Fundamentos de la técnica de PCR para Métodos Moleculares

1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Licenciatura en Biología
Métodos Moleculares
Fundamentos de la técnica de
PCR
Ordoñez Urbano Luis Damián

2. Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR)
 1993 PN 1986
 Objetivo es obtener un gran
número de copias de un
fragmento de DNA, partiendo
de un mínimo.
 A partir de un fragmento
original o molde.
• Diagnóstico de enfermedades genéticas o
infecciosas
• Detección de mutaciones
• Identificar cadáveres
• Pruebas de paternidad
• Investigación Científica

3. Reacción enzimática in vitro que
amplifica millones de veces una
secuencia especifica de DNA.
Aprovechara la
actividad de la enzima
DNA polimerasa
Sin recurrir a la clonación en un
vector y su replicación en
bacterias (Clonado molecular).
DNA polimerasa de Escherichia coli
Enzima desactivada por
desnaturalización.
Thermus aquaticus
Bacteria termófila
Actúa eficientemente
entre 75° y 80°C
Y resiste más de 2hrs a
93°C
Pyrococcus furiosus (Pfu)
Thermococcus litoralis (Vent)
Thermus termophilus (Tth).

4. Que necesitamos?
 Taq Polimerasa
 DNA molde (Contiene la región que se va amplificar)
 Primers. Entre 15 a 22pb (Delimitan la zona a amplificar, nucleótidos que
definen los extremos de la secuencia que se desea replicar)
- Forward o sentido
- Reverse o antisentido
 Desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP´s): Bases nitrogenadas que se utilizan
para formar nuevas cadenas de DNA
 Buffer. MgCl2 Actúa como cofactor de la Polimerasa, Tris-HCL (Mantiene el pH
adecuado para el funcionamiento de la Taq polimerasa).
 H2O

5.  Ciclos de aumento y descenso de
temperatura automatizado.
 Tubos que contienen la mezcla de
reactivos (MM) pared fina, lo que
favorece la conductividad térmica.
 Se pueden programar el número de
ciclos, la temperatura de la fase de
alineamiento de acuerdo a la
eficiencia con la que se amplifica cada
gen en especifico.
 Sistema “Tapa caliente”, se aplica
calor arriba del vial para evitar la
condensación y perdida de la muestra,
anteriormente utilizaban aceite

6. Etapas
 Serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos
 Cada ciclo suele consistir en 3 pasos a diferentes temperaturas
1° Desnaturalización
2° Alineamiento (Unión del cebador, Hibridación, anillado)
3° Elongación (Extensión, polimerización)

7. Desnaturalización Aumento de temperatura a 95°C
 Desnaturalización del DNA por ruptura de los puentes de
hidrogeno
 20 a 30 s Si la cantidad de GC es alta será necesario más
tiempo para romper sus uniones
 Típicamente se expone el DNA a 95°C durante 30s o a 97°C
por 15s
 Mayor temperatura – perdida de la actividad de la Taq.
 Menor temperatura - desnaturalización incompleta – se aparea
nuevamente las hebras de DNA, reducción de rendimiento del
producto.

8. Alineamiento
 Se baja la temperatura de entre 55 a 65°C
 Facilitara la unión de los primers a las cadenas.
 Temperatura depende de tamaño, composición y concentración de los primers
amplificadores

9. Extensión Se efectúa a 72°C.
 Temperatura a la cual la Taq lleva a cabo su
acción de manera optima.
 Inserta los dNTPs a la cadena molde de 5´ a 3´
Productos final= Amplicon
tendrá un tamaño (número
total de pares de bases)
especifico.

10. Amplicones son
visualizados a
través de una
electroforesis en
gel de agarosa…

11. Bibliografía
 Mas E., Julio P., Jesús C., Pilar Z., Rosario O. y Clementina R.. 2001.
Fundamentos de la PCR. Universidad de Zaragoza. Consultado el 1/ 03/18
disponible en:
http://www.revistaaquatic.com/aquatic/html/art1501/basespcr.htm
 Cortazar A. y Patricia S.. 2004. Métodos fisicoquímicos en Biotecnología PCR.
UNAM. . Consultado el 1/ 03/18 disponible en:
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/pcr.pdf
 Tamay de Dios L., Ibarra C. y Velasquillo C.. Fundamentos de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) Investigación en Discapacidad. Volumen 2
Número 2 Mayo-Agosto 2013. . Consultado el 1/ 03/18 disponible en:
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf