defensa chalbaud.pptx

Br. Eduardo A. Chalbaud M.
Tutor:
Prof. Balmore Guerrero
Jurado:
Prof. Juan Gaviria
Prof. Julio O. Rojas
Prof. Pablo García
Se invita cordialmente a la presentación de la defensa del
trabajo especial de grado titulado
Tesista
:
Universidad de los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos
SIXTO DAVID ROJO
Lugar: Laboratorio de Biotecnología
de Microorganismos SIXTO DAVID
ROJO
Salón de Clases
Fecha : 22/05/2015
Hora: 10 am
Caracterización taxonómica y fisiológica de cepas
de “setas” (Pleurotus spp.)
pertenecientes al cepario del
Laboratorio de Biotecnología de microorganismos
SIXTO DAVIS ROJO ULA.

Hongos
Micorrizas Líquenes
Simbiontes
Saprofitos
Paracitos
Pleurotus ostreatus
Pleurotus eryngii
INTRODUCCIÓN

CAPITULO I MARCO TEORICO
Hongos
La denominación proviene del
latín 'fungus': seta; griego:
'sphongos': esponja, definido en el
sentido Botánico como cualquier
vegetal heterótrofo que carecen de
flagelos y clorofila, que parasitan o
viven sobre materia orgánica en
descomposición y producen esporas
(Alexopoulos, 1952).
Basidiomiceto
Ascomiceto

Taxonomía de los hongos
Filogenia y clasificación del Reino Fungí. Sub Reino Dikarya y Hongos basales. Tomado de Hibbett D. et al.,
2006.
Análisis molecular Reino Fungí (2006)
Fundamentado en el análisis múltiple de los genes en
diferentes locus; destacando entre ellos los genes nu-
SSU, -LSU, 5.8S rRNA,rpb1, rpb2 y tef1,

El Filum Basidiomycota.
Figura VII Ciclo de vida de los Basidiomycota. Tomado y modificado de Campbell et al., 2010.
Basidiomiceto

El genero Pleurotus spp.
(Hongo Orellana)
Figura VIII La Seta ostra Pleurotus
ostreatus (Jacquin: Fries) Kummer
1871.
Figura IX Ciclo de vida del género Pleurotus sp. Tomado de: Valencia-del Toro, 2002.
P. ostreatus
14% producción
Agroindustrial
mundial

Importancia del genero Pleurotus sp.
Tabla I Producción mundial de hongos comestibles cultivados en 1986 hasta el 2010
Peso fresco. Tomado de Chang, 2004 modificado Rodríguez, 2007.
Nombre
1970 1974 1984 1981 1986 1990 1994 1997 2002 2010
ton % ton % ton % ton % ton % ton % ton % ton % ton % ton %
Agaricus bisporus
18
5
62
26
0
55
41
0
57 900 72 1220 56 1400 40,2 1850 37,6 2000 36,7 2240 35,4 2940 36
Lentinula edodes
94
31 14
8
31 19
1
27 180 14 320 15 400 11,3 830 16,8 1600 28,8 1160 18,2 1430 17,5
Pleurotus sp. - - 8 2 22 3 40 2,8 170 7,8 900 25,4 800 16,2 900 16,1 930 14,6 1190 14,6
Auricularia sp. - - - - - - 10 0,8 120 5,5 400 11,3 420 8,6 500 8,9 600 9,47 840 10,3
Volvariella volvacea - - - - - - 200 4,3 180 8,2 210 5,8 300 6,1 200 3,3 350 5,59 450 5,57
Flammulina velutipes 11 4 42 9 63 9 100 4,8 100 4,6 140 4 230 4,7 300 5,2 290 4,53 360 4,46
Tremella fuciformis - - - - 0 - - 40 1,8 40 1,1 160 3,2 - - 230 3,69 290 3,52
Hypsizygus marmoreus - - - - 7 1 - - - - - - 60 1,1 - - 110 1,78 130 1,62
Pholiota nameko 8 3 12 3 20 3 20 1,35 30 1,1 20 0,6 30 0,6 60 1 60 1,01 80 0,92
Tricholoma matsutake 2 1 0 0 0 0 513 120 272
Grifola frondosa - - - - 1 0 - - - - - - 10 0,3 - - 40 0,58 40 0,52
Otros - - - - 0 - - 10 0,5 10 0,3 24 4,9 - - 330 5,13 410 4,97
Total
30
0
10
0
47
0
10
0
71
4
10
0
1450 100 2190
10
0
4033 100 4834 100 5832 100 6340 100 8160 100
Incremento (%) - 36 34 51 73 62,9 38,5 10,8 16,5 28,7

Importancia del genero Pleurotus sp.
Tabla II Composición proximal de proteínas, vitaminas y minerales de algunas especies
de hongos comestibles, Los valores se expresan como mg/100 g de peso seco. Tomado
de Chang & Miles, 2004; Miles & Chang, 1997.
Composición
Especie
Agaricus bisporus Flammulina velutipes Lentinula edodes P. ostreatus
V.
volvacea
Humedad (%) 78.3-90.5 89.2 90.0-91.8 73.7-90.8 89.1
Proteína cruda (N x 4.38) 23.9-34.8 17.6 13.4-17.5 10.5-30.4 25.9
Grasa cruda 1.7-8.0 1.9 4.9-8.0 1.6-2.2 2.4
Carbohidrato
s
Totales 51.3-62.5 73.1 67.5-78.0 57.6-81.1 -
Sin N 44.0-53.5 69.4 59.5-70.7 48.9-74.3 45.3
Fibra cruda 8.0-10.4 3.7 7.3-8.0 7.5-8.7 9.3
Ceniza 7.7-12.0 7.4 3.7-7.0 6.1-9.8 8.8
Valor energético 328-368 378 387-392 345-367 276
Vitaminas
Tiamina 1.1-8.9 6.1 7.8 4.8 0.3-1.2
Rivoflavina 3.7-5.0 5.2 4.9 4.7 1.6-3.3
Niacina 42.5-51.0 106.5 54.9 108.7 47.6-91.9
Ácido ascórbico 26.5-81.9 46.3 - - 20.2
Minerales
Ca 23-71 19 98 33 35-347
P 790-1425 278 476 1348 978-1337
K 2849-4762 2981 Nd 3793 2005-6144
Fe 0.2-19.0 11.1 8.5 15.2 6.0
Na 106-156 278 8.5 837 151-347

Características del genero Pleurotus sp.
Figura X Características anatómicas del genero Pleurotus sp. Tomado de Lopéz y García, 2006.
Caracterización morfológica del género Pleurotus sp.

Caracterización Fisiológica del genero Pleurotus sp.
Micelio
Fructificación
Temperatur
a
El pH
El substrato
Carbono
Nitrógeno
Relación C/N
Minerales
Vitaminas
Humedad del aire
Tamaño de partícula
Aireación
Luz
Factores que afectan el
crecimiento y la
fructificación
Crecimiento micelial en medio solido
Crecimiento micelial en medio liquido

Caracterización molecular de especies del género Pleurotus.
ADNr
RFLP
RAPD
SCARs
evolución y especiación de estas
setas en un contexto biogeográfico
(Bunyard et al., 1996)

Cultivo del género Pleurotus sp.
FES con Pleurotus sp.
Fermentación liquida sumergida

Historia de los Hongos Comestibles
La antigua Grecia
Los Romanos y los Celtas
Recolecta
Recolecta y extracción de toxinas
Edad Media en Europa
Siglo XVII Francia y España
Gourmet
Producción Industrial
CAPITULO II
ANTECEDENTES

Historia de los Hongos Comestibles
América
Perú
México y Guatelama
P. ostreatus
P. eryngii
CAPITULO II
ANTECEDENTES

Taxonomía del género Pleurotus sp.
CAPITULO II
ANTECEDENTES
P.
ostreatus
Taxonomía morfológica
400 especies
Intercompatibilidad
XI complejos de
especie, especies
(Bresinsky et al.,
1987)
(Vilgalys y Sun 1994)
Taxonomía molecular
Análisis de secuencias del ADN de
diferentes regiones del genoma
nuclear y extracromosómico
Descripción morfológica
(Kummer, 1871)

Especie
Sinónimos y/o taxa de
nivel de sub especies
Grupos
Norte
América
Europa Asia
América del
Sur
África Australia
Pleurotus
otreatus
P. combilunus; P. florida;
P. salignus;
P. spodoleucus
I * * *
P. pulmonarius P. sajor-caju; P. sapidus II * * * *
P. populinus III *
P. cornopopiae P. citrinopeliatus IV * *
P. djamor
P. flabellatus;
P. otreatoroseus;
P. salmoneostramineus;
P. euosmus
V * * * * * *
P. eryngii
P. ferulae; P.
nefrodensis; P.
hadamardii
VI * *
P. cystidiosus P. abolanus VII * * * * *
P. caliptratus VIII *
P. levis VIII *
P. dryinus IX * *
P. purpureo-
olivaceus
X *
P.turber-regiun XI * * * *
P. agaves XI *
P. abieticola XI *
P. brazil XI *
P. australis XI *
Tabla III Especies biológicas establecidas dentro del género Pleurotus, sus sinónimos
correspondientes y/o taxa de nivel de subespecies, y grupos respectivos de
íntercompatibilidad; y su distribución mundial. Tomado: Kong w. 2005 y Vilgalys et al., 1996.

El control genético y morfológico del proceso de fructificación
genes
Micelio Fructificación Pleuroma
Morfogénesis de los carpóforos de las especies de Peurotus spp.
Métodos utilizados para la obtención de ADN
genómico en hongos
Aplicaciones de técnicas de la biología
molecular del genero Pleurotus sp.
RFLP
RAPD
SCARs
evolución y
especiación de estas
setas en un contexto
biogeográfico
(Bunyard et al., 1996)

JUSTIFICACIÓN.
CAPITULO III
14% producción
Agroindustrial
mundial
Distribución geográfica del género Pleurotus sp. en la República Bolivariana de
Venezuela desde 1950 a 2006. Tomado y modificado de Iturriaga & Minter (2006).

CAPITULO IV
MATERIALES Y METODOS
La presente investigación se llevó acabo en el Laboratorio de Biotecnología
de los Microorganismos “SIXTO DAVID ROJAS” de la Facultad de Ciencias de la
Universidad de los Andes Estado Mérida.
MATERIALE
S
Microorganismos.
Las cepas de hongos comestibles P3215, P132, PRAL y Pcit pertenecientes al cepario de macrohongos
“SIXTO DAVIS ROJO” del Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos “SIXTO DAVID ROJAS”
(BIOMI)
Medios de cultivo.
Agar papa dextrosa (PDA), (Gaitán y Pérez, 2002). composición: Papa 200,0 g, Agar-Agar
15,0 g, Dextrosa 20,0 g, Levadura 2,0 g.
Agar Sabaraud Dextrosa (ASD) (Odds, 1991), composición: digerido enzimático de caseína
5,0 g, Digerido de tejido animal 5,0 g, Dextrosa 40,0 g, Agar 15,0.
Las semillas de sorgo (Sorghum bicolor) fueron adquiridas en el mercado local y mantenidas
en embaces herméticos hasta su uso, Los fardos de heno de pasto Bermuda (Cynodon
dactylon) fueron adquiridos en el mercado local y se procesaron en molino de martillo hasta un
tamaño de particula de 1 cm.

CAPITULO III
HIPOTESIS.
OBJETIVO GENERAL
En el Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO de la
ULA Existen varias cepas del género Pleurotus sp. Luego de su caracterización
taxonómica y fisiológica se espera la identificación de las especies y establecer
diferencias fisiológicas entre ellas.
Caracterizar las cepas género Pleurotus sp. existentes en el Laboratorio
de Biotecnología de Microorganismos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Determinar las características morfo-anatómicas de las cepas del género Pleurotus spp. presentes en el
Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos.
Identificación taxonómica de las cepas del género Pleurotus spp. basada en las características morfo-
anatómicas.
Caracterización de las cepas del género Pleurotus spp. crecidas en medios convencionales y no
convencionales.
Identificar las cepas del género Pleurotus spp. utilizando técnicas moleculares.

CAPITULO IV
METODOLOGÍAS
Diagrama general de investigación.

CAPITULO IV
1. Determinación de las características morfo-anatómicas de las cepas P3215, P132,
Pcit y PRAL presentes en el Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos.
METODOLOGÍAS
1. Cultivo de las cepas P3215, P132 y Post por
fermentación de estado sólidos (FES) en heno de pasto
bermuda (Cynodon dactilón).
a. Preparación de semilla fúngica o inoculo
madre.
b. Preparación de los sustratos para la
producción de Pleurotus sp.
c. Preparación del sustrato para el cultivo y
fructificación de Pleurotus sp.
d. Cultivo y fructificación de Pleurotus sp. en
sustrato sólido.

CAPITULO IV
1. Determinación de las características morfo-anatómicas de las cepas P3215, P132,
Pcit y PRAL presentes en el Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos.
METODOLOGÍAS
2. Caracterización macroscópicas y microscópicas de
los pleurocarpos de las cepas P3215, P132 y Post.
Caracteres macroscópicos
Color
Apariencia
Consistencia
Forma
Caracteres microscópicos
Morfología:
Hifas
Himenio
Esporas
Basidio
Cistios
Himenóforo : 1. Pleurocistidios, 2. Queilocistidios,
3. Trama, 4. Basidios

CAPITULO IV
2. Identificación taxonómica de las cepas P3215, P132 y Post basada en las
características morfo-anatómicas.
METODOLOGÍAS
Caracteres macroscópicos
Claves dicotómicas
Key to identify Mushrooms to genus using only
macroscopic features (Largent, 1986).
Keys of genero Pleurotus sp. (Petersen et al., 2012).
Permitiendo la identificación a nivel de género
Permitiendo la identificación a nivel de especie

3. Características de las cepas P3215, P132, Pcit, PRAL y Post crecidas en medios
convencionales y no convencionales.
METODOLOGÍAS
1 Características de las colonias fúngicas en medios convencionales.
Figura XIII Caracterización macroscópica de la colonial micelial de los hongos. Tomado de Piccoli et al., 2010.
CAPITULO IV

METODOLOGÍAS
2. Determinación del efecto de los medios de cultivo convencionales y la
temperatura en el crecimiento y producción de biomasa de las cepas del género
Pleurotus sp.
1 Efecto de la temperatura sobre el crecimiento y producción de biomasa de las
cepas P132, P3215, Post y PRAL cultivadas en placas de PDA y ASD.
Donde:
A = área de la muestra
r = radio
20 ºC
25 ºC
30 ºC
35 °C
Temperaturas evaluadas
r = m (t) –b
t = tiempo de incubación d
m = tasa de crecimiento micelial mm/d
r = radio micelial mm.
Tasa de crecimiento micelial Producción de biomasa
Método gravimétrico
CAPITULO IV

METODOLOGÍAS
2. Determinación del efecto de los medios de cultivo convencionales y la
temperatura en el crecimiento y producción de biomasa de las cepas del género
Pleurotus sp.
2 Caracterización de las cepas Post y P3215 sobre medios no convencionales.
Donde:
A = área de la muestra
r = radio
Semilla de sorgo (Sorghum sp.),
Semilla de parchita (Passiflora edulis),
Arroz (Oryza sativa)
Tuza de maíz (Zea mays)
Medios de cultivo
r = m (t) –b
t = tiempo de incubación d
m = tasa de crecimiento micelial mm/d
r = radio micelial mm.
Tasa de crecimiento micelial
CAPITULO IV

4. Identificación por técnicas moleculares de las cepas P3215, P132, Post.
METODOLOGÍAS
1 Evaluación de los métodos de extracción de los ácidos nucleicos de las cepas
P3215, P132 y Post.
Método de Saghai-Maroof, et. al.1984
Método de Lee and Taylor,1990
Método de extracción de los ácidos nucleicos Pureza del ADN genómico
Integridad del ADN genómico
(electroforesis en agarosa 0,8%)
Concentración
PCR de la región ITS’s
Relación 230nm/260nm
Relación 280nm/260nm
Sales
Proteínas y fenol
1. Amplificación por PCR.
ADN genómico
Se amplificara por PCR de la región ITS1, 5.8S y ITS2, con los primers universales para
hongos (White et al. 1990):
ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3')
ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC
3')
1 Precipitación de productos de PCR
empleando sales.
2 Cuantificación semi-cuantitativa de los
productos de PCR.
CAPITULO IV

METODOLOGÍAS
2 Secuenciación del ADN
Producto de PCR
40 ciclos de 96 ºC/10 seg, 58 ºC/ 5 seg y 60 ºC/ 4 min
ABI 3130
Secuencia .txt
CAPITULO IV

METODOLOGÍAS
2 Secuenciación del ADN
Producto de PCR
40 ciclos de 96 ºC/10 seg, 58 ºC/ 5 seg y 60 ºC/ 4 min
ABI 3130
Secuencia .ab1
CAPITULO IV

METODOLOGÍAS
3 Análisis de secuencia de la región ITS1, 5.8S ADNr e ITS2
Bioinformática
Especie Código NCBI
P. eryngii EU233990
P. tuberregium EF514250
P. citrinopileatus AB115043
P. cystidiosus EF514244
P. ostreatus EF514248
P. pulmonariuswere EF514243
P. djamor AY265821
región ITS1 a 5.8S región 5.8S a ITS2
CAPITULO IV

METODOLOGÍAS
Bioinformática
región ITS1 a 5.8S región 5.8S a ITS2
1 Análisis Filogenético
Alineamientos
Filogenia
El método neighbor-joining
El modelo de sustitución Kimura 2
parámetros (K2P) con un valor de
réplicas de 1000 bootstrap).
CAPITULO IV

METODOLOGÍAS
2 RFLP por digestiones con enzimas de restricción virtual
Bioinformática
Especie Código NCBI
P. eryngii EU233990
P. tuberregium EF514250
P. citrinopileatus AB115043
P. cystidiosus EF514244
P. ostreatus EF514248
P. pulmonariuswere EF514243
P. djamor AY265821
NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003)
Webcutter 2.0 (Maarek et al., 1997).
implementando aquellas enzimas de restricción
que corten la secuencias en 2 a 5 sitios.
CAPITULO IV

METODOLOGÍAS
3 Análisis de estructuras secundarias del ADNr
Modelar la estructura
secundaria de la región ITS2
CAPITULO IV

CAPITULO V
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
1 Características morfo-anatómicas de las cepas P3215, P132 y Post pertenecientes al
Cepa P132
Tabla V Características de la cepa P132.
1 Características macroscópicas de las cepas P3215, P132 y Post

CAPITULO V
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Cepa P3215
Tabla VI Características de la cepa P3215.

CAPITULO V
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Cepa Post
Tabla VII Características de la cepa de Post.

CAPITULO VI
2 Características microscópicas de las cepas P3215, P132, Pcit, Post y PRAL.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Cepa Presencia fíbulas Características de las hifas
P3215 +
Hifas de paredes delgadas y entrelazadas, presencia de
perillas con pedúnculo
P132 + Hifas de paredes gruesas
Pcit + Hifas de paredes gruesas
Post +
Hifas de paredes delgadas y entrelazadas, presencia de
perillas con pedúnculo
PRAL + Hifas de paredes gruesas
Tabla VIII Características microscópicas de las cepas de las diferentes especies del género Pleurotus sp.

CAPITULO VI
2 Identificación taxonómica de las cepas las cepas P3215, P132 y Post basada en las
características morfoanatomicas.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Las cepas evaluadas se identificaron contrastando nuestros resultados con los caracteres
macroscópicos propuestos por Delgado et al., 2005 y Largent, 1977, que definen a un hongo
del género Pleurotus sp. Encontrando que las cepas P132, P3215 y Post pertenecen al género
Pleurotus sp. por presentar:
Key to identify Mushrooms to genus using only
macroscopic features (Largent, 1986).
Keys of genero Pleurotus sp. (Petersen et al., 2012).
cepa de Post. cepa P132 cepa P3215
Pleurotus ostreatus

CAPITULO VI
3 Características de las cepas las cepas P3215, P132, Post y PRAL crecidas en medios
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
1 Características de las colonias fúngicas en medios convencionales.
Cepa
Medios de
Cultivo
Características
Color Textura Densidad Micelio aéreo Forma Elevación Margen Superficie
P3215
PDA
Blanco Algodonosa
Alta
Si Filamentoso
Elevada y
limitada
Desflecado Sectorizada
SA Media
P132
PDA
Blanco Algodonosa
Alta
Si Filamentoso
Elevada y
limitada
Desflecado
Sectorizada
SA Media Cerebriforme
Pcit
PDA
Blanco Polvorienta
Alta
No
Filamentoso
Convexa
umbilicada
Liso Sectorizada
SA Media Circular
Post
PDA
Blanco Algodonosa
Alta
Si
Filamentoso
Elevada y
limitada
Desflecado
Cerebriforme
SA Media Circular Sectorizada
PRAL PDA Blanco Algodonosa Alta Si Filamentoso
Elevada y
limitada
Desflecado Cerebriforme
Tabla IX Características macroscópicas de las colonias de las cepas las cepas P3215, P132, Pcit, Post y
PRAL presentes en el Laboratorio BIOMI, evaluadas en medios de cultivo PDA y SA a 22°C.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
2 Efecto de la temperatura y el medio de cultivo en el crecimiento y la
producción de biomasa de las cepas P132, P3215 y P.ost.
Tabla X Tasa de crecimiento micelial (mm/día) tras la incubación por 15 día de las cepas P132,
P3215, Post y PRAL en PDA (Agar Papa Dextrosa) y ASD (Agar Sabouraud Dextrosa).
Nota: a, b, c, d, e, f, g, h y i diferencia significativa en la tasa de crecimiento micelial, la producción de biomasas con recto a la temperatura y los medios de cultivo con
P < 0,05

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
3 Tasa de crecimiento de las cepas Post y P3215 en medios no convencionales
Sustratos
Tasa de crecimiento (mm/d)
Post P3215
Tuza a 4,1 ± 0 0,1 4,9 ± 0,3
Sorgo 2,1 ± 0,1 3,2 ± 0,1
Arroz b 3,9 ± 0,2 4,6 ± 0,2
Parchita c 1,49 ± 0,09 1,6 ± 0,1
Tabla XI Tasa de crecimiento micelial (mm/día) a los 15 días de incubación de las cepas Post y P3215 en sustratos lignocelulósicos como tuza de maíz,
semilla de sorgo, arroz y semilla de parchita..
Nota: a, b y c diferencia significativa en la tasa de crecimiento micelial con P< 0,05.
Figura 14 Crecimiento micelial de las cepas Post y P3215 al 6to día cultivadas en medios no convencionales
como semilla de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maíz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa) y semilla de parchita
(Passiflora edulis) incubadas a 25°C.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
4 Características morfológicas de las cepas P3215 y Post en medios no
convencionales
Cepa
Medios de
Cultivo
Micelio Sustrato
Densidad Micelio aerio Color
Color
Sin micelio Con micelio
P3215
Tuza de maíz Regular Si Blanco Marron claro Marron claro
S. Sorgo Regular Si Blanco Marron oscuro Marron claro
Arroz Abundante Si Blanco Beige Beige claro
S. Parchita Escaso Si Blanco Marron oscuro o negro Marron oscuro
Post
Tuza de maíz Regular Si Blanco Marron Marron claro
S. Sorgo Regular No Blanco Marron oscuro Marron claro
Arroz Abundante No Blanco Beige Beige claro
S. Parchita Escaso Si Blanco Marron oscuro o negro Marron oscuro
Tabla XII Características morfológicas de las cepas estudiadas en en medios no convencionales como
semilla de sorgo (Sorghum sp.), Tuza de maíz (Zea mays), Arroz (Oryza sativa) y semilla de parchita
(Passiflora edulis) incubadas por 15 días a 25°C

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
4 Identificación por técnicas moleculares de las cepas P3215, P132, Post.
1 Extracción del ADN
Muestra
Minerales Pureza Concentración (ng/ul) Integridad
PCR
(Dilución)
S L S L S L S L S L
P3215 1,8 1,03 1,3 1,62 18,73 1,25 Integro Degradado 100 1000
POST 0,72 3,39 1,7 1,75 6,92 0,28 Integro Degradado 100 1000
PCIT 4,33 2,59 1,01 1,42 0,21 0,43 Degradado Degradado 100 1000
PRAL 1,42 0,91 1,23 1,42 5,57 1,52 Integro Degradado 100 1000
P132 0,73 3,05 1,7 1,08 11,03 0,17 Integro Degradado 100 1000
Tabla XIII Comparación de las características del ADN obtenido a partir de las cepas del genero Pleurotus
sp. a partir de los métodos de Saghai-Maroof, et. Al.1984 (S) y Lee & Taylor, 1990 (L).

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Figura XV Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de 1μg del ADN genómico extraído de las cepas del genero Pleurotus sp. P3215, P132,
Post, Pcit y PRAL utilizando el método de Lee & Taylor, 1990 (a) y el método de Saghai-Maroof, et. al.1984 (b).

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
1 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Figura XVI Análisis electroforético de los productos de PCR de la región ITS1, 5.8S y ITS2 amplificados con los primer’s ITS1 y ITS4 a partir
del ADN genómicos de las cepas del genero Pleurotus sp. como P3215, P132, Post, PRAL y PCIT extraídos por el método de Lee &
Taylor, 1990 diluida a un FD de 5000 (a) y el método de Saghai-Maroof, et. al.1984 a un FD de 200(b). (EPM) Escalera de peso molecular 1
Kb plus DNA ladder (+) Control positivo y (-) al control negativo.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
2 Análisis de la secuencia de la región ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la región ITS2
dentro de las cepas del genero Pleurotus sp.
Muestras
Tipo de
ADN
templado
Método de
Purificación
Tamaño del ADN
templado
Primer
Temperatura de
Annealing (°C)
Concentración
de ADN (ng/µl)
P3215 PCR Método Alcalino 560 ITS1 (FW) 55°C 100
Post PCR Método Alcalino 710 ITS1 (FW) 55°C 100
Pcit PCR Método Alcalino 690 ITS1 (FW) 55°C 50
PRAL PCR Método Alcalino 720 ITS1 (FW) 55°C 25
P132 PCR Método Alcalino 730 ITS1 (FW) 55°C 200
Tabla XIV Concentraciones de los productos de PCR de la región ITS1, 5.8S e ITS2 (PCR) de cada cepa
enviado a secuenciar a la a la Unidad de Estudios Genéticos y Forenses del IVIC.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
2 Análisis de la secuencia de la región ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la región ITS2
dentro de las cepas del genero Pleurotus sp.
Cepa Identidad ADN código de acceso Especie
P132
490/49(98.2%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KJ020935 Pleurotus ostreatus
490/49(98.2%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KF681359 P. ostreatus
Post 492/49(98.8%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 JX429940 P. sapidus
492/49(98.8%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KC686866 P. ostreatus
492/49(98.8%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 KC686865 P. ostreatus
P3215
626/64(97.81%) Región ITS1, 5.8S e ITS2 EU424300 P. ostreatus
Tabla XV Identidad de los productos de PCR de la región ITS1, 5.8S e ITS2 (PCR) de cada cepa
enviado a secuenciar a la a la Unidad de Estudios Genéticos y Forenses del IVIC.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
2 Análisis de la secuencia de la región ITS 1, gen 5.8 S ANDr y la región ITS2 dentro
de las cepas del genero Pleurotus sp.
1 Análisis bioinformático de las
secuencia de la región ITS 1, 5.8S e ITS2
Tabla XVI Patrones de bandas RFLP esperados para las
especies del genero Pleurotus sp. tras la digestión teórica
con las enzimas de restricción que cortan en 3 sitios.
Negro (Las enzimas de restricción que comparten todos),
Rojo que comparten las cepas P132, Post y P3215.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
2 Análisis Filogenético de las cepas del genero Pleurotus sp.
a) (b)
Figura XVIII Clados de los arboles filogenéticos de las regiones ITS1 y 5.8S (a) e ITS2 (b) construidos por el método NJ-
K2P- 1000 Bootstrap.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
3 Análisis de la estructura segundaria de la región ITS2
Especie ID Motivo 5.8S Motivo 28S
P. ostreatus
P3215 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCGGGTAGGACTCCC
Post GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA -
P132 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA -
EF514248 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC
P. djamor AY265821 GAAGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGACTACC
P. pulmonarius EF514243 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGACTA
P. cystidiosus EF514244 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGA
P. citrinopileatus AB115043 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCGCAAATCAGGTAGGACTACC
P. tuberregium EF514250 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA TGACCTCAAATCAGGTAGGACTAC
P. eryngii EU233990 GAGGGGCATGCCTGTTTGAGTGTCA -
Tabla XX Motivos conservados 5.8S y 28S en la región ITS2 del genero Pleurotus sp.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Figura XIX Motivos conservados 5.8S y 28S en la región ITS2 del genero Pleurotus sp.

CAPITULO VI
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
ID Especie E-value Modelo
EF470252
P. nebrodensis
1,203x 10-112
88,235 / 85,714 /
75,571 / 77,778
AY368663 P. floridanus 2,640x10-99 100 / 100 / 100 / 100
GU722281 P. ostreatus 3,416x10-98
100 / 100 / 100 / 100
AY265848 P. spodoleucus 1,228x10-97
100 / 100 / 100 / 100
EU424310 P. ostreatus 1,228x10-97
100 / 100 / 100 / 100
EU622256 P. ostreatus 5,716x10-96
100 / 100 / 100 / 100
FN391585 P. ostreatus 5,716x10-96
100 / 100 / 100 / 100
DQ077881. Pleurotus sp. 5,716x10-96
100 / 100 / 100 / 100
HM561980 P. sapidus 5,716x10-96
100 / 100 / 100 / 100
AY854077 P. ostreatus 2,056x10-95
100 / 100 / 100 / 100
Tabla XXI Coincidencias encontradas por comparación de estructura
secundaria ITS2 de la cepa P3215 (Pleurotus ostreatus var. florida).
Figura XX Estructura secundaria de la secuencia
ITS2 de la cepa P3215 (Pleurotus ostreatus var.
florida).

CAPITULO V
CONCLUSIÓN
Las características morfo-anatomicas permitieron clasificar a las cepas Post, P3215 y P132
en el género Pleurotus spp.
En los medios PDA y ASD la temperatura de incubación en el rango de 20 – 35 °C, tiene
poco efecto sobre las tasas de crecimiento micelial de las cepas P3215, P132, Post y PRAL;
no obstante, afecto la producción de biomasa dependiendo del medio de cultivo y de cada
cepa.
El compartamiento de las cepas inoculadas a diferentes temperaturas en medios
convencionales, indican que las cepas P132, P3215 y PRAL podrían cultivarse en
temperaturas cercanas a los 25 °C, mientras que la cepa Post se cultiva mejor a
temperaturas cercanas a los 30 °C.
Las diferencias en cuanto a las tasa de crecimiento y producción de biomasa, cuando las
cepas fueron cultivadas en las mismas condiciones, indican que existe diferencias
fisioñogicas y genéticas entre ellas.

CAPITULO V
CONCLUSIÓN
La tuza de maíz resulto el mejor sustrato no convencional para el cultivo de las cepas Post y
P3215, siendo así una alternativa al sorgo para la producción de semilla fúngica o inoculo
mayor.
Mediante las técnicas moleculares se determino por análisis filogenético de las regiones
ITS1 e ITS2 del ADNr que las cepas Post, P3215 y P132 pertenecen a la especie P.
ostreatus.
La técnica de RFLP teóricos a través de la digestión virtual de las secuencias del región
ITS1, 5.8S a ITS2, corroboro el análisis filogenético; logrando diferenciar e identificar
correctamente las especies del género Pleurotus utilizadas en este estudio, obteniendo los
patrones de bandas esperados. Adicionalmente, el patrón de bandas de la cepa Post de
estudio permitió ubicarla en la especie P.ostreatus. Por otro lado, los análisis de la secuencia
primaria y secundaria de la región ITS1 e ITS2 ubicaron las cepa P3215, P132 y Post de
estudio dentro del clado de especies estrechamente relacionadas P. ostreatus y P.
floridanuss. El estudio molecular de las cepas corroboro su descripción morfológica

CAPITULO V
RECOMENDACIONES
Se requiere la constitución de un mico-cepario de hongos comestibles del géneo Pleurotus
spp., que incluya cepas importadas y aislados autóctonos; dicho material debe ser
caracterización desde el punto de vista morfologíco y anatomico del micelio vegetativo y los
cuerpos reproductivo, fisiologíco evaluando su desarrollo en diferentes medios de cultivo, a
temperaturas, pH, luz y humedad; y identificación molecular por medio de diferentes
marcadores moleculares a parte de la región ITS 1 a ITS2; buscando así la aplicabilidad
biotecnologíca del cepario.
El análisis de filogenético de la región ITS1 a ITS2 de las cepas del genero Pleurotus spp.
presentes en el Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos SIXTO DAVID ROJO,
revelo una incertidumbre para identificación de especie, por lo cual se recomienda ampliar la
recolección de estos recursos genéticos y repetir este tipo de análisis junto a otros
marcadores moleculares como el gen del factor de elongación de la traducción 1 (EF1), los
tres tipos de ARNr [18S (subunidad pequeña ARN-SSU), 5.8S y 28S (subunidad grande ARN-
LSU)]; el de la ARN polimerasa II (RPB2) para lograr una identificación definitiva de las cepas
de estudio, tal como lo sugieren varios autores (Lutzoni et al.,2004; Marongiu et al., 2005;
White et al.,1990), además de evaluar el conocimiento tradicional de estos en las
comunidades y llevar a cabo pruebas de compatibilidad genética con el resto a los 15
grupos interestériles hasta ahora descritos para el género Pleurotus sp. (Vilgalys et al.,
1996), lo cual confirmará la identidad del material aislado y evaluara la posibilidad de especie
genéticamente aislada e interestéril con el resto de los miembros de esta taxa, a partir del
concepto biológico de especie.

CAPITULO V
RECOMENDACIONES
El uso de las regiones ITS rDNA no fueron suficientes para una identificación definitiva entre
especies estrechamente relacionadas, por lo cual se concluye que es necesario la realización
de estudios adicionales de métodos convencionales y diferentes marcadores moleculares
para llegar a una identificación certera. Por último, se recomienda la revisión de las especies
estrechamente relacionadas para lograr una correcta anotación tanto de las secuencias como
de las estructuras secundarias que permitan una diferenciación correcta entre estas especies,
estableciendo límites claros entre ellas.

AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento al MSc. Balmore Guerrero asesor de mi trabajo especial de grado. Así
como a los profesores Dr. Julio Otoniel Rojas, Dr. Juan Gabridia y Dr. Pablo García, por formar parte del comité de este
trabajo, por sus valiosas sugerencias de interés, en la revisión del presente trabajo.
A la Universidad de los Andes, Mérida Venezuela; específicamente a todo el personal del Laboratorio de Biotecnología
de Microorganismos “SIXTO DAVID ROJO”, a los profesores Julio Otoniel Rojas, Pablo García, Zarack Chacón,
Balmore Guerrero; a la vigilancia, Gleydi Uzcategui; a los técnicos Jesús Pacheco y Flormery Bracho; a los Investigadores,
estudiantes de pregrado y postgrado Yzoleth Torres, Osman Morillo, Racely Sánchez, Datty Rosales, Alexis Sambrano y
Ana Díaz por su amistad y apoyo durante la realización de esta investigación.
Al investigador independiente el Dr. José David Rosales Rangel por su interés en la realización de esta investigación y su
colaboración en el uso de la herramientas de bioinformática.
Al Laboratorio de Biodiversidad y Variabilidad Molecular adscrito al Instituto Jardín botánico de Mérida a los Mgs.
Arnaldo Moguera y Mgs. Romina Ruiz por proporcionarme todos las bases fundamentales en las técnicas de purificación
de productos de PCR.
Al Laboratorio De Genética Y Química Celular (Gequimcel), a la Lic. Sophie Dulhoste y Lic. Sonia Morales por
proporcionarme todos las bases fundamentales en la biología molecular y el apoyo en la ejecución de esta investigación.
A todos y cada uno de mis compañeros en la Facultad de Ciencias, con especial cariño, respeto, agradecimiento y
admiración para Amelia Guerrero, Nayari Valero, Luis Mora, Luz Amira, Astrid Davila y Jose Gregorio Contreras.
A mis 2 grandes preparadores Roberto Torrealba de Matemática 20 y Juan Pablo Bracho de Genética 1, y a todos los
profesores de la Facultad de Ciencias por el apoyo y la formación durante todo el tiempo de realización de mis estudios de
pregrado.

DEDICATORI
A
A mí querida Mamá:
Leticia del Carmen Mogollón Piñango
Quien siempre ha luchado por darme lo mejor, y ha sido un ejemplo de rectitud, constancia,
respeto, educación y superación personal, además por todo su cariño con el que me ha
formado. Y porque siempre ha sido partícipe de mi desarrollo personal.
A mi hermano:
Esteban Ricardo Chalbaud Mogollón
Con quien he compartido gran parte de mi vida, a quien agradezco su gran paciencia, cariño y
ejemplo de constancia, y por estar presente en los momentos más difíciles.
Al Dr. Pedro Serena
Quien siempre me dio un ejemplo de fortaleza, principios, respeto, educación y superación
personal.
Gracias a su apoyo y confianza que fueron parte fundamental para la realización de esta meta
en mi vida.

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