PRESENTACIÓN BIOMOL

2. Pichia pastoris
 Reino: Fungi
 Genero: komagataella
 Especie: P.pastoris
This yeast has a lot of caracteristics
that make it very useful, like the
fact that can be methanol-induced
because the promotor.
most of the postraducional process
that are made on this cell, end up
producing proteins pretty similar to
the humans proteins, having a low
antigenic reaction.

3. ABO-DHC CERCROPINA A
 “Cecropins are thought to function by forming specific amphipathic
helices, which allow them to target non-polar lipid membranes. After
binding to the membrane, these proteins form ion permeable channels,
resulting in cell depolarization, irreversible cytolysis, and cell death”
 “is a highly cationic 37-amino-acid peptide”
Hyphantriacunea

4. RELATION
AMPs: antimicrobial peptides

5. OBJETIVO GENERAL
 “Describe in detail the cloning of the ABP-dHC-cecropinA gene into P.
pastoris GS115 and expression of ABP-dHC-cecropin A as an extracellular
protein, and provide characterization and biological assay results for
recombinant ABP-dHC-cecropin A.”

6. Métodos
 Expresión inducida de ABP-dHC cercropina A por p.pastoris en un frasco
de agitar
 Enzimoinmunoanalisis (ELISA)
 La transformación de p. pastoris y análisis de PCR de los transformantes de
p.pastoris
 Purificación de ABP-dHC cecropina A
 Ensayo de actividad antibacterial
 Materiales

7. Expresión inducida de ABP-dHC cercropina
A por p.pastoris en un frasco de agitar
Electroforesis
Involucra gran
variedad de geles
separación de
proteínas, según
peso molecular y
carga
SDS PAGE
Se evidencio
influencia de 4
factores en la
expresión
proteica
temperatura
metanol
Casamino
ácidos
Tiempo de inducción

8. Enzimoinmunoanalisis (ELISA)
 En la prueba de ELISA el anti-anticuerpo se liga a una enzima en lugar de
un ligando radioactivo. Después de que se haya producido la reacción
inmunológica se añade el sustrato de la enzima, la enzima cataliza un
cambio de color
 Se realizo esta prueba para poder observar la actividad antifungica de la
ABP-dHC cecropina A

9. La transformación de p.pastoris y análisis de
PCR de los transformantes de p. pastoris
 La PCR es una técnica que consiste en aumentar un segmento especifico
de ADN, usando polimerasa que es una enzima que se sintetiza en todas
las células y tiene una actividad específica de síntesis, reparación y
capacidad para extender o acortar el ADN, obteniéndose miles o millones
de copias.

10. Purificación de ABP-dHC cecropina A
 La purifica de proteínas recombinante consiste en la obtención de las
proteínas sintetizadas por la bacteria, que son codificadas por un gen que
se insertó en ella mediante la metodología de transformación génica.
 Se realizó este método para estimar los niveles de ABP-DHC cecropina A
presentes en cien micro litros de cultivo, que se podían observar por el azul
de coomassie

11. Ensayo de actividad antibacterial
 Se realizó esta
prueba para
evaluar el
crecimiento de E.
coli, que se
determinó con la
densidad óptica y
así obtener la
concentración
inhibitoria mínima.
Difusión en agarosa
Susceptibilidad por
difusión en disco
Microorganismo inoculado +
concentración de antimicrobiano
forma
Zona de
inhibición

18. DISCUSSION

20. CONCLUSIONS
 They justify how usefull is p.pastoris, in the expresión of pure proteins ,
 The recombinant method to produce antimicrobian peptide, can be a
good way to replace the expensive and clasic method of manufacture by
solid phase chemical synthesis
 Factors such as temperatura(20°c), casamino acid (at 2%), methanol (at
0.5%) showed to be very importat for the quantity of produced protein in
p.pastoris
 ABP-dHC cecropine A has a very strong antibacterial activity by the
destruction of their membrane