identificacion_serotipificacion_shigella

1. Costa Rica, 26 de abrilCosta Rica, 26 de abril –– 2 de mayo 20092 de mayo 2009
Elena Campos ChacElena Campos Chacóónn
Centro Nacional de Referencia en BacteriologCentro Nacional de Referencia en Bacteriologííaa
INCIENSAINCIENSA –– Costa RicaCosta Rica
Aislamiento, identificaciAislamiento, identificacióón bioqun bioquíímicamica
y tipificaciy tipificacióón den de ShigellaShigella
I Curso Avanzado WHO Global Salmonella Surveillance

2. IntroducciIntroduccióónn
ShigellaShigella: Familia: Familia EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceae
BacilosBacilos GramGram negativosnegativos (0.3(0.3 –– 11 µµm de dim de diáámetro y 1metro y 1 –– 66 µµm de longitud)m de longitud)
No mNo móóviles, noviles, no esporuladosesporulados, anaerobios facultativos, anaerobios facultativos
Oxidasa (Oxidasa (--), fermentan glucosa y otros), fermentan glucosa y otros
carbohidratos sin produccicarbohidratos sin produccióón de gas, RM (+)n de gas, RM (+)
Bastante inactivos:Bastante inactivos:
VP (VP (--), citrato (), citrato (--), H), H22S (S (--),),
LDC (LDC (--), ADH (), ADH (--), ureasa (), ureasa (--))
CrecimientoCrecimiento óóptimo:ptimo: 3737°°CC

3. EspecieEspecie SerogrupoSerogrupo SerotiposSerotipos ObservacionesObservaciones
dysenteriaedysenteriae AA 1212 SerotipoSerotipo 11 (bacilo de(bacilo de
ShigaShiga): forma m): forma máás graves grave
(20% letalidad)(20% letalidad)
flexneriflexneri BB 1414 MMáás coms comúún en pan en paíísesses
subsub--desarrolladosdesarrollados
boydiiboydii CC 1818 Se aSe aíísla con menorsla con menor
frecuenciafrecuencia
sonneisonnei DD 11 MMáás coms comúún en pan en paíísesses
desarrolladosdesarrollados
GGééneronero ShigellaShigella

4. Calidad de la muestra de hecesCalidad de la muestra de heces
para estudio depara estudio de ShigellaShigella
Recolectar en el perRecolectar en el perííodo agudo de la enfermedadodo agudo de la enfermedad
Antes de inicio de la antibioticoterapiaAntes de inicio de la antibioticoterapia
Muestra:Muestra:
HecesHeces
Hisopado rectalHisopado rectal
Hisopado fecalHisopado fecal
Iniciar procesamiento durante las dos horasIniciar procesamiento durante las dos horas
despudespuéés de recolectada, de lo contrario, colocars de recolectada, de lo contrario, colocar
en Medio Cary Blair +en Medio Cary Blair + tioglicolatotioglicolato y mantenery mantener
refrigeradorefrigerado (hasta por 5 d(hasta por 5 díías)as)

5. Aislamiento deAislamiento de ShigellaShigella a partir dea partir de
muestras clmuestras clíínicas*nicas*
DDíía 1a 1::
•• ObservaciObservacióón microscn microscóópica de las hecespica de las heces
•• Inocular caldo de enriquecimiento (GN)Inocular caldo de enriquecimiento (GN)
•• Sembrar muestra en medios inhibidoresSembrar muestra en medios inhibidores
para bacteriaspara bacterias GramGram negativas:negativas:
•• AgarAgar McConkeyMcConkey
•• Agar SSAgar SS
•• Agar xilosaAgar xilosa--lisinalisina--desoxicolatodesoxicolato (XLD)(XLD)
•• Incubar a 37Incubar a 37°°CC por 18por 18--24 horas24 horas
* WHO Global* WHO Global SalmSalm SurvSurv. 2007. Manual de Procedimientos: Diagn. 2007. Manual de Procedimientos: Diagnóóstico y caracterizacistico y caracterizacióón den de ShigellaShigella spp.spp.
INEI / GlobalINEI / Global SalmSalm SurvSurv / OPS/ OPS -- OMSOMS

6. Aislamiento deAislamiento de ShigellaShigella a partir dea partir de
muestras clmuestras clíínicasnicas
Agar SalmonellaAgar Salmonella--ShigellaShigellaAgarAgar McConkeyMcConkey Agar XLDAgar XLD
DDíía 2a 2::
•• Seleccionar 2 o 3 colonias sospechosasSeleccionar 2 o 3 colonias sospechosas

7. DDíía 2a 2:: Inocular colonias sospechosas enInocular colonias sospechosas en agaresagares
•• TSITSI
•• LIALIA
•• TSATSA
Aislamiento deAislamiento de ShigellaShigella a partir dea partir de
muestras clmuestras clíínicasnicas

8. TSITSI LIALIA
DDíía 3a 3:: Realizar la lectura de lasRealizar la lectura de las
pruebas bioqupruebas bioquíímicas:micas:
•• Si TSI y LIA dan resultados compatiblesSi TSI y LIA dan resultados compatibles
concon ShigellaShigella::
•• Sembrar pruebas bioquSembrar pruebas bioquíímicasmicas
complementarias:complementarias:
•• ODC, LDC, manitol, ONPG,ODC, LDC, manitol, ONPG, indolindol,,
acetato,acetato, mucatomucato, citrato, citrato ChristensenChristensen,,
malonatomalonato
•• API oAPI o VitekVitek
•• Realizar la tipificaciRealizar la tipificacióón somn somáática atica a
partir del crecimiento en TSApartir del crecimiento en TSA
Aislamiento deAislamiento de ShigellaShigella a partir dea partir de
muestras clmuestras clíínicasnicas

9. CaracterCaracteríística bioqustica bioquíímicamica ShigellaShigella EscherichiaEscherichia
Acetato de sodioAcetato de sodio -- +, (+)+, (+)
Citrato deCitrato de ChristensenChristensen -- +, (+),+, (+), --
MucatoMucato -- ++
IndolIndol -- o +o + ++
MovilidadMovilidad -- +,+, --
LisinaLisina decarboxilasadecarboxilasa -- +, (+),+, (+), --
Gas de glucosaGas de glucosa -- ++
DiferenciaciDiferenciacióón de los gn de los géénerosneros
ShigellaShigella yy EscherichiaEscherichia
SerotiposSerotipos con caractercon caracteríísticas bioqusticas bioquíímicas atmicas atíípicas:picas: S.S. flexneriflexneri 3a3a yy varvar xx ((indolindol +),+),
S.S. flexneriflexneri 4b4b (acetato +),(acetato +), S.S. flexneriflexneri 66 (manitol(manitol --))

10. EspecieEspecie ManitolManitol ONPG*ONPG* OrnitinaOrnitina
decarboxilasadecarboxilasa
S.S. dysenteriaedysenteriae -- -- --
S.S. dysenteriaedysenteriae 11 -- ++++
reaccireaccióón rn ráápidapida
--
S.S. flexneriflexneri ++ -- --
S.S. boydiiboydii ++ -- --
S.S. sonneisonnei ++ ++ ++
DiferenciaciDiferenciacióón bioqun bioquíímica de lasmica de las
especies deespecies de ShigellaShigella
* ONPG: orto* ONPG: orto--nitrofenilnitrofenil galactgalactóósidosido

11. CaracterizaciCaracterizacióón bioqun bioquíímica demica de ShigellaShigella
Algunos equiposAlgunos equipos
automatizados (automatizados (VitekVitek) y) y
miniaturizados (API) deminiaturizados (API) de
identificaciidentificacióón bacteriana,n bacteriana,
sugieren la especie; sinsugieren la especie; sin
embargo, el reporteembargo, el reporte
establece la necesidad deestablece la necesidad de
confirmar la especie conconfirmar la especie con
pruebas serolpruebas serolóógicasgicas

12. CaracterizaciCaracterizacióón seroln serolóógica degica de ShigellaShigella
•• Se debe realizarSe debe realizar
úúnicamente en organismosnicamente en organismos
bioqubioquíímicamentemicamente
compatibles concompatibles con ShigellaShigella
•• Permite evidenciar losPermite evidenciar los
antantíígenos somgenos somááticosticos
(polisac(polisacááridos del LPS) de laridos del LPS) de la
membrana externamembrana externa

13. AglutinaciAglutinacióón:n: organismoorganismo (ant(antíígeno)geno) + suero inmune+ suero inmune (anticuerpo).(anticuerpo).
SerotipificaciSerotipificacióónn dede ShigellaShigella
Si el suero contieneSi el suero contiene aglutininasaglutininas contra la bacteria se produce rcontra la bacteria se produce ráápidamentepidamente
una aglutinaciuna aglutinacióón fuerte, firme y granularn fuerte, firme y granular
•• Cultivo frescoCultivo fresco (24 horas)(24 horas)
•• Control de aglutinaciControl de aglutinacióónn
(soluci(solucióón salina 2%)n salina 2%)

14. AntisuerosAntisueros NomenclaturaNomenclatura Aglutina con:Aglutina con:
S.S. dysenteriaedysenteriae OShAOShA (I(I--)) SerotiposSerotipos indolindol ((--): 1, 3, 4, 5, 6, 9 y 10): 1, 3, 4, 5, 6, 9 y 10
OShAOShA (I+)(I+) SerotiposSerotipos indolindol (+): 2, 7 y 8(+): 2, 7 y 8
AntiAnti--S.S. dysenteriaedysenteriae 11 S.S. dysenteriaedysenteriae tipo 1 (Bacilotipo 1 (Bacilo ShigaShiga))
S.S. flexneriflexneri OShBOShB 11 Con cada uno de los 6Con cada uno de los 6 serogruposserogrupos yy
antisueros monovalentes para losantisueros monovalentes para los serotiposserotipos
de cadade cada serogruposerogrupoOShBOShB 22
OShBOShB 33
OShBOShB 44
OShBOShB 55
OShBOShB 66
Antisueros empleados para la serotipificación del
género Shigella*
* Antisueros del Instituto Nacional de Producci* Antisueros del Instituto Nacional de Produccióón de Bioln de Biolóógicosgicos –– ANLISANLIS ““Carlos G.Carlos G. MalbrMalbráánn””, Argentina, Argentina

15. AntisuerosAntisueros NomenclaturaNomenclatura ReacciReaccióón esperadan esperada
S.S. sonneisonnei OShDOShD Aglutina conAglutina con ShigellaShigella sonneisonnei
S.S. boydiiboydii OShCOShC (I(I--)) AglutnaAglutna loslos serotiposserotipos indolindol ((--):):
1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 y 141, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 y 14
OShCOShC (I+)(I+) AglutnaAglutna loslos serotiposserotipos indolindol (+):(+):
5, 7, 9, 11, 13, 155, 7, 9, 11, 13, 15
* Antisueros del Instituto Nacional de Producci* Antisueros del Instituto Nacional de Produccióón de Bioln de Biolóógicosgicos –– ANLISANLIS ““Carlos G.Carlos G. MalbrMalbráánn””, Argentina, Argentina
…Antisueros empleados para la serotipificación del género Shigella*

16. FlujogramaFlujograma parapara serotipificaciserotipificacióónn dede ShigellaShigella
Colonia con caracterColonia con caracteríísticassticas
BQ deBQ de ShigellaShigella
Cepa rugosaCepa rugosa
+
100100°°CC / 15/ 15 –– 30 min.30 min.
S.S. flexneriflexneri
Aglutinar con antisueros paraAglutinar con antisueros para serotiposserotipos 11 –– 66
S.S. sonneisonnei
S.S. boydiiboydii
Aglutinar conAglutinar con C (IC (I--)) parapara serotiposserotipos indolindol --
y cony con C (I+)C (I+) parapara serotiposserotipos indolindol ++
S.S. dysenteriaedysenteriae
Aglutinar conAglutinar con A (IA (I--)) parapara serotiposserotipos indolindol -- y cony con A (I+)A (I+) parapara serotiposserotipos
indolindol ++ y con antisuero monovalentey con antisuero monovalente antianti-- S.S. dysenteriaedysenteriae 11
+
+
+
+
-
OShB
OShD
OShC
OShA
-
-
-
SS 2%
-
100100°°CC / 15/ 15 –– 30 min.30 min.
AglutinaAglutina
100100°°/5 min./5 min.
sucesivossucesivos
hasta x 30hasta x 30 minmin
+
--
ReportarReportar
ShigellaShigella spp.spp.
+

17. ID segID segúún API 20E on API 20E o VitekVitek Antisuero a probarAntisuero a probar
VitekVitek:: S.S. boydiiboydii // flexneriflexneri OShBOShB
OShCOShC (I(I--))
OShCOShC (I+)(I+)
VitekVitek:: S.S. dysenteriaedysenteriae
API:API: ShigellaShigella spsp.. (48%), manitol ((48%), manitol (--))
OShBOShB
((S.S. flexneriflexneri 6)6)
API:API: ShigellaShigella spp.spp. OShBOShB
OShDOShD
API:API: E.E. colicoli ((83%)83%) -- ShigellaShigella spp.spp. (8%),(8%),
acetato (acetato (--),), indolindol (+)(+)
OShBOShB
(S.(S. flexneriflexneri 3a o variante x)3a o variante x)
ShigellaShigella:: antisueros a probar segantisueros a probar segúún lan la
especie sugerida porespecie sugerida por VitekVitek / API/ API

18. IdentificaciIdentificacióónn
(API, Bioqu(API, Bioquíímicamica convconv))
FlujogramaFlujograma
Aislamiento e identificaciAislamiento e identificacióón den de
ShigellaShigella en muestras clen muestras clíínicasnicas
Aislamiento primarioAislamiento primario
Seccionar coloniasSeccionar colonias
sospechosassospechosas
TipificaciTipificacióónn PSAPSA

19. La Carpintera, Tres RLa Carpintera, Tres Rííos, Costa Ricaos, Costa Rica