomar el tubo con una manoTomar el tubo con una mano
Introducir una pequeña cantidad de materialIntroducir una pequeña cantidad de material
Empujar el material hasta el otro extremoEmpujar el material hasta el otro extremo
Proseguir el rellenado con pequeños incrementosProseguir el rellenado con pequeños incrementos
Cuidar que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmezaCuidar que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmeza
Estabilizar el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro o deEstabilizar el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro o de
lana de vidrio.lana de vidrio.
““anillos de presión”. Este efecto se a que cuando se introduce una gran cantidad de material de unaanillos de presión”. Este efecto se a que cuando se introduce una gran cantidad de material de una
vez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la porciónvez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la porción
inferior.inferior.

5. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columna
según los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/o
absorción, por baja o alta performance.absorción, por baja o alta performance.
Fase estacionariaFase estacionaria ::
Depende del mecanismo de separación:Depende del mecanismo de separación:
ParticiónPartición. se inmoviliza el líquido en un soporte inerte.. se inmoviliza el líquido en un soporte inerte.

Las fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y faseLas fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y fase
reversa.reversa.

ElEl soportesoporte preferentemente debe serpreferentemente debe ser inerteinerte y se utilizan ácidoy se utilizan ácido
silícico, tierras diatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y gomasilícico, tierras diatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y goma
de celulosa.de celulosa.

Como fase fija se usan líquidos de diversos tipos cuyas polaridadesComo fase fija se usan líquidos de diversos tipos cuyas polaridades
varían desde la correspondiente al agua (muy elevada) hastavarían desde la correspondiente al agua (muy elevada) hasta
hidrocarburos parafínicos ( muy bajas)hidrocarburos parafínicos ( muy bajas)
Adsorción,Adsorción,

elel relleno debe ser activorelleno debe ser activo y en general cualquier sólido porosoy en general cualquier sólido poroso
que no sea muy soluble en la fase móvil es apropiado. (alúminasque no sea muy soluble en la fase móvil es apropiado. (alúminas
preparadas por deshidratación del hidróxido, por hidrólisis opreparadas por deshidratación del hidróxido, por hidrólisis o
neutralización de sales). Las ventajas de este material son: granneutralización de sales). Las ventajas de este material son: gran
capacidad, blanca, insoluble y químicamente inerte, barata,capacidad, blanca, insoluble y químicamente inerte, barata,
fácilmente obtenible y muy versátil.fácilmente obtenible y muy versátil.

6. Los rellenos a usar, previamenteLos rellenos a usar, previamente
deben ser sometidos a diversosdeben ser sometidos a diversos
tratamientos:tratamientos:

Activados,Activados,

Desactivados yDesactivados y

EstandarizadosEstandarizados

7. Rellenos de columnasRellenos de columnas
Activación:Activación:
A - Por remoción de sustancias que bloquean los lugares activos de laA - Por remoción de sustancias que bloquean los lugares activos de la
superficie.superficie.
A-1) activación por calentamiento;A-1) activación por calentamiento; tienen por fin el de eliminar el agua presentetienen por fin el de eliminar el agua presente
en forma parcial. Se debe evitar el sobrecalentamiento ya que éste puedeen forma parcial. Se debe evitar el sobrecalentamiento ya que éste puede
tener un efecto contraproducente.tener un efecto contraproducente.
A-2) por lavado con solventes inertesA-2) por lavado con solventes inertes se realiza por lavado con solventese realiza por lavado con solvente
caliente en la misma columna cromatográfica o por proceso “batch”.caliente en la misma columna cromatográfica o por proceso “batch”.
A-3) por uso de reactivos químicosA-3) por uso de reactivos químicos se produce el lavado con ácidos, bases use produce el lavado con ácidos, bases u
oxidantes, lográndose la remoción de las sustancias que bloquean los lugaresoxidantes, lográndose la remoción de las sustancias que bloquean los lugares
activos del material. Esta operación debe llevarse a cabo cuidadosamenteactivos del material. Esta operación debe llevarse a cabo cuidadosamente
ante el riesgo de provocar cambios indeseables en el comportamiento delante el riesgo de provocar cambios indeseables en el comportamiento del
adsorbente.adsorbente.
B - Por mejora del área superficial, la porosidad o grupos funcionales.B - Por mejora del área superficial, la porosidad o grupos funcionales.
se logra por calentamiento.se logra por calentamiento.

8. Desactivación:Desactivación:
Se usaSe usa

para lograr isotermas menos curvadaspara lograr isotermas menos curvadas

para eliminar alguna propiedad no deseadapara eliminar alguna propiedad no deseada
del rellenodel relleno

lograr la inercia total del material cuando selograr la inercia total del material cuando se
requiere que el mecanismo sea de partición.requiere que el mecanismo sea de partición.
Rellenos de columnasRellenos de columnas

9. EstandarizaciónEstandarización

Para lograr reproducibilidad en las medidas que conducen a laPara lograr reproducibilidad en las medidas que conducen a la
identificación y evaluación cuantitativa de los componentes de unaidentificación y evaluación cuantitativa de los componentes de una
muestra, el adsorbente a usar será estandarizado.muestra, el adsorbente a usar será estandarizado.
Se realiza evaluando suSe realiza evaluando su capacidadcapacidad frente a un grupo de sustanciasfrente a un grupo de sustancias
o bien en base a lao bien en base a la selectividadselectividad de pares de sustanciasde pares de sustancias
La capacidad de un adsorbente se puede medirLa capacidad de un adsorbente se puede medir

mediante adsorción en batch: una cantidad pesada de adsorbente semediante adsorción en batch: una cantidad pesada de adsorbente se
coloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La cantidadcoloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La cantidad
adsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de laadsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de la
solución.solución.

Brokmann: la alúmina se activa (deshidrata) por calentamiento yBrokmann: la alúmina se activa (deshidrata) por calentamiento y
posteriormente es desactivada con grados controlados de exposiciónposteriormente es desactivada con grados controlados de exposición
en aire.en aire.

mediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de petróleomediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de petróleo
en una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado deen una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado de
actividad de la alúmina.actividad de la alúmina.
Rellenos de columnasRellenos de columnas

10. para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de agua adsorbida:para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de agua adsorbida:
I. . . . . . 0% de H2OI. . . . . . 0% de H2O
II. . . . . 3% “ “II. . . . . 3% “ “
III. . . . 6% “ “III. . . . 6% “ “
IV. . . . 10% “ “IV. . . . 10% “ “
V. . . . . 15% “ “V. . . . . 15% “ “
Esta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina alEsta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina al
agregar agua: para una actividad deseada se coloca una cantidad conocida de alúmina activadaagregar agua: para una actividad deseada se coloca una cantidad conocida de alúmina activada
a grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y se agita laa grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y se agita la
mezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de separarmezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de separar
mezclas de seis colorantes:mezclas de seis colorantes:
Metoxiazobenceno (A)Metoxiazobenceno (A) Amarillo Sudán (B)Amarillo Sudán (B)
Rojo Sudán (C)Rojo Sudán (C) Aminoazobenceno (D)Aminoazobenceno (D)
Hidroxiazobenceno (E)Hidroxiazobenceno (E) Azobenceno (F)Azobenceno (F)
Definió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos másDefinió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos más
débilmente adsorbidos sean recogidos y separados por la alúmina más activa (Gº I) mientrasdébilmente adsorbidos sean recogidos y separados por la alúmina más activa (Gº I) mientras
que los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividadque los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividad

11. Tamaño de las partículas de Relleno:Tamaño de las partículas de Relleno:
influencia en la calidad de las separacionesinfluencia en la calidad de las separaciones..

adsorbentes de gran granulometría dan cromatogramas borrososadsorbentes de gran granulometría dan cromatogramas borrosos
mientras que los adsorbentes pulverulentos dan mejores resultados. Sinmientras que los adsorbentes pulverulentos dan mejores resultados. Sin
embargo es difícil establecer una prescripción absoluta acerca de cualembargo es difícil establecer una prescripción absoluta acerca de cual
es el mejor tamaño de partícula.es el mejor tamaño de partícula.

Existe una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro deExiste una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro de
la columna. Además se incluye como factor, la facilidad dela columna. Además se incluye como factor, la facilidad de
manipulación y relleno, en general es más fácil empacar columnasmanipulación y relleno, en general es más fácil empacar columnas
homogéneamente con partículas de regular tamaño que con pequeñas.homogéneamente con partículas de regular tamaño que con pequeñas.
Velocidad de adsorción:Velocidad de adsorción:
Al comienzo se produce una adsorción rápida (al menos de veinteAl comienzo se produce una adsorción rápida (al menos de veinte
segundos se adsorben las 2/3 partes),segundos se adsorben las 2/3 partes),
Disminuye luego la velocidad de adsorción requiriéndose unosDisminuye luego la velocidad de adsorción requiriéndose unos
cuantos minutos (20 aproximadamente) para completarse elcuantos minutos (20 aproximadamente) para completarse el
proceso.proceso.
La velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.La velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.

12. Velocidad de flujo de la fase móvil :Velocidad de flujo de la fase móvil :
Al contrario a lo que ocurre en cromatografía de gasesAl contrario a lo que ocurre en cromatografía de gases a mayor velocidada mayor velocidad
de flujo mayor “altura de platode flujo mayor “altura de plato”.”.
Cuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a suCuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a su
valor original (por cambio de la presión) se observa la ruptura en la curva devalor original (por cambio de la presión) se observa la ruptura en la curva de
concentración del efluente, es decir que resulta perjudicial interrumpir unaconcentración del efluente, es decir que resulta perjudicial interrumpir una
experiencia y continuarla después.experiencia y continuarla después.
Uniformidad de la empaquetadura:Uniformidad de la empaquetadura:
Las irregularidades a través de la columna son normalmente grandesLas irregularidades a través de la columna son normalmente grandes
comparadas con la difusión o la falta de agudeza de la banda. Se introducecomparadas con la difusión o la falta de agudeza de la banda. Se introduce
el % de distorsión (longitud del frente/ distancia media que se ha movido elel % de distorsión (longitud del frente/ distancia media que se ha movido el
frente) o bien:frente) o bien:
D% = (D% = (ΔΔL/ LL/ Lii) *100 D% = () *100 D% = (ΔΔV/ Vret)*100V/ Vret)*100
Los mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje fue deLos mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje fue de
aproximadamente cinco.aproximadamente cinco.

13. Cromatografía de líquidos en columnaCromatografía de líquidos en columna
según los mecanismos de partición y/osegún los mecanismos de partición y/o
absorción, por baja o alta performanceabsorción, por baja o alta performance
Fase móvil:Fase móvil:
Solventes:Solventes: son en general más o menosson en general más o menos
inertes hacia el adsorbente o los adsortivos.inertes hacia el adsorbente o los adsortivos.
Se usan como portadores de la mezcla que seSe usan como portadores de la mezcla que se
debe separar.debe separar.
Eluyente:Eluyente: remueve los adsortivos de losremueve los adsortivos de los
adsorbentes.adsorbentes.
Desplazantes:Desplazantes: aquellos eluyentes con fuerzaaquellos eluyentes con fuerza
eluctante altaeluctante alta
Desarrollantes:Desarrollantes: eluyentes con fuerza eluctanteeluyentes con fuerza eluctante
baja.baja.

14. Se pueden evaluar los solventesSe pueden evaluar los solventes
por su poder de elucionpor su poder de elucion
Serie eluotrópicaSerie eluotrópica
1 N pentano 10 Cloroformo
2 Éter de petróleo 11 Dietileter
3 N- hexano 12 Acetato de etilo
4 N- heptano 13 Piridina
5 Ciclohexano 14 Acetona
6 Tetracloruro de carbono 15 n-propanol
7 Tricloroetileno 16 etanol
8 Benceno 17 metanol
9 Dicloroetano 18 aguaAumentodelpodereluotrópicoAumentodelpodereluotrópico

15. Formas de elección de las fasesFormas de elección de las fases
Hidrofílica polar
Lipofílica no polar
Fase móvil
Muestra
Fase
estacionaria
Hidrofílica polar
Lipofílica no polar
Hidrofílica polar
Lipofílica no polar

16. Desarrollo cromatográficosDesarrollo cromatográficos
Anteriormente, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y porAnteriormente, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y por
elución.elución.
Elución Fraccionada:Elución Fraccionada:
Se utilizan distintos disolventes, siendo cada uno más enérgico que el anterior. EsteSe utilizan distintos disolventes, siendo cada uno más enérgico que el anterior. Este
procedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas.procedimiento permite abreviar la elución de las sustancias fuertemente adsorbidas.
Elución gradual:Elución gradual:
Si las isotermas no son lineales, se presentan cromatogramas distorsionados: frenteSi las isotermas no son lineales, se presentan cromatogramas distorsionados: frente
difuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las colasdifuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las colas
mezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico amezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico a
concentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentraciónconcentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentración
a lo largo de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zonaa lo largo de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zona
cromatográfica se encuentre siempre en contacto con una solución eluyente máscromatográfica se encuentre siempre en contacto con una solución eluyente más
enérgica que la parte frontalenérgica que la parte frontal

17. Cromatografía liquida de altaCromatografía liquida de alta
velocidad (CLAP o HPLC)velocidad (CLAP o HPLC)
La dificultad principal que presenta la cromatografía liquidaLa dificultad principal que presenta la cromatografía liquida
tradicional es la lentitud.tradicional es la lentitud.
La cromatografía de gases, presenta el inconveniente de lasLa cromatografía de gases, presenta el inconveniente de las
elevadas temperaturas de trabajo que pueden destruir la muestra, yelevadas temperaturas de trabajo que pueden destruir la muestra, y
limita la posibilidad de elección de las fases fija y móvil.limita la posibilidad de elección de las fases fija y móvil.
Es así que surge la cromatografía liquida de alta velocidadEs así que surge la cromatografía liquida de alta velocidad
(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casos(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casos
con la cromatografía de gases. Para efectuar las separaciones concon la cromatografía de gases. Para efectuar las separaciones con
rapidez, el eluyente se hace pasar a través de la columna arapidez, el eluyente se hace pasar a través de la columna a
velocidades lineales de flujo que puedenvelocidades lineales de flujo que pueden
ser hasta 100 veces la de la cromatografíaser hasta 100 veces la de la cromatografía
tradicional.tradicional.
Es de hacer notar que la eficienciaEs de hacer notar que la eficiencia
(expresada en “ATPE”) es mayor(expresada en “ATPE”) es mayor
cuanto menor sea la velocidadcuanto menor sea la velocidad

18. Cromatografía liquida de altaCromatografía liquida de alta
velocidad (CLAP o HPLC)velocidad (CLAP o HPLC)
Características:
 Selectividad

Reproducibilidad

Sensibilidad

Rapidez
Parámetros:

Naturaleza de la fase estacionaria

Tamaño de partícula

Eluyente (composición y flujo)

Detector
Fase Directa:

fase estacionaria polar

fase móvil de baja polaridad
Fase Reversa:

fase estacionaria de polaridad baja

fase móvil de polaridad alta

19. Los componentes de unLos componentes de un
cromatógrafo de líquidos de altacromatógrafo de líquidos de alta
velocidadvelocidad
deposito
Bomba
Inyect
or
Columna
Detector
Registrador
Colector de
fracciones
Medidor de
flujo

20. cromatógrafo de líquidoscromatógrafo de líquidos
de alta velocidadde alta velocidad

21. Principales mecanismos de interacción
en
cromatografía líquida de alta perfomance
Adsorción superficial
Partición
Intercambio iónico
Exclusión molecular

22. AdsorciónAdsorción
La fase estacionaria es sólida.
La separación se logra por las
diferencias en solubilidad (en fase
móvil) y de retención por adsorción (en
fase estacionaria) de la mezcla de
solutos.

23. las fases estacionarias más comunes son Sílica (90%) y
alúmina (10%) .
Tanto las moléculas de solutos como de disolvente son
atraídas hacia los lugares activos polares de la fase estacionaria.
Unos solutos serán más atraídos que otros por la fase
estacionaria y así se logrará su migración diferencial.
Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder
de elución y la selectividad adecuadas. Normalmente un
disolvente apolar (n-hexano) unido a otro más activo
(acetona, cloruro de metilo, etc.).

24. CROMATOGRAFÍA DE
PARTICIÓN
La separación se basa en el reparto o
distribución de los solutos entre una
fase móvil líquida y otra estacionaria
inmiscible, soportada sobre un sólido
inerte. La discriminación se produce por
diferencias de solubilidad.

25. El mecanismo de actuación es similar al de
un modelo de extracción en contracorriente.
Las especies más retenidas serán las que
presenten mayor afinidad (solubilidad) por la
fase estacionaria que por la fase móvil
(eluyente).
La separación de los solutos se basa en las
diferencias en esta solubilidad relativa.

26. Existen dos modos básicos de operación:

Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar
y fase móvil no polar.

Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no
polar y fase móvil polar.
Inicialmente tuvo más auge la fase normal pero en la
actualidad son más comunes los métodos cromatográficos
en fase reversa dada la naturaleza hidrofílica de las muestras de
mayor interés (clínico, contaminación, alimentos).
Según empleemos fase directa o fase reversa se va a alterar el
orden de elución de bandas y el tiempo de análisis

28. Cromatografía de intercambioCromatografía de intercambio
iónicoiónico
Tanto fase estacionaria como fase
móvil son de naturaleza iónica.
Los iones de la fase estacionaria son
de carga opuesta a los del eluyente.
R–— A+ + B+ 􀀧 R–— B+ + A+
R+— A– + B– 􀀧 R+— B– + A–

29. Separación de aniones inorgánicos por
cromatografía de intercambio iónico.
Los iones a separar son los contaminantes en aguas
1-Fluoruro
2-Cloruro
3-Nitrito
4-Bromuro
5-Nitrato
6-Fosfato
7-Sulfato
Detector UV Detector de conductividad

30. Bombas:Bombas:
La bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidad satisfactoria,La bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidad satisfactoria,
es impulsada por un motor.es impulsada por un motor.
Los detectores usados por lo general son sensibles al flujo, la bomba debe liberar elLos detectores usados por lo general son sensibles al flujo, la bomba debe liberar el
líquido a una velocidad constante, sin pulsaciones. Una forma consiste en introducirlíquido a una velocidad constante, sin pulsaciones. Una forma consiste en introducir
dos cilindros y pistones programados de tal modo que uno se llene rápidamentedos cilindros y pistones programados de tal modo que uno se llene rápidamente
mientras el otro se vacía en forma lenta; después, este último lleva a cabo la funciónmientras el otro se vacía en forma lenta; después, este último lleva a cabo la función
de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.
Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
Mantener el flujo libre de pulsacionesMantener el flujo libre de pulsaciones
Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
Control y reproducibilidad del flujo de solventeControl y reproducibilidad del flujo de solvente
Componentes de la bomba resistentes a la corrosiónComponentes de la bomba resistentes a la corrosión
Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento yLas bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar según su funcionamiento y
diseño en:diseño en:

MecánicasMecánicas

RecíprocantesRecíprocantes

De desplazamiento contínuoDe desplazamiento contínuo

NeumáticasNeumáticas

31. ColumnasColumnas
diámetro interno de 1 a 6 mmdiámetro interno de 1 a 6 mm
longitud de 30 a 100 cm cortas sonlongitud de 30 a 100 cm cortas son
rectas y las mas largas enrolladasrectas y las mas largas enrolladas
(long 600 cm).(long 600 cm).
son de acero inoxidable o deson de acero inoxidable o de
vidrio.vidrio.
operan a temperatura ambiente.operan a temperatura ambiente.
La velocidad de difusión puedeLa velocidad de difusión puede
aumentar de un poco alaumentar de un poco al
incrementar la temperatura, por loincrementar la temperatura, por lo
que se suele usar una camisa deque se suele usar una camisa de
calentamiento, en “CLAP” elcalentamiento, en “CLAP” el
control de la temperatura no es tancontrol de la temperatura no es tan
significativo como en CGsignificativo como en CG

32. Gradiente de elución:Gradiente de elución:
El equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es gradiente deEl equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es gradiente de
elución o programación del disolvente.elución o programación del disolvente.
Produce un cambio en los coeficientes de partición de los componentes y puedeProduce un cambio en los coeficientes de partición de los componentes y puede
conducir a una mejor resolución.conducir a una mejor resolución.
Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:

IsocráticoIsocrático

Gradiente de Elución. proceso mediante el cual se cambia laGradiente de Elución. proceso mediante el cual se cambia la
composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:
A baja presiónA baja presión
A alta presiónA alta presión
Permite obtener la mejor resolución de los componentes de laPermite obtener la mejor resolución de los componentes de la
muestra en el menor tiempo posible.muestra en el menor tiempo posible.

Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente seCuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se
debe tener presente dos objetivos:debe tener presente dos objetivos:
Asegurar alta precisión y exactitud.Asegurar alta precisión y exactitud.
Determinar la composición inicial y final del solvente.Determinar la composición inicial y final del solvente.

Para obtener buenos resultados con el método de gradientePara obtener buenos resultados con el método de gradiente
debemos seguir pasos fundamentales:debemos seguir pasos fundamentales:
a) Ajustar el tiempo del gradientea) Ajustar el tiempo del gradiente
b) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)b) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
c) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resoluciónc) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución
d) Regresar a las condiciones iniciales la columna.d) Regresar a las condiciones iniciales la columna.

33. Sistemas de Inyección de muestraSistemas de Inyección de muestra
Estos sistemas han variados durante la historiaEstos sistemas han variados durante la historia
del sistema de HPLC, en un principio dedel sistema de HPLC, en un principio de
utilizaba la inyección de la muestra con jeringasutilizaba la inyección de la muestra con jeringas
de alta presión las cuales ya están de desuso.de alta presión las cuales ya están de desuso.
Hoy se utiliza el sistema de válvulas inyectoras .Hoy se utiliza el sistema de válvulas inyectoras .

34. Detectores
Deben de tener un volumen interno pequeño para
reducir el ensanchamiento de pico

Basados en una propiedad de la fase móvil (refracción,
densidad etc.)

Basados en una propiedad del soluto (absorbancia en
UV, fluorescencia etc.)
Tipos de detectores

Detector de absorbancia

Detector de fluorescencia

Detector de índice de refracción

Detector de dispersión de luz

Detector electroquímico

Detector por espectroscopia de masas

35. UHPLCUHPLC
Menor tamaño de particula de rellenoMenor tamaño de particula de relleno
Menor tamaño de columnaMenor tamaño de columna
Mayor velocidad de flujoMayor velocidad de flujo
Mayores presionesMayores presiones
Menos tiempo de análisisMenos tiempo de análisis