Análisis de secuencias del gen 16S usando Bioedit y BLAST

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL
Título:
“Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S”
Curso:
BIOTECNOLOGÍA
Estudiante:
QUISPE CUTIPA, HOLGUER
Docente:
DR. HEBERT H. SOTO GONZALES
ILO
SEPTIEMBRE DEL 2021

Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S
1
Introducción
Indudablemente el estudio de secuenciación del ADN ha tenido mucha importancia en la
biotecnología, y las tecnologías que se aplican en estos estudios no ha parado de
desarrollarse. Sumando el aumento meteórico de la información sobre secuencias de
ADN no tiene más remedio que ir hacia arriba (Mardis, 2008).
Ahora bien, la era digital propuso hace décadas una herramienta que ha repercutido
favorablemente la ciencia biotecnológica, DATABANKS. Ofrece a los usuarios
ocasionales y a los expertos una puerta de entrada directa y actualizada a la creciente red
de bancos de datos, lo que permite un acceso cómodo a una amplia gama de datos y
servicios (Kreil & Etzold, 1999).
Mas específico, BLAST es, sin duda, el software más importante que se ha escrito para
las ciencias biológicas (White et al., 2011). La rápida expansión de los datos de secuencias
de nucleótidos disponibles en bases de datos públicas está revolucionando la
investigación biomédica (Pandey & Lewitter, 1999). Es el núcleo de la mayoría de los
flujos de trabajo bioinformáticos, siendo un componente crítico de las búsquedas de
homología del genoma y de la anotación (White et al., 2011).
Estas herramientas no son eficaces por si solas y por ello existen otros softwares que
facilitan su uso como es el caso de Bioedit.
Bioedit es un software libre que permite la lectura de las secuencias de ADN por medio
de cromatogramas y con ella su posterior identificación, tal como trabajaron (Premzl,
2018), (Zhang et al., 2019), (Kanata et al., 2019).
Estas tecnologías proporcionarán una aplicaciones que van desde la inmunoprecipitación
de la cromatina, el mapeo de mutaciones y el descubrimiento de polimorfismos hasta el
descubrimiento de ARN no codificante (Mardis, 2008).

2
Objetivos:
- Revisar los fundamentos de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos.
- Efectuar el análisis y la selección de electroferogramas automatizados de
secuenciación mediante la aplicación de software libre BIOEDIT en específico el
estudio del gen ribosomal 16S.
Materiales y métodos:
Materiales
- Laptop: Permite ejecutar los softwares y herramientas necesarias.
- BLAST: Encuentra regiones de similitud entre secuencias biológicas. El
programa compara las secuencias de nucleótidos o proteínas con las bases de datos
de secuencias y calcula la significación estadística (BLAST: Basic Local Alignment
Search Tool (nih.gov)).
- Bioedit 7.2.5: Editor y análisis de alineación de secuencias biológicas.
- Excel: Hoja de cálculo digital. (Software de hojas de cálculo Microsoft Excel |
Microsoft 365).
Métodos
Análisis de cromatogramas a través de Bioedit
Las muestras de formato AB1 proporcionados por el docente (Ilustración 1) se analizaron
en el programa Bioedit 7.2.5 (Ilustración 2). De esta forma, se puede analizar la calidad
de las secuencias de nucleótidos y posteriormente realizar la exportación en formato Fasta
(Ilustración 3 e Ilustración 4).
Las exportaciones se abren en el bloc de notas el cual te permite editar las secuencias que
posean excesos de errores (Ilustración 5 e Ilustración 6). Si no es el caso se puede copiar
directamente todo el texto para su análisis en el BLAST.

3
Análisis de secuencia de nucleótidos
El texto copiado pasa a pegarse en el cuadro de texto de BLAST del NCBI (Ilustración
7), luego se seleccionan los parámetros de búsqueda, en este caso “cualquier secuencia
similar”, finalmente presionamos BLAST y esperamos los resultados (Ilustración 8).
Resultados
Los resultados obtenidos de cada muestra fueron recopilados en la siguiente tabla.
Tabla 1
Resultados de análisis de nucleótidos
Muestra Código
Calidad de la secuencia Tamaño
de la
secuencia
Organismo
Porcentaje
de
identidad
Mala Regular Buena
1 A07_1H_01 X 978 NOT FOUND -
2 A08_9H_02 X 729 Herbaspirillum seropedicae 88.73
3 A09_1_01 X 280 Pseudomonas putida 83.21
4 A10_9_02 X 674 uncultured bacterium 86.14
5 A11_17_01 X 1163 NOT FOUND -
6 B07_2H_03 X 629
Stenotrophomonas sp.
UYSB32
75.78
7 B08_10H_04 X 575 Leclercia adecarboxylata 87.55
8 B09_2_03 X 626 Klebsiella grimontii 82.35
9 B10_10_04 X 669 Enterobacter soli 71.76
10 B11_18_03 X 617
uncultured Pseudomonas
sp.
72.62
11 C07_3H_05 X 748 Leclercia adecarboxylata 91.9
12 C08_11H_06 X 749 Enterobacter mori 91.07
13 C09_3_05 X 743 Phytobacter diazotrophicus 86.58
14 C10_11_06 X 767
uncultured Pseudomonas
sp.
69.01
15 C11_19_05 X 666 Klebsiella aerogenes 65.62
16 D07_4H_07 X 679 uncultured bacterium 90.18
17 D08_12H_08 X 697 Staphylococcus sp. US-13 84.27
18 D09_4_07 X 741 Phytobacter diazotrophicus 88.43
19 D10_12_08 X 668 Pseudomonas putida 81.82
20 E07_5H_09 X 769 NOT FOUND -
21 E08_13H_10 X 657
Paraburkholderia
silvatlantica
79.97
22 E09_5_09 X 981
Enterobacter hormaechei
subsp. xiangfangensis
85.02
23 E10_13_10 X 774 uncultured bacterium 67.47
24 F07_6H_11 X 619 Enterobacter ludwigii 95.89
25 F09_6_11 X 610 Klebsiella sp. 83.76
26 F10_14_12 X 1204 NOT FOUND -
27 G07_7H_13 X 566 Enterobacter sp. ICBR 189 93.17
28 G09_7_13 X 615 uncultured Enterobacter sp. 73.78
29 G10_15_14 X 657 Enterobacter cloacae 96.28
30 H07_8H_15 X 1100 NOT FOUND -

4
Muestra Código
Calidad de la secuencia Tamaño de
la
secuencia
Organismo
Porcentaje
de identidad
Mala Regular Buena
31 H09_8_15 X 1262 NOT FOUND -
32 H10_16_16 X 656 Enterobacter sp. IICDBZ9 84.42
33 419NZ_A01_01 X 810 Klebsiella michiganensis 74.54
34 526NZ_B01_03 X 807 Klebsiella variicola 85.85
35 419AZ_C01_05 X 733 Klebsiella sp. MPUS7 97.3
36 88NZ_D01_07 X 755 Klebsiella pneumoniae 94.44
37 88AZ_E01_09 X 644 Klebsiella pneumoniae 95.32
38 526Y1_F01_11 X 338 Klebsiella pneumoniae 95.91
39 419Y1_G01_13 X 293 Enterobacter sp. WF14-6 98.61
40 375H_H01_15 X 568 Klebsiella oxytoca 73.75
41 419YZ_A02_02 X 315 Enterobacter sp. CB7 95.81
42 88H_B02_04 X 523
endosymbiont of
Sphenophorus levis
72.46
43 375NZ_C02_06 X 233 uncultured bacterium 82.02
44 526YZ_D02_08 X 318 Klebsiella sp. BR3357 92.25
45 483NZ_E02_10 X 562 Enterobacter cloacae 91.06
46 483H_F02_12 X 504 Enterobacter hormaechei 89.33
47 456NZ_G02_14 X 559 bacterium EAB-F8.08 95.89
48 01_A03_01 X 663 Kosakonia radicincitans 81.6
49 02_B03_03 X 720 uncultured soil bacterium 71.52
50 03_C03_05 X 539 Klebsiella pneumoniae 75.71
51 04_D03_07 X 570 Kosakonia oryzae 81.93
52 05_E03_09 X 518 Enterobacter sp. 93.26
53 06_F03_11 X 1347 NOT FOUND -
54 07_G03_13 X 1185 NOT FOUND -
55 08_H03_15 X 991 uncultured bacterium 72.17
56 09_A04_02 X 1163 NOT FOUND -
57 10_B04_04 X 677 Achromobacter sp. 77.29
58 11_C04_06 X 597 Enterobacter cloacae 72.58
59 12_D04_08 X 442
Enterobacteriaceae
bacterium HGH0104
85.71
60 13_E04_10 X 377 NOT FOUND -
61 14_F04_12 X 350 Pantoea deleyi 78.05
62 15_G04_14 X 656 Klebsiella sp. 90.53
63 16_H04_16 X 626 Kosakonia sacchari 77.49
64 1Y2_F04_12 X 423 Kosakonia radicincitans 79.2
65 2Y2_G04_14 X 570 Herbaspirillum sp. 86.75
66 3Y2_H04_16 X 478 Klebsiella sp. MB42 79.04
67 17_A04_02 X 500 NOT FOUND -
68 18_B04_04 X 377 Enterobacter sp. 84.93
69 19_C04_06 X 654 Pseudomonas aeruginosa 74.74
70 20_D04_08 X 369 Klebsiella sp. SI-Ar(M)-B1 78.14
71 21_E04_10 X 866 uncultured bacterium 74.24
Nota: De 71 muestras en 11 no se encontraron resultados a la hora del BLAST, 43 muestras fueron de mala
calidad (60.56%), 20 de calidad regular (28.16%) y 8 de buena calidad (11.28%). El organismo más
identificado fue uncultured bacterium (6) seguido de enterobacter cloacae (3). El mayor porcentaje de
identidad lo alcanzó el organismo Enterobacter sp. WF14-6 con 98.61%.

5
Conclusiones
Se revisó los fundamentos de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos y se
encuentra que la actual tecnología (tercera generación) permite secuenciar con una
facilidad y rapidez que antes nunca se tuvo permitiendo que la biotecnología se desarrolle
a pasos gigantes.
Se efectuaron el análisis y la selección de electroferogramas automatizados de
secuenciación mediante la aplicación de so ftware libre BIOEDIT que mostró lo variedad
de calidad en los resultados de las muestras, posterior al análisis de electroferogramas se
hizo un análisis en BLAST que permitió identificar a los organismos en la mayoría de las
muestras pero que sin embargo 11 de ellas tenían muy mala calidad y por lo tanto no se
encontró identificación alguna.

6
Referencias
Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.
Kanata, E., Llorens, F., Dafou, D., Dimitriadis, A., Thüne, K., Xanthopoulos, K., Bekas,
N., Espinosa, J. C., Schmitz, M., Marín-Moreno, A., Capece, V., Shormoni, O.,
Andréoletti, O., Bonn, S., Torres, J. M., Ferrer, I., Zerr, I., & Sklaviadis, T. (2019).
RNA editing alterations define manifestation of prion diseases. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 116(39), 19727–
19735. https://doi.org/10.1073/pnas.1803521116
Kreil, D. P., & Etzold, T. (1999). DATABANKS - A catalogue database of molecular
biology databases. Trends in Biochemical Sciences, 24(4), 155–157.
https://doi.org/10.1016/S0968-0004(99)01363-8
Mardis, E. R. (2008). The impact of next-generation sequencing technology on genetics.
Trends in Genetics, 24(3), 133–141. https://doi.org/10.1016/j.tig.2007.12.007
Pandey, A., & Lewitter, F. (1999). Nucleotide sequence databases: A gold mine for
biologists. Trends in Biochemical Sciences, 24(7), 276–280.
https://doi.org/10.1016/S0968-0004(99)01400-0
Premzl, M. (2018). Comparative genomic analysis of eutherian adiponectin genes.
Heliyon, 4(6), e00647. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2018.e00647
White, J., Matalka, M., Fricke, W. F., & Angiuoli, S. (2011). Cunningham: a BLAST
Runtime Estimator. Nature Precedings, December, 1–6.
https://doi.org/10.1038/npre.2011.5593.2
Zhang, X., Haro von Mogel, K. J., Lor, V. S., Hirsch, C. N., de Vries, B., Kaeppler, H.
F., Tracy, W. F., & Kaeppler, S. M. (2019). Maize sugary enhancer1 (se1) is a
gene affecting endosperm starch metabolism. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 116(41), 20776–20785.
https://doi.org/10.1073/pnas.1902747116

7
Anexos
Ilustración 1
Archivos AB1 proporcionados por el docente.
Fuente: Elaboración propia
Ilustración 2
Software Bioedit 7.2.5 realizando la lectura del archivo AB1.
Nota: El recuadro rojo muestra la zona de lectura de la secuencia de nucleótidos, la cual se
analiza visualmente para determinar su calidad.

8
Ilustración 3
Exportación de resultados en formato fasta.
Ilustración 4
Guardado de resultados en formato fasta en una carpeta designada
Nota: Se recomienda crear una carpeta nueva para guardar estos archivos y también que los
archivos generados se codifiquen con su mismo código inicial para organizar de la mejor forma
los archivos.

9
Ilustración 5
Ejecución de archivos fasta en Bloc de notas
Ilustración 6
Edición de secuencia para mejores resultados
Nota: Se recomienda borrar parte del texto donde se observe errores comunes de secuenciación,
se identifica fácilmente pues la letra N aparece de forma excesiva, normalmente suele darse al final
de la secuencia. Finalmente se copia el texto editado.

10
Ilustración 7
Blasteado de la secuencia de nucleótidos en la web de BLAST del NCBI.
Nota: El texto seleccionado del bloc de notas se pegaría en la zona del recuadro rojo y
posteriormente se puede optimizar los niveles de búsqueda (cuadro verde), finalmente presionar
en BLAST para ver los resultados.
Ilustración 8
Resultados del BLAST.
Nota: El tamaño de la muestra se observa en el recuadro azul, el organismo identificado en el
recuadro rojo y porcentaje de identidad (similitud) en el recuadro verde.

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