33 practicas de_microbiologia_clinica

33 prácticas de Microbiología Clínica – www.franrzmn.com – Blog de Laboratorio Clínico y
Biomédico
33 prácticas de Microbiología Clínica
1ª Edición - mayo 2020
Escrito por Francisco Rodríguez Moreno – www.franrzmn.com

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PRÓLOGO
Este ebook tiene como finalidad servir de apoyo al lector, en ningún caso servir como copy and
paste.
Si eres estudiante de Laboratorio Clínico y Biomédico, y tienes que realizar una de las prácticas
presentes en este ebook, te pediré por favor que la utilices como punto de referencia para
mejorarla y superar, por mucho, a mi práctica.
Debes tener presente que mis prácticas son muy escuetas. Mi profesora de microbiología no
quería florituras y nos pedía fundamentos cortos y concisos. Puede parecer algo beneficioso
cuando se es estudiante, pero pasado el tiempo, y una vez que has revisado las prácticas,
entiendes que es una oportunidad perdida de aprendizaje.
Tan solo hay que comparar las prácticas de hematología, o algunas prácticas de bioquímica,
para entender que están más trabajadas que las prácticas de microbiología. Pero ante la
petición expresa de una profesora, so pena del suspenso, no se puede hacer otra cosa.
La primera edición de este ebook está compuesta por las prácticas originales tal cual las tuve
que presentar. Pero en futuras ediciones, me he propuesto mejorar las prácticas ampliando su
fundamento y puliendo los detalles que se puedan mejorar.
Lo que no podré mejorar serán las fotografías. En su día me parecían suficientes, pero a toro
pasado me he dado cuenta de que podría haber realizado muchas más. Me hubieran sido muy
útiles para mejorar estas prácticas y representar fotográficamente muchos de los pasos
intermedios.
La explicación de no realizar más fotografías es simple. El minimalismo que exigía la profesora
llegaba al extremo de no querer fotos, tan solo un dibujo del resultado. Si en mi cabeza, por
entonces, hubiera circulado la idea de realizar un blog y hacer un ebook con las prácticas para
servir de ayuda a futuros Técnicos… hubiera realizado el triple de ellas.

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AGRADECIMIENTO
Quiero dar las gracias a mi mujer, por apoyarme y por hacer un duro trabajo corrigiendo mis
textos, buscando faltas de ortografía, expresiones mejorables, erratas… Sin ella nada de esto
sería posible.

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INDICE
Observación de bacterias en fresco……………………………………………………………. Página 7
Tinción simple de microorganismos…………………………………………………………… Página 10
Tinción de Gram………………………………………………………………………………………… Página 12
Tinción Negativa de Cápsulas…………………………………………………………………….. Página 16
Tinción de esporas mediante Técnica de Wirtz…………………………………………… Página 19
Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen…………………………………………………………… Página 22
Tinción de corpúsculos metacromáticos por método de Loeffler………………… Página 25
Tinción de gram de muestra de cavidad oral………………………………………………. Página 27
Tinción de gram de una muestra faríngea…………………………………………………… Página 29
Siembra de sólido a sólido (placa a tubo) por lengüeta y picadura……………… Página 31
Siembra de sólido a líquido (placa a tubo) por agitación…………………………….. Página 35
Prueba de la Gelatinasa……………………………………………………………………………… Página 37
Prueba de oxidación-fermentación de Hugh-Leifson…………………………………… Página 40
Elaboración de un medio de cultivo……………………………………………………………. Página 42
Prueba de la DNasa…………………………………………………………………………………….. Página 46
Realización de un antibiograma………………………………………………………………….. Página 48
Prueba de la Catalasa………………………………………………………………………………….. Página 52
Prueba de la Coagulasa……………………………………………………………………………….. Página 55
Prueba de la Fermentación Triple………………………………………………………………… Página 57
Prueba de la Ureasa…………………………………………………………………………………….. Página 62
Prueba de la Oxidasa…………………………………………………………………………………… Página 64
Fenilalanina Desaminasa (FAD)……………………………………………………………………. Página 66
Prueba de la Lisina Descarboxilasa………………………………………………………………. Página 70
Prueba de la ONPG………………………………………………………………………………………. Página 73
Pruebas IMVIC: Prueba del Indol………………………………………………………………….. Página 76
Pruebas IMVIC: Prueba del Rojo de Metilo…………………………………………………… Página 78
Pruebas IMVIC: Voges Proskauer………………………………………………………………….. Página 80
Pruebas IMVIC: Prueba del Citrato………………………………………………………………… Página 82
Prueba de Screening……………………………………………………………………………………… Página 84
Determinación cualitativa de anticuerpos febriles………………………………………… Página 86

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Pruebas ASLO……………………………………………………………………………………………… Página 90
Prueba de Reducción de Nitratos………………………………………………………………… Página 92
Realización de un API 20-E…………………………………………………………………………… Página 95

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Título
Observación de bacterias en fresco
Objetivo
Ver e identificar microorganismos observando una preparación en fresco.
Fundamento
La RAE define la bacteria de la siguiente manera:
Del lat. cient. bacteria, y este del gr. βακτηρία baktēría ‘bastón’.
1. f. Microorganismo unicelular sin núcleo diferenciado, algunas de cuyas especies
descomponen la materia orgánica, mientras que otras producen enfermedades. U. t. en pl.
como taxón.
En Wikipedia encontramos una definición más acorde de bacteria:
Las bacterias son microorganismos procariotas que presentan un tamaño de unos pocos
micrómetros (por lo general entre 0,5 y 5 μm de longitud) y diversas formas, incluyendo
filamentos, esferas (cocos), barras (bacilos), sacacorchos (vibrios) y hélices (espirilos).
Para llevar a cabo la observación de bacterias en fresco, se realiza un frotis sobre un
portaobjetos a partir de una muestra de microorganismo procedente de un cultivo. La
finalidad no es otra que la de observar las características del microorganismo mediante su
visualización a través del microscopio óptico.
Nos servimos de las características ópticas del microscopio y de las características de la
extensión. Es importante hacer uso de la luz necesaria para visualizar con éxito la extensión, ya
que, al tratarse de una preparación en fresco, la luz ha de ser escasa.
El frotis, o extensión, se realiza extendiendo la muestra sobre la superficie del portaobjetos,
haciendo uso del asa de platino. La muestra es la mezcla resultante de mezclar una gota de
agua destilada y la impronta del microorganismo problema.

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Material y reactivos
• Placa de Petri, con medio de cultivo, sembrado con microorganismo
• Asa de siembra de platino
• Agua destilada
• Portaobjetos
• Mecheros bunsen conectados a una toma de gas centralizada
• Papel de filtro
• Microscopio óptico
Técnica
1) Con un asa de siembra de platino, esterilizado previamente sobre el mechero bunsen,
obtener la muestra procedente de una placa de petri con medio de cultivo.
2) Utilizando el mismo asa, realizar la extensión sobre el portaobjetos colocando una
impronta de la muestra en él.
3) Esterilizar el asa de platino, de nuevo, en el mechero bunsen.
4) Colocar una gota de agua destilada sobre el portaobjetos.
5) Mezclar la gota y la impronta del microorganismo, realizando la extensión con el asa
de platino.
6) Dejar secar al aire la preparación.
7) Finalmente, observar al microscopio óptico.
Resultado
Imagen obtenida con el objetivo de 10X (100X de resolución)

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Imagen obtenida con el objetivo de 40X (400X de resolución)
No pudimos observar movilidad, pero sí pudimos ver muy bien la morfología de los bacilos.
También la visualización de sus esporas. La muestra estaba contaminada, y es algo que
pudimos comprobar al visualizar levaduras en la extensión.
En preparaciones de otros compañeros pudimos observar cocos. De este modo se puso de
manifiesto la diferencia entre la morfología de un coco y un bacilo.
Observaciones
Como es una extensión en fresco, el diafragma debe estar cerrado y el condensador abajo para
que entre la menor cantidad de luz. De este modo se produce un mayor contraste.
Además, no observamos movilidad alguna porque cometimos un error importante. Secamos la
preparación con calor, y de este modo fijamos la muestra, acabando con la vida del
microorganismo.

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Título
Tinción simple de microorganismos
Objetivo
Realizar con éxito una tinción simple de microorganismos y visualizar éstos al microscopio
óptico
Fundamento
Una tinción simple se fundamenta en la afinidad que va a tener la pared bacteriana por un
colorante.
Es una técnica de decantación en la que se hace uso de los puentes de tinción, en los que se
colocan los portaobjetos con las preparaciones secas y fijadas. La técnica de tinción se realiza
según el protocolo.
Se usa un solo colorante para teñir la pared bacteriana y observar así su morfología y
agrupación. No sirve para visualizar estructuras puesto que rara vez se tiñen.
Los colorantes más utilizados son azul de metileno, fucsina, verde malaquita, violeta de
genciana, cristal violeta, verde janús y rojo fenol.
• Placa de Petri con muestra sembrada sobre un medio de cultivo
• Mecheros Bunsen de gas centralizado
• Papal de filtro
• Portaobjetos
• Agua destilada
• Colorante
• Pipeta Pasteur de plástico
Resultado
Nuestro grupo realizó la tinción de safranina, utilizando dicho colorante. Los microorganismos
se teñían de color rojo.

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En nuestra preparación pudimos observar cocos agrupados, principalmente en tétradas.
También se observaron de forma individual y en forma de diplococo.
Imagen tomada con el objetivo de 40X (Resolución de 400X)
Observaciones
Tuvimos dificultades a la hora de extender una cantidad determinada de microorganismos, en
la cual siempre pecábamos por exceso sobrecargando la extensión. De este modo no
podíamos visualizar el agrupamiento real de los microorganismos, ya que, al haber una alta
carga de ellos en poco espacio, éstos se agrupaban en grandes cantidades.
Debido a estas dificultades tuvimos que extender en varias ocasiones, practicando así la toma
de la cantidad propicia de muestra de microorganismo para realizar una buena extensión.
Probamos también la tinción de azul de metileno y de cristal violeta, pero debido a que no
habían sido filtrados previamente nos encontramos precipitados de colorante en las
extensiones. Estos precipitados nos dificultaron enormemente la visualización y la
identificación bacteriana entre cocos y bacilos.
Por último, debido a la necesidad, utilizamos agua desionizada en lugar de agua destilada.

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Título
Tinción de Gram
Objetivos
• Realizar una tinción de gram sobre una muestra problema.
• Aprender a diferenciar entre microorganismos gram+ y gram-.
Fundamento
La técnica de la tinción de gram fue ideada y desarrollada por Christian Gram en el año 1884.
Para la realización de una tinción de gram se utilizan dos colorantes. Uno de carácter primario,
como es el cristal violeta, y otro de contraste, como la safranina. También se utiliza un
mordiente para la safranina, como es el lugol, y un decolorante como el alcohol/acetona.
Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared, la cual depende de su
composición para que el microorganismo sea considerado gram+ o gram-.
Los microorganismos grampositivos se diferencian de los gramnegativos en que tienen más
mureína, una pared celular monoestratificada y presencia de ácidos teitoicos. Los gram- tienen
menos mureína, una pared celular biestratificada y no tienen ácidos teitoicos.
Esta técnica sirve, junto a la morfología, para clasificar las bacterias como:
• Cocos grampositivos.
• Bacilos grampositivos.
• Cocos gramnegativos.
• Bacilos gramnegativos.
También existen bacterias en forma de espiral, catalogadas dentro de las bacterias
gramnegativas, y bacterias con forma de coma o vibrio que se incluyen dentro de los bacilos
gramnegativos.
La tinción de gram cuenta con limitaciones, ya que no sirve para clasificar bacterias como
mycobacterias y mycoplasmas. Esto es debido a que las mycobacterias están encapsuladas y
los mycoplasmas no poseen pared celular.
Pese a su edad, es una técnica que se sigue utilizando hoy en día en los laboratorios de
diagnóstico clínico. Los laboratorios de microbiología cuentan, incluso, con aparatos de tinción
automática. Tras la realización de un frotis bacteriano a partir de una muestra cultivada, ésta
se introduce en el aparato y se realiza la tinción de gram.

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• Mecheros bunsen con gas centralizado
• Papel de filtro
• Portaobjetos
• Placas de Petri con microorganismos sembrados sobre un medio de cultivo
• Asa de siembra de platino.
• Cubeta con agua.
• Puentes de tinción
• Pipetas Pasteur
• Agua destilada
• Lugol
• Alcohol/Acetona 1:1
• Safranina
• Cristal Violeta
Técnica
1. Preparar un frotis bacteriano.
2. Teñir el frotis de cristal violeta durante 1 minuto.
3. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
4. Cubrir la preparación con lugol durante 1 minuto.
5. Se lava con agua destilada hasta eliminar el exceso de lugol.
6. Lavar con alcohol/acetona la preparación para eliminar el primer colorante.
7. Lavar de nuevo con agua destilada para retirar los restos de alcohol/acetona.
8. Teñir la preparación con safranina durante 1 minuto.
10. Secar la preparación al aire.
11. Observar al microscopio óptico y finalmente identificar los microorganismos como
grampositivos o gramnegativos.

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Resultado
Cocos gramnegativos en racimo observados con el objetivo de 40X (Resolución 400X)
Bacilos grampositivos (estreptobacilos)

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Interpretación de los resultados
Se realizaron varias extensiones con varios microorganismos diferentes que se clasificaron
como gram+ o gram-, distinguiendo, además, su morfología y su agrupamiento.
1 – microorganismo nº1: Bacilo grampositivo en cadenas.
2 – microorganismo nº3: Coco grampositivo en tétradas.
3 – microorganismo nº4: Coco grampositivo en racimos.
4 – microorganismo nº5: Bacilo grampositivo aislado o en parejas.
5 – microorganismo nº6: Bacilo gramnegativo aislado.
6 – microorganismo nº7: Bacilo gramnegativo aislado.
7 – microorganismo nº9: Cocobacilo gramnegativo aislado.
Observaciones
Los grampositivos son muy llamativos a la observación al microscopio. Se ven mucho más
claros que los gramnegativos a la hora de identificarlos.
Las extensiones con los bacilos gramnegativos no salieron demasiado bien, ya que solo
pudimos intuir que no estaban agrupados. Es decir, parecían estar aislados, pero no se podía
afirmar con un 100% de certeza.
Tuvimos acceso a 9 cultivos diferentes de microorganismos. No realizamos la tinción de gram a
los números 2 y 8 porque se trataba de una levadura y una mycobacteria.

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Título
Tinción negativa de cápsulas.
Objetivo
Realizar una tinción negativa de cápsulas para observar, precisamente, las cápsulas de una
levadura.
Fundamento
La tinción negativa de cápsulas es una tinción estructural, ya que pone de manifiesto las
cápsulas y no tiñe los microorganismos. Tiñe el fondo de color negruzco y permite ver los
microorganismos sin colorear sobre dicho fondo. De este modo genera el contraste suficiente
como para permitir su visualización al microscopio.
Para esta tinción se pueden utilizar dos colorantes diferentes: nigrosina o tinta china. En la
práctica se utilizará la primera de ellas.
La nigrosina es un colorante aniónico de color negro que es repelido por las cápsulas, lo que
imposibilita su penetración dentro de los microorganismos. Permite la visualización de
cápsulas bacterianas y fúngicas.
Material y Reactivos
• Placa de Petri sembrada con la levadura sobre el medio de cultivo agar-sangre.
• Portaobjetos.
• Papel de filtro.
• Mechero Bunsen conectado a una toma centralizada de gas.
• Microscopio óptico de campo brillante.
• Nigrosina al 1% previamente reconstituida.
Técnica
1. Tomar una pequeña muestra del microorganismo sembrado en el medio de cultivo
(levadura) y colocarlo en el centro del portaobjetos.
2. Añadir al portaobjetos una gota de nigrosina o de tinta china.
3. Mezclar con el asa de siembra estéril y realizar una extensión.
4. Dejar secar la extensión a temperatura ambiente.
5. Observar la preparación en el microscopio óptico.

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Resultados

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En las preparaciones pudimos apreciar que había demasiada carga de levaduras. Además,
había apariencia de una cápsula compartida entre las levaduras. Esa apariencia es muy
probable que sea debida a la alta carga de la extensión.
En una preparación posterior, con menor carga de microorganismos, pudimos observar
levaduras sueltas. Incluso pudimos apreciar algunas en estado de gemación.
Observaciones
En la primera extensión, correspondiente a la primera imagen, la preparación tenía mucha
muestra. También se echó poco colorante, de ahí la diferencia de contraste entre una imagen
y otra.
En la segunda extensión la gota de nigrosina fue más grande, y la impronta del
microorganismo sobre el portaobjetos más pequeña. De este modo pudimos obtener una
preparación de mayor calidad, en la que pudimos apreciar, incluso, levaduras en estado de
gemación.

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Título
Tinción de esporas mediante técnica de Wirtz.
Objetivo
Visualizar las formas de resistencia de los microorganismos, haciendo uso de la tinción de
esporas mediante técnica de Wirtz.
Fundamento
Debido a la composición de las esporas, éstas se tiñen con algunos colorantes. Las esporas, ya
sean exosporas o endosporas, son una forma de resistencia de los microorganismos. Los
géneros Clostridium y Bacillus son los más destacados entre las bacterias que producen estas
formas de resistencia.
Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables, formándose una espora
por cada forma vegetativa bacteriana. Una vez finalizado el proceso de esporogénesis, la
bacteria se lisa liberando la espora al exterior. Cuando las condiciones ambientales vuelven a
ser favorables, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de
germinación que posee la espora perdura durante años.
No son fáciles de teñir debido a sus múltiples cubiertas impermeables, motivo por el que la
coloración se fuerza con calor y poniendo papel de filtro con colorante. Se utiliza safranina
como contraste para poder visualizar mejor el microorganismo y sus esporas.
Material
• Cubeta.
• Trípode.
• Barras de tinción.
• Mechero Bunsen.
• Pinzas metálicas.
• Pinzas de madera.
• Portaobjetos.
• Asa de siembra.
• Microscopio óptico.
• Placa de petri sembrada con microorganismo en agar sangre.
• Matraz aforado de 100 ml.

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Reactivos
• Agua destilada.
• Safranina.
• Verde malaquita al 0.25% en solución hidroalcohólica. Es decir, 0.25 gramos de
malaquita disueltos en 10 ml de etanol de 96º, y enrasado hasta 100 ml en un matra
con agua destilada.
Técnica
1. Preparar el frotis bacteriano que se va a teñir.
2. Colocar un trozo de papel de filtro, del tamaño de la extensión, encima de ella.
3. Añadir el colorante verde malaquita para que cubra bien la extensión.
4. Pasar la preparación por encima de la llama del mechero bunssen para fijar el
colorante, durante cinco minutos.
5. Retirar el papel de filtro y lavar con agua destilada para eliminar el exceso de
colorante.
6. Teñir la preparación con safranina, para el contraste, durante un minuto.
8. Secar la preparación al aire, o entre dos papeles de filtro, teniendo especial cuidado en
el segundo caso para no arrastrar la extensión.
9. Observar al microscopio óptico y anotar los resultados.
Resultados
Utilizamos un microorganismo adecuado para esta práctica, un bacilo del género Bacillus que
nos permitiese ver esporas.
Al microscopio pudimos observar tanto endosporas como exosporas. También pudimos
apreciar bien los microorganismos gracias al colorante de contraste. El dibujo es una

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representación gráfica de un campo cualquiera del microscopio, donde se aprecian los bacilos,
teñidos de color rosado debido a la safranina, y sus esporas, teñidas de color azul oscuro o
verde azulado debido al verde malaquita.
Observaciones
Un minuto de safranina resultó insuficiente y no se producía el contraste buscado.
Aumentamos el tiempo de tinción a tres minutos con mejores resultados.
Por necesidad utilizamos agua desionizada en lugar de agua destilada.

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Título
Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.
Objetivo
Diferenciar las bacterias ácido-alcohol resistentes (AAR) de las que no lo son. Usando, para
ello, la tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.
Fundamento
Debido a la composición de la «pared» bacteriana no es fácil teñir diversos microorganismos
como el Mycobacterium. Por tanto, hay que forzarlo con calor.
Además, al tratarse de una tinción diferencial, es necesario el uso de más de un colorante para
poner de manifiesto la afinidad por ciertos colorantes de determinados microorganismos o
estructuras de estos. Esta afinidad puede definirse como la «fuerza» con la que queda retenido
el colorante, que no se elimina con ácido-alcohol.
Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen
Es una tinción diferencial ideada por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo, y
Friedrich Neelsen, un patólogo. Su finalidad es la de identificar mycobacterias (fuertemente
ácido-alcohol resistentes), nocardias (débilmente AAR), actinomices (débilmente AAR) o
parásitos como cryptosporidium.
Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinción de Gram, la
técnica más común en la microbiología actual. Sin embargo, pueden ser teñidas con algunas
tinciones combinadas con calor, como la de Ziehl-Neelsen. Una vez teñidas tienen la capacidad
de resistir la decoloración de una combinación de alcohol/ácido, el decolorante más común en
los protocolos de tinción de bacterias.
En la práctica realizamos la tinción tradicional, aunque existen dos variantes más. Una de ellas
es la denominada variante en frío o Tinción de Kinyoun. Y la otra es la variante histológica
destinada a la búsqueda e identificación de microorganismos AAR en tejidos.
• Cepa de Mycobacterium flei (o phlei), no patógena, sembrada en agar sangre sobre
una placa de petri.
• Carbofucsina.

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• Alcohol/ácido (3 ml de HCl 0.36N en 100 ml de etanol de 96º).
• Azul de metileno al 0.3%
• Agua destilada.
• Portaobjetos.
• Mechero Bunsen.
• Cubeta.
• Barras de tinción.
• Pipetas pasteur de plástico.
• Microscopio óptico.
Técnica
1. Realizar un frotis bacteriano de la cepa de Mycobacterium phlei y fijar la extensión con
calor.
2. Añadir el primer colorante: Carbofucsina.
3. Se pasa por el mechero varias veces, durante cinco minutos, sin permitir que hierva el
colorante.
4. Decantar y lavar con agua destilada el exceso de colorante.
5. Decolorar con alcohol/ácido hasta que la muestra tenga un color rosado.
6. Lavar con agua destilada.
7. Teñir con el colorante azul de metileno durante un minuto.
8. Lavar con agua destilada hasta retirar el exceso de colorante.
9. Secar la extensión al aire.
10. Observar al microscopio óptico y anotar los resultados.
Resultados
En la teoría si el microorganismo aparece de color rosa es AAR+ o ácido alcohol resistente
positivo. En cambio, si el microorganismo aparece de color azul, en el microscopio óptico, es
AAR- o ácido alcohol resistente negativo.
No tengo fotos ni dibujos, porque no conseguimos visualizar la mycobacteria. Ésta debería
haber aparecido de color rosa, indicando su positividad frente al alcohol resistencia.
Observaciones
La mayoría de los grupos obtuvieron el mismo resultado que el nuestro. La mycobacteria no
aparecía por ninguna parte. Incluso se realizaron tinciones obteniendo el microorganismo del
tubo original (comercial) sobre el que estaba sembrado. Con idéntico resultado.
Un par de grupos sí que consiguieron visualizar débilmente el microorganismo, en muy poca
cantidad. Comparamos las técnicas, por si había habido alguna variación, pero todas eran
idénticas. Meses después nos ocurrió lo mismo con otro microorganismo (una levadura), que
literalmente desapareció del frasco comercial y nos impidió visualizarla en otra técnica.
Curiosamente, esa misma levadura, meses antes, no nos dio ningún problema en la tinción
negativa de cápsulas.

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Se trataba de microorganismos comerciales modificados genéticamente para no representar
un riesgo patológico. Solamente pudimos divagar sobre si esa modificación genética tuvo algo
que ver en el resultado o si en realidad nuestro desempeño en la técnica no fue el adecuado.
Personalmente, tampoco se me ocurrió sugerir la «resiembra» del microorganismo en algún
medio adecuado para comprobar la existencia o no, mediante el crecimiento, del
microorganismo. Tampoco volvimos a utilizar este microorganismo en prácticas posteriores
que nos hubiesen dado alguna pista sobre lo sucedido.

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Antes de proceder con la práctica conviene comentar algunas cosas. El método de tinción para
corpúsculos metacromáticos también puede recibir el nombre de Löffler. El colorante
(preparado a partir de azul de metileno) puede venir identificado de ambas formas.
La práctica fue un poco «fracaso» debido a que buscábamos lactobacilos para visualizar sus
corpúsculos metacromáticos. Y para ello nada mejor que usar como muestra un yogur. El
problema vino cuando, entre las bacterias fermentadoras del yogur seleccionado, no
encontramos más que cocos, diplococos y estreptococos. Por este motivo no realicé
fotografías, ya que no había nada que ver.
La práctica, desgraciadamente, no se repitió y se dio por hecha. Pero nos quedó el
fundamento, la técnica y el aprendizaje de cómo no hacer esta práctica. La opción sensata
hubiera sido llevar un yogur de alguna marca como Danone, que declara abiertamente el uso
de lactobacilos en sus yogures (lactobacillus bulgaricus).
Título
Tinción de corpúsculos metacromáticos por método de Loeffler.
Objetivo
Teñir los corpúsculos metacromáticos de los microorganismos presentes en una muestra.
Fundamento
Los corpúsculos metacromáticos son gránulos de reserva, normalmente fosfatos, que se
encuentran en determinadas bacterias. Suelen ser de gran tamaño. Se tiñen de manera
determinada, debido a su composición química, en presencia de colorantes.
Tinción de corpúsculos metacromáticos con azul de metileno Loeffler
Estos corpúsculos se tiñen con azul de metileno Loeffler o azul de Loeffler. Este colorante es un
derivado preparado a partir de azul de metileno. A él se añaden otros ingredientes como agua
destilada, alcohol y una disolución de potasa (KOH).
Uno de los microorganismos que poseen estos gránulos es el Corynebacterium Diphteriae,
agente causal de la Difteria. El descubridor de esta bacteria, precisamente, fue Friedrich
Loeffler.

Biomédico
• Azul de metileno de Loeffler
• Agua destilada
• Yogur marca Hacendado
• Portaobjetos
• Mechero Bunsen
• Papel de filtro
• Cubeta
• Puentes de tinción
• Microscopio óptico de campo brillante
Técnica
• Realizar una extensión sobre el portaobjetos con la muestra de yogur y el asa de
siembra de platino.
• Fijar la preparación con calor ayudándonos del mechero Bunsen.
• Teñir con azul de metileno de Loeffler durante cinco minutos haciendo uso de los
puentes de tinción y de la técnica de decantación.
• Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
• Dejar secar la preparación al aire.
• Observar la preparación haciendo uso del microscopio óptico.
Resultados
No pudimos observar ningún corpúsculo metacromático ya que no encontramos ningún bacilo.
Tan solo observamos cocos, diplococos y estreptococos.
Observaciones
No se han observado lactobacillus, pero sí numerosos estreptococos en el yogur de la marca
Hacendado. Estos estreptococos suelen ser Streptococcus Thermophilus.

Biomédico
Título
Tinción de gram de una muestra extraída de la cavidad oral.
Objetivo
Visualizar microorganismos presentes en una muestra procedente de la cavidad oral de un
paciente.
Fundamento
Para realizar una tinción de gram se utilizan dos colorantes. Uno de carácter primario (cristal
violeta,) y otro de contraste (safranina). También se utiliza un mordiente para la safranina
(lugol) y un decolorante (alcohol/acetona).
Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared. Ésta depende de su
composición para que el microorganismo sea considerado grampositivo o gramnegativo. Los
microorganismos grampositivos se diferencian de los gramnegativos en que tienen más
cantidad de mureína, una pared celular monoestratificada y ácidos teitoicos. Los
gramnegativos tienen menos cantidad de mureína, una pared celular biestratificada y carecen
de ácidos teitoicos.
El resultado de la tinción, junto a la morfología bacteriana, sirven para clasificar las bacterias
como:
• Cocos grampositivos
• Bacilos grampositivos
• Cocos gramnegativos
• Bacilos gramnegativos
gramnegativos.
Muestras de la cavidad oral o bucal
Las muestras extraídas de la cavidad oral, o cavidad bucal, se obtienen porque puede haber
presencia de microorganismos del aparato respiratorio. La tinción de gram sobre este tipo de
muestra se emplea, fundamentalmente, para la búsqueda de la Angina de Vincent.

Biomédico
• Hisopo
• Pipetas pasteur
• Papel de filtro
• Microscopio óptico de campo brillante
• Portaobjetos
• Mechero Bunsen
• Agua destilada
• Alcohol/acetona 1:1
• Cristal violeta
• Lugol
• Safranina
Técnica
• Enjuagar con agua la cavidad oral del paciente.
• Tomar una muestra, con un hisopo, de la cara interna de la mejilla.
• Hacer una extensión sobre un portaobjetos.
• Realizar una tinción de gram a la extensión (técnica y todo lo relacionado con ella si se
hace clic en el enlace).
• Observar al microscopio óptico e identificar las bacterias presentes en la muestra.
Resultados
Se observaron cocos grampositivos apelotonados, pero no agrupados. También se observaron
fusobacterias gramnegativas.
Observaciones
A la hora de obtener la muestra hay que tener especial cuidado de no impregnar el hisopo con
la saliva del paciente. Para realizar la extensión sobre el portaobjetos, no fue necesario el uso
de agua destilada.

Biomédico
Título
Tinción de gram de una muestra faríngea.
Objetivo
Observar e identificar los microorganismos procedentes de una muestra faríngea.
Fundamento
Para realizar una tinción de gram se utilizan dos colorantes. Uno de carácter primario (cristal
violeta,) y otro de contraste (safranina). También se utiliza un mordiente para la safranina
(lugol) y un decolorante (alcohol/acetona).
Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared. Ésta depende de su
composición para que el microorganismo sea considerado grampositivo o gramnegativo. Los
microorganismos grampositivos se diferencian de los gramnegativos en que tienen más
cantidad de mureína, una pared celular monoestratificada y ácidos teitoicos. Los
gramnegativos tienen menos cantidad de mureína, una pared celular biestratificada y carecen
de ácidos teitoicos.
El resultado de la tinción, junto a la morfología bacteriana, sirven para clasificar las bacterias
como:
• Cocos grampositivos
• Bacilos grampositivos
• Cocos gramnegativos
• Bacilos gramnegativos
gramnegativos.
Tinción de gram de una muestra faríngea
En los exudados faríngeos se suelen buscar microorganismos como el Streptococcus Pyogenes,
que es un estreptococo betahemolítico del grupo A. También se suele buscar Corynebacterium
Diphteriae, agente causal de la Difteria.
Si estamos buscando el bacilo de Klebs-Löffler la muestra del hisopo debe tener membrana,
que es una característica propia de la Difteria.

Biomédico
• Hisopo
• Portaobjetos
• Mechero Bunsen
• Cubeta
• Papel de filtro
• Puente de tinción
• Agua destilada
• Pipetas pasteur
• Cristal violeta
• Lugol
• Ácido/acetona 1:1
• Safranina
• Depresor lingual
Técnica
1. Obtener una muestra, con un hisopo, de una amígdala.
2. Realizar una extensión con la muestra.
3. Realizar una tinción de gram de la extensión.
4. Observar e identificar los microorganismos al microscopio óptico.
Resultados e interpretación
Se observaron cocos grampositivos, tanto aislados como apelotonados, pero no agrupados.
También se visualizaron diplococos gramnegativos, probablemente del género Neisseria.
Observaciones
A la hora de tomar la muestra, la lengua debe deprimirse haciendo uso de un depresor lingual.
De este modo facilitaremos la maniobra con el hisopo.
Debe evitarse el contacto con la mucosa oral, para evitar contaminación de la muestra. Y
además, hay que tener especial cuidado de no tocar la lengua y la úvula. Así evitaremos el acto
reflejo y la provocación de la arcada.

Biomédico
Título
Siembra de sólido a sólido (placa a tubo) por lengüeta y picadura.
Objetivo
Aprender a realizar una siembra en tubo, de sólido a sólido, procedente de una placa
previamente sembrada. Las técnicas utilizadas para ello serán por lengüeta y por picadura.
Fundamento
La finalidad de estas técnicas es la de resembrar un microorganismo en un tubo. Dicho
microorganismo debe proceder de una placa de petri, con un medio de cultivo, previamente
sembrada. También puede ser útil para aislar un microorganismo concreto y sembrarlo en un
medio específico que favorezca su identificación por métodos bioquímicos.
Siembra de sólido a sólido (placa a tubo) por lengüeta y picadura
Se toma, con un asa de siembra de platino, una muestra de un microorganismo procedente de
un cultivo sólido (placa). Se siembra en otro medio sólido que difiere del anterior (tubo). La
siembra en este nuevo medio se realiza por lengüeta o slamp, zigzagueando por la superficie
inclinada del medio sólido que se encuentra en el tubo.
La técnica de picadura es aún más sencilla, pero requiere del uso de un hilo de siembra de
platino. La muestra del microorganismo, procedente de la placa, se transfiere al tubo
atravesando su medio de cultivo hasta alcanzar el fondo del tubo.
• Microorganismo problema
• Hilo de siembra de platino
• Mechero Bunsen
• Papel de filtro
• Tubo con medio de cultivo sólido (TSI)
• Tapón metálico
• Gradilla
• Estufa

Biomédico
Técnica
1. Coger un inóculo de un microorganismo con un hilo de siembra previamente
esterilizado en el mechero bunsen.
2. Realizar la siembra por picadura introduciendo el hilo de siembra en el medio hasta el
fondo del tubo.
3. Coger un inóculo con un asa de siembra estéril.
4. Realizar una siembra por lengüeta en el mismo medio, zigzagueando con el asa desde
el fondo del tubo hacia adelante.
5. Tapar el tubo con el tapón metálico e incubar en la estufa a 37ºC.
6. Una vez incubado se observa y se valora el resultado al día siguiente.
Siembra por lengüeta en tubo

Biomédico
Siembra por picadura en tubo
Medio TSI de otra práctica diferente sembrado por lengüeta y picadura

Biomédico
El resultado fue un cambio de color en el medio de cultivo del tubo. Éste pasó de amarillo a
rojizo, debido a que el medio de cultivo posee algún nutriente necesario para el metabolismo
del microorganismo.
La imagen del medio de cultivo (TSI) fragmentado y con crecimiento de un microorganismo,
corresponde a otra práctica.
Observaciones
Al tratarse de una técnica compuesta de doble siembra, hay que extremar las precauciones
para evitar que el tubo se contamine. Además de hacer la siembra por partida doble, se
utilizan dos herramientas diferentes que se deben esterilizar convenientemente.
Cuando se utilice el asa de siembra habrá que esterilizarlo previamente a la preparación del
inóculo. Lo mismo ocurre con el hilo de siembra. En ambos casos hay que tener una
precaución añadida, y es dejar que se enfríen después de haber pasado por la llama del
mechero bunsen. Si la temperatura del asa, o del hilo, es muy alta, eliminaremos los
microorganismos del inóculo y no crecerá nada.

Biomédico
Título
Siembra de sólido a líquido (placa a tubo) por agitación.
Objetivo
Aprender a realizar una siembra de sólido a líquido (placa a tubo) haciendo uso de la técnica
de agitación.
Fundamento
La siembra en un medio líquido puede realizarse de varias formas. Puede utilizarse asa de
siembra de platino, hilo de siembra de platino, hisopo e incluso una pipeta. La finalidad es la
misma en todos los casos, ya que se trata de transferir un microorganismo problema de un
medio de cultivo (sólido) a otro medio de cultivo (líquido). De este modo procedemos a una
resiembra y se pueden aprovechar las características del medio líquido para hacer una
determinación bioquímica.
Siembra de sólido a líquido (placa a tubo) por agitación
Si se realiza con asa/hilo de siembra, ésta se carga en condiciones de esterilidad y se adiciona
al medio líquido agitando. Con el hisopo se procede de la misma forma que con el asa/hilo de
siembra de platino. Si se hace uso de una pipeta, se toma un volumen de la muestra y se
adiciona al medio líquido como paso previo a su agitación.
• Mechero Bunsen
• Papel de filtro
• Tubo con medio de cultivo líquido (Clark y Lubs)
• Tapón metálico
• Gradilla
• Estufa
Técnica
1. Esterilizar el hilo de siembra de platino haciendo uso del mechero bunsen.
2. Coger el inóculo con el hilo de siembra estéril.
3. Introducir en el medio líquido dentro del tubo y agitar.

Biomédico
4. Tapar el tubo con el tapón metálico.
5. Introducir en la estufa para su cultivo a 37ºC.
6. Una vez incubado, se observa y se valora el resultado al día siguiente.
Técnica de agitación de un hilo de siembra de platino
El medio de cultivo era de color amarillo, y tras la incubación se tornó blanquecino. Esto fue
debido al crecimiento del microorganismo.
Observaciones
A la hora de esterilizar la boquilla del tubo en la llama del mechero, hay que tener cuidado de
no derramar el caldo de cultivo. Hay que tener en cuenta que las prácticas anteriores hacen
uso de medios sólidos, donde se podía esterilizar la boquilla del tubo sin miedo a derramar el
medio de cultivo.

Biomédico
Título
Prueba de la gelatinasa.
Objetivo
Comprobar la capacidad del microorganismo para metabolizar la gelatina.
Fundamento
Es una prueba enzimática y del metabolismo de las proteínas.
Prueba de la gelatinasa
Se pone en contacto el microorganismo problema con un medio de cultivo (gelatina). Si el
microorganismo posee la enzima proteolítica gelatinasa, al cultivarlo en el medio, la gelatina se
desnaturaliza.
Se observa fácilmente si la gelatina pierde su estructura inicial (semisólida), convirtiéndose en
líquida cuando disminuye la temperatura a 6ºC aproximadamente.
• Medio de cultivo (gelatina). 12,8 gramos de gelatina en 100 ml de agua destilada
• Estufa de incubación
• Mechero Bunsen
• Papel de filtro
Técnica
1. Preparar el medio de cultivo.
2. Llenar dos tubos con gelatina nutritiva estéril.
3. Sembrar el primer tubo con el microorganismo problema haciendo uso de la siembra
por picadura.
4. El segundo tubo dejarlo tal cual, sin sembrar, haciendo las veces de tubo control.
5. Incubar de 1 a 14 días a 20-25ºC.
6. Observar y anotar el resultado.

Biomédico
Se interpreta como gelatinasa negativo cuando no hay hidrólisis. Esto supone que a baja
temperatura el medio de cultivo esté totalmente sólido.
Gelatinasa positivo cuando se incuba a temperatura ambiente o a baja temperatura y se
empieza a observar ensanchamiento en la zona de la picadura. Hay hidrólisis y el medio de
cultivo se convierte en líquido.
Gelatinasa positivo

Biomédico
Gelatinasa positivo
Observaciones
El tubo control contenía la gelatina en estado sólido, por lo que la práctica es válida. Si la
gelatina del tubo control hubiese estado líquida la prueba sería considerada inválida.
En caso de invalidez, habría que sospechar una posible contaminación por microorganismos
gelatinasa positivo. O una mala realización del medio de cultivo.
Para descartar que el problema sea el medio de cultivo, es conveniente realizar más de un
medio de cultivo y dividirlo entre varios grupos.

Biomédico
Título
Prueba de oxidación-fermentación de Hugh Leifson.
Objetivo
Saber si el microorganismo problema tiene un metabolismo oxidativo o fermentativo frente a
un determinado hidrato de carbono.
Fundamento
Esta prueba se realiza en dos tubos que llevan un medio semisólido y azul de bromotimol
como indicador. Se añade glucosa al medio de cultivo y se comprueba si el microorganismo
problema la oxida o la fermenta.
Prueba de oxidación-fermentación de Hugh Leifson
Si el pH del medio es inferior a 7 (ácido) se manifiesta con color amarillo. Con un pH superior a
7 (básico) se manifiesta con un azul verdoso. Y finalmente, con un pH similar a 7 (neutro) el
medio adquiere un color verde.
• Medio de Hugh Leifson (9.8 gramos por cada litro de agua destilada) y una
concentración final de glucosa del 1%
• Hilo de siembra
• Vaselina o parafina
• Mechero Bunsen
• Papel de filtro
Técnica
1. Preparar dos tubos con el medio de cultivo Hugh Leifson y con glucosa como hidrato
de carbono.
2. A uno de los tubos se le añade una capa de vaselina o parafina para provocar, si la
hubiere, la fermentación en ausencia de O2.
3. Sembrar el microorganismo en el medio de cultivo haciendo uso del hilo de siembra.
4. Incubar los tubos a 37ºC durante 24 horas.
5. Visualizar y anotar el resultado.

Biomédico
Si el microorganismo problema oxida o fermenta la glucosa el medio se tornará de un color
amarillo. El medio adquirirá un pH ácido debido a la actividad propia del microorganismo.
El tubo con presencia de oxígeno (sin capa de vaselina) adquirió color verde. Y el tubo sin
presencia de oxígeno (con capa de vaselina) adquirió color amarillo.
Por tanto, el microorganismo problema fermenta la glucosa, pero no la oxida.
Observaciones
Se realizaron, por cada grupo, dos tubos control con el medio y las condiciones de la práctica.
La finalidad fue garantizar la validez de todos los resultados.

Biomédico
Título
Elaboración de un medio de cultivo.
Objetivo
Preparar un medio de cultivo compuesto por agar DNasa.
Fundamento
El agar DNasa es un medio de cultivo que se utiliza para detectar la actividad enzimática de la
desoxirribonucleasa en un microorganismo problema. Este medio resulta ideal para la
discriminación entre el Staphylococcus Aureus y el Staphylococcus Epidermidis.
Esta discriminación se lleva a cabo sembrando el microorganismo problema y comprobando la
actividad DNasa tras poner en contacto el medio, junto con el microorganismo previamente
incubado, con HCl.
Elaboración de un medio de cultivo de agar DNasa
En la actualidad se compran los medios ya elaborados en sus respectivas placas. Los
fabricantes suelen ofertar mucha variedad, tanto en medios como en cantidades, lo cual
facilita mucho la vida al laboratorio siempre que haya presupuesto.
Saber elaborar nuestros propios medios nos garantiza poder continuar con el trabajo del
laboratorio ante una rotura de stock del fabricante o una falta puntual de presupuesto. Pero
para ello necesitamos tener los medios adecuados, lo cual también supone un desembolso
económico.

Biomédico
• Medio de cultivo ADNasa en polvo
• Agua destilada
• Probeta
• Mechero bunsen
• Trípode
• Cuchara/espátula
• Placas de petri estériles
• Vaso de precipitado
• Varilla de vidrio
• Balanza analítica que discrimina decigramos
• Autoclave
Técnica
1. Tarar el vaso de precipitado en la balanza.
2. Pesar 42 gramos de polvo de agar DNasa en el propio vaso de precipitado
3. Disolver/suspender los 42 gramos en 1 litro de agua destilada previamente medido en
una probeta o en un matraz. Dentro del propio vaso de precipitado.
4. Calentar y agitar con la varilla de vidrio hasta ebullición y hervir durante un minuto.
5. Esterilizar en la autoclave.
6. Dejar enfriar a 45ºC y distribuir el medio en placas de petri estériles.
Resultados
Se prepararon 300 ml de agar DNasa, por lo que procedimos a disolver 12.6 gramos de polvo
del medio de cultivo en 300 ml de agua destilada. Una vez realizados los cálculos y conocidos
estos datos procedimos con la técnica.

Biomédico
Medio de cultivo de agar DNasa
Composición del agar DNasa

Biomédico
Observaciones
Según las instrucciones del envase, si se desea, se pueden añadir 10 gramos de manitol y 0.025
gramos de azul de bromotimol por cada litro del medio.

Biomédico
Título
Prueba de la DNasa.
Objetivo
Comprobar si un microorganismo problema tiene actividad desoxirribonucleasa.
Fundamento
Es una prueba enzimática que se emplea para diferenciar distintas especies de Staphylococcus
Aureus, que normalmente produce desoxirribonucleasa, de otros Staphylococcus.
Prueba de la DNasa
Al poner en contacto un microorganismo con un medio que lleva ADN, si es DNasa positiva
despolimerizará el ADN cambiando la estructura del medio. En cambio, si es DNasa negativa,
no lo hará.
Si el método no se observa a simple vista, se debe revelar con HCl 1N. Si el microorganismo
produce desoxirribonucleasa, se apreciará un cambio en el agar.
• HCl 1N
• Pipeta pasteur
• Placa de petri con agar DNasa
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Estufa de cultivo

Biomédico
Técnica
1. Sembrar el microorganismo problema en el centro de la placa de petri, sobre el medio
de cultivo, en forma de rejilla apretada.
2. Incubar a 35-37ºC de 18 a 20 horas.
3. Sacar la placa de la estufa y añadir unas gotas de HCL 1N sobre la zona que está
sembrada.
4. Dejar reposar de 3 a 5 minutos.
Resultado e interpretación
Representación gráfica de la siembra en rejilla
Si sale un halo claro alrededor del crecimiento bacteriano el resultado es positivo. Si no se
observa ninguna zona clara es negativo.
En el caso de nuestro grupo de prácticas, el resultado fue completamente negativo. El
estafilococo que teníamos en clase no era del género Aureus por razones evidentes (pese a
que se venden modificados genéticamente para no ser patógenos). Por tanto, no tenía
actividad desoxirribonucleasa.

Biomédico
Título
Realización de un antibiograma.
Objetivo
Comprobar la sensibilidad, y la resistencia, a diversos antibióticos de un microorganismo
problema.
Fundamento
Esta prueba se realiza para comprobar la sensibilidad de un microorganismo problema frente a
la acción de los antibióticos a los que se somete. Para ello se siembra el microorganismo en
cuestión en un medio de Müller-Hinton. E inmediatamente después se sitúan sobre el medio
unos discos con antibióticos.
Realización de un antibiograma
Si el antibiótico es efectivo evitará el crecimiento bacteriano y se propagará por el medio de
cultivo por difusión. Si el halo de inhibición es grande se dice que el microorganismo es
sensible frente al antibiótico. Y si el halo es de mediano tamaño se dice que su sensibilidad es
intermedia.
Finalmente, si el halo es inexistente o muy pequeño, con proliferación bacteriana alrededor
del disco de antibiótico, se dice que el microorganismo es resistente. Aunque esto no es del
todo exacto.
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Pinzas metálicas
• Placa de petri con Agar Müller-Hinton
• Discos de antibiótico
o Norfloxacino 5 µg
o Furanés 300 µg
o Eritromicina 15 UI
o Gentamicina 10 µg
o Amoxicilina 30 µg

Biomédico
Técnica
1. Coger un inóculo del microorganismo problema con el asa de siembra de platino.
2. Sembrar el microorganismo problema en el medio de Müller-Hinton.
3. Colocar los discos de antibiótico sobre el medio de cultivo haciendo uso de las pinzas
metálicas, pero dejando suficiente separación entre ellos.
4. Incubar a 37ºC durante el tiempo necesario para el crecimiento del microorganismo
que estemos utilizando.
Discos de antibiótico utilizados en la práctica

Biomédico
Medio de cultivo sembrado y con los discos de antibiótico colocados
Resultado del antibiograma

Biomédico
Visualizando el resultado del antibiograma
El microorganismo problema es sensible a Gentamicina y Norfloxacino. Por contra, es
resistente a Furanés, Amoxicilina y Eritromicina.
Observaciones
Los resultados no son muy fiables porque los discos de antibiótico estaban caducados desde
hace años. También resulta curioso que, pese a la caducidad, tanto el Norfloxacino como la
Gentamicina hayan funcionado tan bien inhibiendo el crecimiento del microorganismo.
Finalmente, para visualizar correctamente un antibiograma es mejor recurrir a un fondo
oscuro. De este modo se podrá ver con más detalle tanto los halos de inhibición como las
zonas donde sí ha crecido el microorganismo.

Biomédico
Título
Prueba de la catalasa.
Objetivo
Comprobar si un microorganismo problema posee la enzima catalasa.
Fundamento
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y
anaerobios facultativos. Se encuentra normalmente junto a la cromoxidasa y es la responsable
del desdoble del H2O2.
El agua oxigenada es uno de los productos de la degradación de los hidratos de carbono y es
tóxico para nuestro organismo. Motivo por el que los hematíes poseen la enzima catalasa.
Prueba de la catalasa
Se pone en contacto el microorganismo problema con agua oxigenada. Si se desdobla y
aparece O2 el microorganismo es catalasa positiva. El resultado es visible porque en caso de
positividad aparecen burbujas fácilmente identificables.
• Microorganismo problema procedente de un cultivo
• Pipeta pasteur
• Portaobjetos
• Peróxido de hidrógeno de 100 volúmenes al 30%
• Papel de filtro
• Mechero bunsen
• Portaobjetos

Biomédico
Técnica
1. Coger un inóculo del microorganismo problema con un asa de siembra de platino.
2. Depositar el inóculo realizando una impronta sobre un portaobjetos o sobre un trozo
de papel de filtro situado sobre el porta.
3. Añadir una gota de H2O2.
4. Visualizar si aparecen o no burbujas y catalogar al microorganismo como catalasa
positivo o negativo.
Representación gráfica de la técnica

Biomédico
Impronta del microorganismo sobre papel de filtro
Si aparecen burbujas en los 10 minutos posteriores al contacto del agua oxigenada con la
impronta del microorganismo, el resultado es positivo. En caso contrario el resultado será
negativo.
El resultado de esta práctica fue positivo, ya que el microorganismo tenía la enzima catalasa.
La presencia de burbujas fue clara pese a que fue imposible tomar una fotografía donde se
visualizasen.
Observaciones
No se deben usar microorganismos procedentes de cultivos en agar sangre o agar chocolate ya
que producen falsos positivos.
Tampoco se debe utilizar un asa de siembra de platino para mezclar el agua oxigenada con el
microorganismo, ya que el platino cataliza la reacción. Lo ideal sería utilizar un asa de siembra
desechable de plástico, pero no las había en el laboratorio.
Finalmente, esta práctica no debe realizarse siempre con cultivos jóvenes.

Biomédico
Título
Prueba de la coagulasa.
Objetivo
Comprobar si un microorganismo problema posee la enzima coagulasa.
Fundamento
Es una enzima producida por un determinado microorganismo capaz de coagular el plasma
sanguíneo. Su aplicación clínica más importante es la ayuda a la diferenciación del
Staphylococcus Aureus de otros Staphylococcus.
Prueba de la coagulasa
Al poner en contacto el microorganismo problema con plasma, si el microorganismo posee la
enzima coagulasa, el plasma coagula.
• Tubo de hemólisis
• Plasma sanguíneo
• Papel de filtro
• Mechero bunsen
• Baño termostático de agua
• Cronómetro
• Micropipeta automática
• Punta de micropipeta
Técnica
1. En un tubo de hemólisis se ponen 0,5 ml de plasma y se le añaden 0,5 ml de
microorganismo problema.
2. Mezclar suavemente, por rotación, el plasma con el microorganismo.
3. Incubar a 37ºC en una estufa, o en un baño termostático de agua o arena.
4. Observar cada 30 minutos si se ha coagulado el plasma inclinando el tubo.
5. Realizar la última observación, si no se ha coagulado previamente, a las 4 horas del
inicio de la práctica.

Biomédico
Si no se ha formado el coágulo a las cuatro horas, como fue en nuestro caso, consideraremos
que el microorganismo es coagulasa negativa. En caso de que sí se haya formado el coágulo se
considerará al microorganismo como coagulasa positiva.
Se comparó el resultado con un tubo control que no presentaba coágulo alguno. El tubo
control contenía únicamente plasma.
Al tumbar
el tubo comprobamos que el plasma no se ha coagulado
Observaciones
Tuvimos que estar interrumpiendo la clase de bioquímica para hacer lecturas cada media hora
porque con 4 horas no nos daba para toda la clase de microbiología. Es muy importante tener
el cronómetro a mano y que éste nos avise cada 30 minutos.

Biomédico
Título
Prueba de la fermentación triple.
Objetivo
Comprobar si el microorganismo problema utiliza los hidratos de carbono presentes en el
medio de cultivo.
Fundamento
Se emplea fundamentalmente para enterobacterias, pero se puede aplicar a cualquier
microorganismo. Cuando un microorganismo acidifica el medio porque produce ácidos, esto se
pone de manifiesto mediante un indicador como el rojo fenol. Este indicador cambia de color a
amarillo si el medio es ácido, y a rojo si el medio es básico.
Si el microorganismo no utiliza los hidratos de carbono emplea proteínas que alcalinizan el
medio haciendo subir el pH. Los azúcares presentes en el medio de cultivo son glucosa, lactosa
y sacarosa.
Prueba de la fermentación triple
Se siembra el microorganismo problema en un medio de cultivo con los tres azúcares. Este
medio de cultivo recibe el nombre de agar TSI (triple-azúcar-hierro). El método de siembra
utilizado es el de placa a tubo por lengüeta y picadura.
El medio de cultivo proporciona las condiciones ideales para comprobar el uso de los hidratos
de carbono que realiza el microorganismo problema. Además, puede que se originen burbujas
en el medio, y si dicho gas es SH2 irá acompañado de un ennegrecimiento del agar.
• Medio de cultivo TSI en tubo
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Estufa

Biomédico
Técnica
1. Coger un inóculo del microorganismo problema, procedente de una placa, haciendo
uso del asa de siembra de platino.
2. Sembrar el microorganismo en el tubo con agar TSI haciendo uso de la técnica por
lengüeta.
3. Coger un inóculo del mismo microorganismo problema, procedente de la misma placa,
haciendo uso del hilo de siembra de platino.
4. Sembrar el microorganismo en el tubo con agar TSI haciendo uso de la técnica por
picadura.
5. Incubar durante 18-24 horas a 37ºC.
Si el medio de cultivo vira a color amarillo es porque el microorganismo consume hidratos de
carbono acidificando el medio. En cambio, si vira a color rojo es porque el microorganismo
hace uso de proteínas alcalinizando el medio.
En nuestro caso resultó que el microorganismo consumía tanto la lactosa como la glucosa. Las
burbujas de gas fueron muy patentes e incluso provocaron la fractura del medio de cultivo.
Otros compañeros atisbaron producción de SH2 debido al ennegrecimiento del agar TSI
presente en sus tubos.
Agar TSI de coloración amarilla debido a la acidificación del medio por uso de los hidratos de
carbono por parte del microorganismo sembrado.

Biomédico
Apreciación de las burbujas producidas por la fermentación de la glucosa y la lactosa
Fractura del Agar TSI producida por la producción de ácido y gas de la fermentación de los
hidratos de carbono por parte del microorganismo problema.

Biomédico
Tubo sembrado junto a tubo control con Agar TSI sin sembrar. Permite apreciar el cambio de
coloración producido respecto al color original del medio.
Prueba de la fermentación triple de varios compañeros. En algunos tubos se atisba el
ennegrecimiento del medio de cultivo por producción de SH2

Biomédico
Observaciones
Hay que mirar el resultado en el tiempo indicado porque los microorganismos comienzan
empleando los hidratos de carbono, y cuando éstos se acaban comienzan a usar las proteínas.
Si se visualiza más tarde es posible que nos encontremos un resultado que no se corresponde
con la realidad.
Es preciso hacer uso de un tubo control. El agar TSI es muy ocre y puede que el cambio de
tonalidad sea tan leve que nos impida valorar el resultado.
A pesar de que el medio está compuesto por tres azúcares, esta técnica solo nos permite
conocer si el microorganismo emplea la glucosa y/o la lactosa.

Biomédico
Título
Prueba de la ureasa.
Objetivo
Comprobar si el microorganismo problema posee la enzima ureasa.
Fundamento
Esta prueba consiste en detectar la presencia de la enzima ureasa en un determinado
microorganismo problema. Esta enzima cataliza la hidrólisis de la urea, que da lugar a dióxido
de carbono y amoniaco.
Prueba de la ureasa
Se pone en contacto el microorganismo problema con un medio de cultivo de Agar urea de
Christensen. Si el microorganismo posee la enzima ureasa el medio de cultivo se alcaliniza y
cambia de color mediante el indicador que lleva incorporado. Normalmente este indicador es
el rojo fenol.
• Tubo con medio de cultivo de agar urea de Christensen
• Papel de filtro
• Mechero bunsen
Técnica
1. Coger un inóculo con el asa de siembra de platino.
2. Sembrar el microorganismo en un medio de agar urea de Christensen. Haciendo uso
de la técnica por lengüeta.
3. Incubar a 37ºC hasta un máximo de seis días.

Biomédico
El medio de cultivo viró hacia una tonalidad amarilla, con evidentes diferencias frente al tubo
control. Por tanto, consideramos que es ureasa positiva.
Resultado positivo. El color del medio viró hacia el amarillo tras la alcalinización de este.
Observaciones
El indicador que lleva el medio de cultivo no es rojo fenol, ya que los positivos han virado a
color amarillo. Se utilizó un tubo control sin siembra alguna. Este tubo control era de color
anaranjado.
Como no sabíamos el indicador, consideramos que era positivo al aparecer un color diferente
al del control.

Biomédico
Título
Prueba de la oxidasa.
Objetivo
Comprobar si un microorganismo problema posee la enzima oxidasa.
Fundamento
La oxidasa es una denominación genérica de una enzima que recibe el nombre de citocromo
oxidasa. Hasta ahora se pensaba que era la enzima que participaba en la transferencia de
electrones en la cadena respiratoria hacia el oxígeno, y que era única.
Se puede definir como una enzima que cataliza electrones cuando son transferidos desde un
sustrato al oxígeno. Se ha detectado en microorganismos aerobios y anaerobios facultativos y
no se detecta en anaerobios estrictos.
Prueba de la oxidasa
Se pone en contacto un microorganismo problema con un sustrato que cambia de color
cuando se oxida. Si el microorganismo posee la enzima oxidará el sustrato y se podrá detectar.
• Papel de filtro
• Tijeras
• Portaobjetos
• Pipeta pasteur
• P-fenil diamina
Técnica
1. Recortar un trozo de papel de filtro.
2. Colocar el trozo de papel de filtro encima de un portaobjetos.
3. Impregnar el papel con P-fenil diamina haciendo uso de una pipeta pasteur.
4. Realizar la impronta de un microorganismo problema usando un asa de siembra de
platino.

Biomédico
El microorganismo será considerado oxidasa positiva si la impronta adquiere color. Este color
es tirando a rojizo.
En nuestro caso el resultado fue completamente negativo. La impronta no adquirió ningún
color.
Observaciones
Hubo variedad de resultados porque se utilizaron diferentes microorganismos problema. Fue
útil para comparar diversas positividades frente a un negativo claro.

Biomédico
Título
Fenilalanina desaminasa (FAD)
Objetivo
Comprobar si un microorganismo problema posee la enzima fenilalanina desaminasa (FAD).
Fundamento
Se pone en contacto un microorganismo problema con un medio de cultivo que contenga
fenilalanina. Tras un periodo de incubación se le añade el reactivo Cl3Fe. Este reactivo pone de
manifiesto la presencia del compuesto que se produce, por la acción de la FAD, al
desaminarse.
Fenilalanina desaminasa (FAD)
El compuesto resultante es un compuesto ácido -ácido fenilpirúvico-, el cual reacciona con el
Cl3Fe originando un color verdoso.
• Tubo con medio de cultivo que contenga fenilalanina
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Pipeta pasteur
• Cl3Fe
• Estufa
• Cronómetro

Biomédico
Técnica
1. Coger un inóculo del microorganismo problema, haciendo uso de un asa de siembra,
procedente de un cultivo previo en placa.
2. Sembrar el microorganismo problema en el medio de fenilalanina utilizando la técnica
de slam o lengüeta.
3. Incubar a 37ºC de 18 a 24 horas.
4. Pasado el tiempo añadir 4 o 5 gotas de Cl3Fe haciendo uso de la pipeta pasteur.
Procurar que se deslice bien por el agar inclinando el tubo.
5. Esperar 2 minutos.
6. Observar y anotar la reacción resultante.
Si el microorganismo posee la enzima fenilalanina desaminasa (FAD), el medio adquirirá una
tonalidad verdosa sobre fondo blanco. Esto debe ocurrir en la zona de siembra donde ha
crecido el microorganismo.
Reactivo Cl3Fe necesario para la práctica.

Biomédico
Tubos con fenilalanina sembrados e incubados. Listos para recibir el reactivo.
Microorganismo fenilalanina desaminasa positivo o FAD+.
El resultado fue que el microorganismo es FAD+ ya que el medio cambió a color verdoso sobre
fondo blanco tras el contacto con el reactivo.

Biomédico
Observaciones
Hay que anotar el resultado en el tiempo indicado, ya que conforme pasan los minutos el color
verdoso de los microorganismos positivos tiende a desaparecer. Si esto ocurriese estaríamos
ante un falso negativo.

Biomédico
Título
Prueba de la lisina descarboxilasa.
Objetivo
Comprobar si el microorganismo problema posee la enzima lisina descarboxilasa.
Fundamento
Se pone en contacto el microorganismo problema en un medio de cultivo con lisina. De este
modo podrá actuar la lisina descarboxilasa en el supuesto de que el microorganismo posea la
enzima.
Prueba de la lisina descarboxilasa
Si la enzima actúa sobre la lisina, se produce un compuesto alcalino que recibe el nombre de
cadaverina. El medio de cultivo lleva, además de la lisina, un indicador que cambiará de color
cuando el medio se alcalinice.
• Tubo con medio de cultivo con lisina
• Púrpura de bromocresol como indicador
• Parafina o vaselina
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
Técnica
1. Preparar el medio de cultivo añadiendo púrpura de bromocresol como indicador.
2. Coger un inóculo del microorganismo problema procedente de un cultivo.
3. Sembrar el microorganismo haciendo uso de la técnica por agitación.
4. Calentar el tubo para liberar el oxígeno acercándolo a la llama del mechero bunsen.
5. Acto seguido verter unas gotas de parafina o vaselina.
6. Incubar a 35ºC durante 24 horas.

Biomédico
El color del tubo no cambió de color y se comparó con un tubo control, siendo el color idéntico
en ambos. Por tanto, el microorganismo problema es lisina descarboxilasa negativo.
Lisina descarboxilasa negativo.
Ldc negativo, ldc positivo y tubo control respectivamente.

Biomédico
Observaciones
Otros compañeros inocularon microorganismos que sí poseían la enzima, adquiriendo el medio
un tono de color marrón oscuro que se diferenciaba muy bien del color ambarino del control
negativo. Este color se mantenía en los medios con microorganismos que no poseían la
enzima.

Biomédico
Título
Prueba de la ONPG (Orto Nitro Fenil Galactopiranósido).
Objetivo
Identificar si un microorganismo problema fermenta o no la lactosa.
Fundamento
Los microorganismos que fermentan la lactosa pueden poseer uno o dos enzimas. Una de ellas
es la lactosa permeasa, que está en la membrana y es capaz de transportar la lactosa, a través
de ella, hasta el interior del microorganismo. Otra es la β-D-Galactosidasa, que es una enzima
que está en el interior y desdobla la lactosa en glucosa y galactosa.
Prueba de la ONPG
Se pone en contacto el microorganismo problema con un compuesto como la ONPG,
sustituyendo a la lactosa. La ONPG por acción de la β-D-Galactosidasa produce un compuesto
coloreado. Si esto ocurre es porque el microorganismo problema presenta la enzima.
• Tubo de centrífuga
• Agua desionizada
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Discos de Orto Nitro Fenil Galactopiranósido
• Pinza metálica
Técnica
1. Preparar un cultivo denso del microorganismo problema en suero salino fisiológico o
en agua destilada. Inocular una buena cantidad de microorganismo haciendo uso de la
técnica por agitación.
2. Añadir al tubo un disco de Orto Nitro Fenil Galactopiranósido.
3. Incubar a 37ºC de 20 minutos a 24 horas.
4. Visualizar el resultado y anotar.

Biomédico
Cultivo denso del microorganismo problema en agua desionizada.

Biomédico
Preparando el disco ONPG para introducirlo en el tubo.
El resultado es positivo. El microorganismo es beta-D-galactosidasa positivo, es decir, es capaz
de fermentar la lactosa.
El microorganismo problema desdobla la lactosa, ya que el medio ha virado a un color amarillo
(positivo). En caso contrario, el medio hubiese permanecido incoloro (negativo).

Biomédico
Título
Pruebas IMVIC: Prueba del Indol.
Objetivo
Comprobar que el microorganismo problema posee la enzima triptofanasa.
Fundamento
Es una prueba del metabolismo proteico. El medio de cultivo que se utiliza es agua de peptona
porque tiene triptófano. Si el microorganismo problema tiene triptofanasa la desdoblará
dando lugar a diversos metabolitos (indol, escatol o indol acético) según la naturaleza del
propio microorganismo.
Pruebas IMVIC: Prueba del Indol
Todos los metabolitos son compuestos indólicos que se ponen de manifiesto al añadir el
reactivo de Kovacs al medio. De este modo, si dichos compuestos están presentes, aparecerá
un anillo de color rojo en la superficie del tubo.
• Medio de cultivo de agua de peptona en tubo
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Pipeta pasteur
• Reactivo de Kovacs
Técnica
1. Sembrar el microorganismo problema en el medio de agua de peptona añadiendo dos
o tres colonias/inóculos procedentes de un cultivo. Para ello utilizar un asa de siembra
y la técnica de agitación.
2. Incubar a 37ºC durante un periodo de tiempo comprendido entre 24 y 48 horas.
3. Añadir cinco gotas de reactivo de Kovacs.
4. Agitar suavemente y dejar reposar.

Biomédico
La prueba se considera positiva si aparece un anillo de color rojo en la superficie del medio de
agua de peptona. Por contra, si no aparece y el medio permanece con la misma apariencia, el
resultado será negativo.
Se aprecia anillo rojo en la superficie del medio de agua de peptona. Podemos hablar de que el
microorganismo es Indol positivo, ya que posee la enzima triptofanasa.

Biomédico
Título
Pruebas IMVIC: Prueba del Rojo de Metilo.
Objetivo
Comprobar que el microorganismo problema metaboliza los hidratos de carbono por la vía
ácido-mixta.
Fundamento
El medio de cultivo Clark y Lubs es un medio que tiene lo mínimo necesario para el crecimiento
de un microorganismo problema.
Pruebas IMVIC: Prueba del Rojo de Metilo
Si el microorganismo consume el hidrato de carbono del medio (glucosa) habrá producción de
ácido, y esto se pondrá de manifiesto mediante el indicador Rojo de Metilo.
• Medio de cultivo Clark y Lubs
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Pipeta pasteur
• Reactivo Rojo de Metilo
Técnica
1. Coger un inóculo del microorganismo problema procedente de un medio de cultivo.
2. Sembrar el microorganismo problema en el medio Clark y Lubs haciendo uso de la
técnica de agitación.
3. Incubar a 37ºC durante 48-72 horas.
4. Añadir al medio de cultivo unas gotas de Rojo de Metilo.

Biomédico
Si el medio de cultivo se torna ácido es porque el microorganismo consume la glucosa por la
vía ácido-mixta. Esto se pone de manifiesto gracias al indicador, haciendo que el medio se
vuelva de color rojo. En caso negativo, el medio de cultivo mantendrá su color inicial cuando se
añada el indicador.
Una vez echado el indicador, aparece color rojo indicando positividad. El microorganismo
problema metaboliza la glucosa por la vía ácido-mixta.

Biomédico
Título
Pruebas IMVIC: Voges Proskauer.
Objetivo
Determinar si un microorganismo problema utiliza la glucosa por la vía butilén-glicólica.
Fundamento
Si el microorganismo problema utiliza la glucosa por la vía butilén-glicólica originará un
compuesto que es la acetoína.
Pruebas IMVIC: Voges Proskauer
Esta acetoína es el acetil-metil-carbinol que, en presencia de oxígeno atmosférico, y con α-
naftol en un medio básico, produce un compuesto coloreado.
• Medio de cultivo Clark y Lubs
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Micropipetas automáticas
• Puntas de micropipeta
• Reactivo de α-naftol

Biomédico
Técnica
1. Coger un inóculo del microorganismo problema procedente de un cultivo con un asa
de siembra de platino.
2. Sembrar el microorganismo problema en un medio Clark y Lubs haciendo uso de la
técnica de agitación.
3. Incubar a 37ºC durante 48 horas.
4. Añadir 0,5 ml de α-naftol y 0,5 ml de KOH al 40%.
5. Agitar y poner en posición horizontal para que la superficie de contacto con el oxígeno
aumente.
6. Esperar 15 minutos.
7. Poner el tubo en posición vertical y comprobar el resultado.
No cambió el color comparado con el control. Por tanto, el microorganismo problema es Voges
Proskauer negativo, ya que no utiliza la glucosa por la vía butilén-glicólica.
De izquierda a derecha: tubo control, tubo Voges Proskauer positivo y tubo Voges Proskauer
negativo.

Biomédico
Título
Pruebas IMVIC: Prueba del Citrato.
Objetivo
Determinar si un microorganismo problema utiliza el carbono del citrato como fuente de
carbono.
Fundamento
Se siembra el microorganismo en un medio que tenga Citrato de Simmonds, si el
microorganismo lo utiliza origina compuestos de amonio que se convierten en amoniaco.
Pruebas IMVIC – Prueba del Citrato
La alcalinización del medio sucede por el propio amoniaco formado fruto de la liberación de las
sales amónicas del medio y de la eliminación del citrato. Esto se pone de manifiesto con el
indicador que incluye el medio, que es azul de bromotimol.
• Medio de cultivo de agar inclinado con Citrato de Simmonds
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
Técnica
1. Haciendo uso del asa de siembra, coger un inóculo de un microorganismo problema
procedente de un medio de cultivo.
2. Sembrar el microorganismo problema en un tubo con medio de agar inclinado con
Citrato de Simmonds, haciendo uso de la técnica de siembra en lengüeta.
3. Incubar a 37ºC de 48 a 72 horas con los tubos destapados totalmente.

Biomédico
Si el medio de cultivo aparece de color azul se dice que es citrato positivo, y si aparece de color
verde, original del medio, es negativo.
Tubo control, sin sembrar y con el color verde original, y tubo citrato positivo, de color azul
que demuestra que el microorganismo problema utiliza el carbono del citrato.
Observaciones
Me gustaría dar las gracias a Jose A Navarro por la corrección del fundamento de la práctica en
los comentarios.

Biomédico
Título
Prueba de Screening.
Objetivo
Averiguar la capacidad que tiene un microorganismo para degradar un hidrato de carbono.
Fundamento
Se pone en contacto un microorganismo problema con un medio que tenga un hidrato de
carbono determinado.
Prueba de Screening
Si el microorganismo lo utiliza con formación de gas, éste aparecerá en la campana de
Durham. Si hay formación de gas el medio se acidificará y cambiará el color del medio gracias a
un indicador.
• Medio de cultivo procedente de un preparado de 90 ml de agua de peptona, 10 ml de
glucosa al 10% y 0,1 ml de púrpura de bromocresol
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• Campana de Durham
Técnica
1. Coger un inóculo del microorganismo problema, con el asa de siembra de platino,
procedente de un medio de cultivo.
2. Sembrar el microorganismo en el medio de cultivo fabricado haciendo uso de la
técnica por agitación.
3. Añadir al medio la campana de Durham.
4. Incubar a 37ºC durante 24-48 horas.
5. Visualizar y anotar el color del medio, y la aparición o no de burbujas de gas en la
campana de Durham.

Biomédico
Si el microorganismo problema ha utilizado la glucosa con producción de gas y ácido, el medio
cambiará de color. Se comparará el color con un control negativo que contenga el mismo
medio de cultivo, pero sin haber sido sembrado con microorganismo alguno.
El tubo control (negativo) es de color morado. El tubo sembrado ha virado al color amarillo
debido a la producción de gas y ácido. La campana de Durham se aprecia flotando debido al
gas producido.
Observaciones
El protocolo original de la práctica incluía el rojo fenol como indicador. Finalmente se utilizó
como indicador, en su lugar, púrpura de bromocresol.

Biomédico
Título
Determinación cualitativa de anticuerpos febriles.
Objetivo
Determinar si un suero problema posee anticuerpos frente a un antígeno determinado.
Fundamento
Cuando se pone en contacto un antígeno con su anticuerpo correspondiente, se produce una
reacción de aglutinación que puede observarse a simple vista.
Determinación cualitativa de anticuerpos febriles
Se trata de una prueba cualitativa en la que se enfrentan varios antígenos a un suero
sanguíneo problema. Los elementos antigénicos son conocidos, propios de microorganismos
con nombre y apellido. Si en el suero sanguíneo existen anticuerpos contra alguno de los
antígenos enfrentados, ocurrirá una reacción de aglutinación que se podrá observar con
claridad.
Para la validación de la técnica se emplean controles positivos, ya que aseguran la aglutinación
y el buen funcionamiento de esta. También se emplean controles negativos que garantizan
que los antígenos estén libres de anticuerpos adheridos.

Biomédico
• Tarjeta de fondo blanco
• Bastoncillo de plástico
• Papel de filtro
• Suero sanguíneo problema
• Agua destilada o desionizada
• Pipeta pasteur
• Antígenos bacterianos y sus respectivos controles positivos con anticuerpos
o Antígeno H flagelar
▪ Salmonella Tiphy
▪ Salmonella Paratiphy A
o Antígeno O somático
▪ Salmonella Paratiphy A
▪ Brucella Abortus
▪ Proteus Vulgaris OX19 y OX2
▪ Proteus Mirabilis OXK
Técnica
1. Colocar una gota de la muestra problema (suero sanguíneo) en el círculo de la tarjeta
destinado a la muestra.
2. Colocar en el mismo círculo, pero separado, una gota del reactivo que contiene el
antígeno bacteriano.
3. Mezclar ambas gotas utilizando un pequeño bastoncillo de plástico.
4. Repetir los pasos anteriores utilizando un suero control positivo y agua destilada como
control negativo.
5. Agitar suavemente la tarjeta para favorecer la mezcla, su homogeneización y su
posterior aglutinación si la hubiere.
6. Visualizar y anotar el resultado

Biomédico
Recipientes comerciales con antígenos (H y O) de diferentes microorganismos conocidos.
Resultados tras la mezcla de los antígenos con el suero sanguíneo problema.

Biomédico
Finalmente, los resultados obtenidos fueron los siguientes:
• Usando controles positivos:
o Brucella Abortus (Ag O): POSITIVO
o Salmonella Tiphy (Ag H): POSITIVO
• Usando suero sanguíneo problema:
o Salmonella Paratiphy (Ag H): NEGATIVO
o Salmonella Paratiphy (Ag O): NEGATIVO
o Proteus Mirabilis OXK (Ag O): NEGATIVO
o Proteus Vulgaris OX2 y OX19 (Ag O): NEGATIVO
Observaciones
Se utilizaron los controles positivos de los antígenos de la Brucella Abortus y Salmonella Tiphy
para poder observar las aglutinaciones. De otro modo, a la vista de los resultados, no se
hubiera apreciado aglutinación ninguna debido a la ausencia en la muestra de anticuerpos
febriles.

Biomédico
Título
Pruebas ASLO
Objetivo
Comprobar si una muestra problema tiene anticuerpos contra la streptolisina O.
Fundamento
Cuando se pone en contacto un antígeno con su anticuerpo correspondiente, se produce una
reacción de aglutinación que puede observarse a simple vista.
Pruebas ASLO
Se pone en contacto un suero problema con una suspensión de látex sensibilizada con
streptolisina O, que es una exotoxina estreptocócica. Si en el suero problema hay presencia de
anticuerpos Antiestreptolisina O se producirá aglutinación.
• Tarjeta de fondo negro
• Bastoncillo de plástico
• Papel de filtro
• Suero sanguíneo problema
• Agua desionizada
• Pipeta pasteur
• Suspensión de partículas de látex sensibilizadas con el antígeno streptolisina O
• Control positivo con anticuerpos antiestreptolisina O

Biomédico
Técnica
1. Colocar una gota de la muestra problema (suero sanguíneo) en el círculo de la tarjeta
de fondo oscuro.
2. Colocar, en el mismo círculo, pero por separado, una gota de la suspensión que
contiene las partículas de látex sensibilizadas con streptolisina O.
3. Mezclar ambas gotas en el mismo pocillo haciendo uso de un bastoncillo de plástico.
4. Repetir los pasos anteriores utilizando un suero control positivo y agua desionizada
como control negativo.
5. Agitar suavemente la tarjeta para homogeneizar la mezcla, mejorando la visualización
de la aglutinación en caso de positividad.
Muestra utilizada en un tubo eppendorf junto al resultado (negativo) de la prueba. Los
controles validan la prueba.
El resultado de la prueba es negativo, pese a que la perspectiva de la foto tomada deja
entrever una posible positividad. No se produjo una aglutinación de la muestra y, por tanto, no
hay presencia de anticuerpos antiestreptolisina O.
Los controles han funcionado bien, validando la prueba y, por ende, el resultado obtenido.

Biomédico
Título
Prueba de reducción de Nitratos
Objetivo
Comprobar si el microorganismo problema posee la enzima nitrato reductasa y si ha reducido
los nitratos a nitritos, o a otra cosa.
Fundamento
Se pone en contacto el microorganismo problema con un medio que tenga nitratos y se
detectan los productos finales.
Prueba de reducción de Nitratos
En función de estos productos finales se podrá conocer si el microorganismo ha reducido los
nitratos o no. Por tanto, comprobaremos si el microorganismo problema posee la enzima
nitrato reductasa, también llamada complejo nitratasa.
• Microorganismo problema procedente de un cultivo joven
• Medio de cultivo que contenga nitratos
• Mechero bunsen
• Papel de filtro
• α-Naftilamina al 0,5%
• Ácido sulfanílico al 0,8%
• Polvo de zinc
• Balanza analítica que discrimina miligramos

Biomédico
Técnica
1. Coger un inóculo de un microorganismo problema procedente de un cultivo joven,
haciendo uso para ello de un asa de siembra de platino.
2. Sembrar el microorganismo problema, en un medio que contenga nitratos, mediante
la técnica de agitación.
3. Incubar a 37ºC de 12 a 24 horas.
4. Añadir 1 ml del reactivo α-Naftilamina al 0,5%.
5. Añadir, a continuación, 1 ml de ácido sulfanílico al 0,8%.
6. En función del resultado obtenido (ver resultado e interpretación) añadir 20 mg de
polvo de zinc al medio de cultivo.
Si se forma un color rojo, o rosado, antes de treinta segundos es que había nitritos (Nitrato
positivo). En caso contrario, se le añaden 20 mg de polvo de Zn al medio. Si aparece color rosa
es que había nitratos que no se habían reducido (Nitrato negativo), y si aparece el mismo color
es que se habían reducido los nitratos, pero no a nitritos.
Tras añadir los reactivos α-Naftilamina y ácido sulfanílico en el tubo con el microorganismo
problema, el medio ha adquirido un color rojo que indica que se han reducido los nitratos a
nitritos. Por tanto, el microorganismo es Nitrato positivo y posee la enzima nitrato reductasa.
Control negativo de la prueba de reducción de Nitratos.

Biomédico
Cuatro tubos Nitrato positivo cuyos microorganismos poseen la enzima Nitrato reductasa,
responsable de la reducción de los nitratos a nitritos.
Observaciones
El motivo por el que se utiliza polvo de zinc, si el resultado inicial obtenido es negativo, es
porque es un potente reductor.

Biomédico
Título
Realización de un API 20E
Objetivo
Identificar un microorganismo problema mediante la realización de un API específico (API 20E)
para el tipo de microorganismo que estamos buscando. En este caso se trata de una
Enterobacteriacea.
Fundamento
Es un sistema que supone la realización de 20 pruebas. Consta de 20 microtubos que
contienen los medios deshidratados. Estos medios se incuban con una suspensión de bacterias
que, además de inocular el microorganismo, los hidrata.
Durante la incubación el metabolismo del microorganismo genera cambios de color en el
medio o bien éstos se producen al añadir los reactivos.
La interpretación de estos cambios se realiza mediante tablas de lectura o mediante un
software informático. La batería consta de 20 pruebas.
API 20E
• ONPG: Prueba de la ONPG.
• ADH, LDC y ODC: Son pruebas de descarboxilación, porque detectan la presencia de
descarboxilasas. La LDC es la Lisina Descarboxilasa, la ODC la Ornitina descarboxilasa y
la ADH es la Arginina Dihidrolasa.
• CIT: Prueba del Citrato.
• SH2: Prueba de la fermentación triple.
• Ureasa: Prueba de la Ureasa.
• TDA: Triptófano desaminasa. Prueba del metabolismo de los compuestos
nitrogenados, que pone de manifiesto si el microorganismo posee la enzima triptófano
desaminasa. El medio lleva triptófano, y si el microorganismo posee dicha enzima
originará amoniaco y un compuesto que, cuando se le añade Cl3Fe aparece un color
marrón de manera inmediata, indicando que es positiva. Si el medio queda de color
amarillo la prueba es negativa. Se le adiciona una gota de reactivo de TDA para revelar
la positividad si la hubiere.
• IND: Prueba del Indol
• VP: Voges-Proskauer.
• GEL: Prueba de la Gelatinasa.

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