El protocolo de laboratorio describe los pasos para identificar y diagnosticar la granulomatosis de Wegener mediante la determinación de anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) usando inmunofluorescencia indirecta. Incluye marcar las muestras, preparar reactivos, añadir las muestras y controles a los pocillos, lavar, incubar con conjugado fluorescente, observar bajo microscopio de fluorescencia e interpretar los resultados para diagnosticar la granulomatosis de Wegener o glomerulonefritis rápidamente progresiva

1. PROTOCOLO DE LABORATORIO PARA LA IDENTIFICACIÓN Y
DIAGNÓSTICO DE GRANULOMATOSIS DE WEGENER
Marcar tubo de muestra con
los datos correspondientes del
paciente.
IDENTIFICACIÓN
Solicitud médica:determinación
de anticuerpos anticitoplasma
de neutrófilos (ANCA).
Procedimiento:
Inmunofluorescencia Indirecta.
Kit:NOVA Lite® ANCA
Anti-neutrophil Cytoplasmic
Autoantibody Reagents.
Llevar todos reactivos y
muestras a la temperatura
ambiente (20-26°C) y agitar.
Recepción de la muestra
Área de Inmunología
Marque y coloque el portaobjetos
con substrato en una cámara
húmeda adecuada.
Añada 20-25 uL de control positivo y
negativo sin diluir en los pocillos 1 y
2 respectivamente. Añada 20-25 uL
de la muestra del paciente diluida a
los pocillos restantes.
Incubar durante 30 minutos en una
cámara húmeda.
Con una pipeta lavar suavemente
el suero con el tampón de PBS II
diluido, con el fin de que no dañar
el substrato.
Expulse ( con un golpe
seco y fuerte) el exceso
de tampón PBS II.
Incubar durante 30 minutos
en una cámara húmeda.
Cubra inmediatamente cada
pocillo con una gota de
conjugado fluorescente.
Repetir el lavado con el tampón de
PBS II diluido.
Elimine el exceso de tampón PBS II y ponga en contacto
del borde inferior del portaobjetos con el borde del
cubreobjetos. Deje caer suavemente el portaobjetos
sobre el cubreobjetos de forma que el medio de montaje
fluya hacia el borde superior del portaobjetos sin que se
formen burbujas de aire ni se queden atrapadas.
Muestra: Suero
Nombre_____________________
Fecha____________I.D_________
Diluya el concentrado de PBS II a 1:40
añadiendo el contenido de la botella
de concentrado de PBS II a 975mL de
agua destilada o desionizada y mezcle
completamente.
Añada 50uL de suero a 950uL del
tampón de PBS II diluido
Realice series de diluciones dobles a
partir de la dilución inicial de screening
para todas las muestras positivas con el
tampón de PBS II diluido.
IMPORTANTE

2. Observar a través de un
microscopio de fluorescencia.
Interpretación de Resultados
Positivo Negativo
La tinción específica es
superior al Control Negativo
Determine el patrón de tinción
de cada muestra y pondere su
intensidad de acuerdo con los
siguientes criterios:
La tinción específica es igual o
inferior al Control Negativo.
Reporte: Negativo para
anticuerpos antinucleares –
ANA en la muestra analizada.
4+ Fluorescencia verde manzana brillante .
3+ Fluorescencia verde manzana claro.
2+ Fluorescencia positiva claramente visible.
1+ La menor fluorescencia específica que permite
diferenciar claramente una nuclear y/u citoplasmática
estructura celular de la fluorescencia de fondo.
Patrón cANCA - Positivo Patrón pANCA - Positivo
DIAGNÓSTICO DIAGNÓSTICO
Granulomatosis de Wegener Glomerulonefritis con semilunas
o rápidamente progresiva.
Elaborado por: Juliana Alejandra Aguirre Rodríguez – Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca – Facultad de Ciencias Básicas – Bacteriología y Laboratorio Clínico.