1. Apolipoprotein E and Apolipoprotein
E Receptors: Normal Biology and
Roles
in Alzheimer Disease
Curso Optativo “Técnicas Moleculares
aplicadas a Bioquímica Clínica”
A
A
A L
L
L Z
Z
Z H
H
H E
E
E I
I
I M
M
M E
E
E R
R
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2. Disertantes
CHERATTO, MILAGROS
TERUEL, NICOLÁS ANDRÉS

3. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Enfermedad neurodegenerativa que se
manifiesta como deterioro cognitivo y
trastornos conductuales. Se caracteriza en su
forma típica por una perdida inmediata de la
memoria y de otras capacidades mentales, a
medida que las células nerviosas mueren y
diferentes zonas del cerebro se atrofian.
Incurable y generalmente terminal.

4. INTRODUCCION
La enfermedad de Alzheimer es la causa
mas común de demencia en las personas
mayores de 60 años de edad.
 Las mutaciones en los genes PS1,PS2 y
APP causa forma autosómica dominante de
Alzheimer familiar (Alzheimer de inicio
temprano)


5. 
El más fuerte factor genético de riesgo es el
gen de la ApoE, siendo el alelo Ɛ4 un factor de
riesgo, y Ɛ2 un factor de protección.

El mecanismo que involucra a ApoE dependería de
sus efectos sobre el metabolismo del Amiloide ß.
Varios receptores están implicados: LDLR, LRP1,
ApoER2 y VLDLR, como así también la proteína
Reelina.


6. 
Figura 1. La familia del gen del receptor de la lipoproteína de baja
densidad (LDL). Estos miembros de la familia se caracterizan por
uno o más dominios de unión a ligando del factor de crecimiento
epidérmico (EGF), un solo dominio transmembrana y una cola
citoplásmatica que contiene al menos un motivo NPxY. Este último
representa a la vez la señal de endocitosis, así como un sitio de
unión para proteínas adaptadoras que unen el receptor a las vías
de señalización intracelular.

7. PAPEL FISIOPATOLÓGICO DE APOE EN
ALZHEIMER:




ApoE: Glicoproteína de 299 aminoacidos, se
expresa en hígado y en SNC, principalmente en
astrocitos y microglia.
En el SNC es la apoproteína que mas se produce.
Sus funciones están mediadas por receptor y
endocitosis.
Los polimorfismos de un solo nucleótido en
clusterina han demostrado ser un factor de riesgo.

8. REPRESENTACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE APOE: El dominio n-terminal contiene 4-hélices; el sitio
de unión RLDL de alta afinidad también requiere arg172 en la región bisagra que conecta los
dominios n- y c- terminal y dos sitios polimórficos en posición 112 y 158 que distingue las tres
isoformas de apo E . Dominio c-terminal: la región de unión a lípidos (lp); un sitio de union a
heparina (residuos 243-272)

10. GENÉTICA Y CLÍNICA DE LA RELACIÓN
ENTRE APOE Y EA.
Gen apoE Humano : cromosoma 19,
localizado en el extremo 5‘de un agrupamiento
de 50-kb de genes con Apo C-I y Apo C-II.
Cuatro exones y tres intrones. El gen presenta
varios polimorfismos de un solo nucleotido
(SNPs).
 Los tres mas comunes conducen a tres
isoformas:

ApoE2: cys 112-cys158
 ApoE3: cys112-arg158
 ApoE4: arg112-arg158


12. ApoE se colocaliza en placas amiloides
siendo el alelo Ɛ4 un factor de riesgo (un
alelo Ɛ4 aumenta el riesgo en 3 veces, y
dos alelos en 12 veces).


13. PAPEL DE APOE EN METABOLISMO DEL Aß
Primero se dijo que ApoE induce un cambio
conformacional patológico en el Aß, siendo
esto demostrado en autopsias.
 Ɛ4 se asocia con aumento de las placas
neuríticas.
 El efecto de la apoE4 es acelerar el inicio
de la deposicion de Aß en el cerebro.


14. 


Personas ApoE4 (+) de mediana y avanzada edad
son mas propensas a tener placas amiloides,
mientras que personas ApoE2 (+) rara vez
desarrollan Aß.
Las isoformas ApoE difieren en el defecto sobre el
tiempo de inicio, cantidad, ubicación y
conformación de Aß.
La formación de complejos entre apoE lipidada y
Aß sigue el siguiente orden:
ApoE2>ApoE3>>ApoE4.

15. 



La alteración del estado de
lipidación en el cerebro esta
relacionado con efectos de la
ApoE sobre la fibrilización
de Aß. Esta lipidación esta a
cargo de ABC A1.
ApoE también altera el
transporte y aclaramiento
del Aß soluble en el cerebro.
Las lipoproteínas con ApoE
pueden secuestrar Aß y
modular su captación, además
puede modular la
eliminación del mismo a
través de la BHE.
ApoE facilita la
internalización y la unión de
Aß soluble por las células.

16. RECEPTORES DE APOE


El efecto de la apoE esta mediado en
parte por sus receptores.
Los mecanismos por los cuales estos
receptores pueden contribuir a la
enfermedad incluyen:





Control de la inflamación
Metabolismo del colesterol
Neurogénesis
Generación y trafico de Aß.
Otros: Dendritogénesis, función del receptor
de glutamato y plasticidad sináptica.

17. BASES MOLECULARES EN LA
SEÑALIZACIÓN
Receptores ApoE contienen solo colas
citoplasmáticas cortas, pero tienen
una secuencia corta conservada
como el motivo NPxY. Estos
receptores pueden funcionar como
correceptores para proteínas de
señalización, entre ellos para el
receptor NMDA.
ApoER2 y VLDLR no necesitan asociarse para
provocar una señal, ambos se unen a la proteína de
señalización Reelina.

18. 
La señalizacion por Reelina es esencial para
el desarrollo normal del cerebro y para
regular la migración y posicionamiento de
cuerpos celulares en la corteza cerebral.

19. REGULACION DE LA FOSFORILACION DE
TAU

Altos niveles de
fosforilación de Tau
conducen a grados
variables de disfunción
cerebral, comprometiendo la
estabilidad de los
microtúbulos de la neurona.

Varios resultados suman a
la implicancia de los
receptores de apoE y su
interacción con Aß y Tau en
la patogénesis de esta
enfermedad.

20. NEUROTRANSMISIÓN GLUTAMAERGICA Y
PLASTICIDAD SINÁPTICA


Reelina modula la movilidad y residencia de las
subunidades NR2B de los receptores NMDA.
El aumento de plasticidad sinaptica esta mediado
por Reelina que tiene un efecto sobre el trafico del
receptor AMPA y a su vez en la actividad sináptica de
estos receptores.

21. 



Oligomeros del Aß induce supresión sináptica.
Reelina activa la señalización por Src tirosina
quinasa.
Esta función es interferida por ApoE4.
Los niveles de reelina disminuyen en cerebros de
pacientes con Alzheimer.

22. RECEPTORES APOE Y PROTECCION



ApoER2 y LRP1 están
implicados en la protección
contra la perdida de neuronas
y dendritas.
Esta neuroproteccion se
debe a la fosforilación de la
proteína vinculada al
elemento de respuesta por
AMP cíclico (CREB).
Reelina promueve
fuertemente esta fosforilación
requiriendo el receptor
NMDA. Esto es impedido
por la ApoE4.

23. EFECTOS DE LRP1 SOBRE EL
METABOLISMO DE Aß, APOE Y APP
El aumento de la endocitosis de APP
conduce a mayor produccion de Aß.
 Varios receptores ApoE interactuan con APP
como por ejemplo LRP1 en sus motivos
NPxY, esta interaccion acelera el
procesamiento del Aß.
 ApoER2 aumenta o disminuye la produccion
de Aß según las condiciones extracelulares.


24. 

Aclaramiento de Aß desparejo es un
acontecimiento patogenico. Hay 2 vias para el
aclaramiento del Aß: mediada por receptor o
mediada por endopeptidasas. En el primer caso
esta mediada por LRP1, LDLR y VLDLR.
El mejor caracterizado es el LRP1 el cual casi
siempre esta presente en placas amiloides.
Disminuir su expresión lleva al deterioro en
aclaramiento de Aß.

25. LRP1 se une al Aß directamente o a través
de la ApoE en su dominio carboxiterminal,
siendo la ApoE3 la que se une con mayor
afinidad. Esta union esta influenciada por la
lipidacion de apoE.
 LDLR también esta implicado y el aumento
de su expresión podría ser una estrategia
terapéutica.


26. Figura 4: Modelo de transporte de apoE mediado por receptores LRP1/LDLR.
Los ligandos se entregan a los cuerpos multivesiculares en los endosomas y
finalmente a los lisosomas para su almacenamiento o reutilización.. Según las
condiciones pueden formarse agregados de Amiloide beta intracelulares.

27. DIFERENCIAS ENTRE LRP1 Y LDLR




Ambos juegan un papel en el
metabolismo de ApoE. LRP1 se
expresa mas en neuronas, y LDLR
más en celulas gliales.
ApoE secretada por los astrocitos
tienen mas afinidad por LDLR, y
HDLs de LCR se unen mas al LRP1.
Estas diferencias están influenciadas
por la conformación y lipidacion.
LPR1 sirve como sensor de
colesterol mediando en el
transporte de otros lipidos como
los sulfatidos (marcadores del
Alzheimer).

28. Resumiendo un poco…

29. DIAGNOSTICO MOLECULAR
BASADO EN APOE Y SU GEN

30. DIAGNOSTICO MOLECULAR:
ISOELECTROENFOQUE
Podemos separar
las isoformas en
base al punto
isoelectrico en
solución de
anfolitos según el
pH.

31. DIAGNOSTICO MOLECULAR: ARMS PCR
ARMS-PCR: Amplification Refractory
mutation sistem.
 Es una técnica útil para la detección de
mutaciones puntuales, deleciones,
inserciones y polimorfismos entre otros.
 Permite la amplificación de alelos
específicos usando cebadores especiales
que solo hibridan con el alelo deseado.

32. 
Comprende dos reacciones de PCR y TRES
cebadores, ambas contienen un cebador
común, y otros dos cebadores alelo
específicos: uno para el alelo normal y otro
para el mutado.

33. 
Para incrementar la especificidad de los
cebadores se introduce un cambio de base
adicional en el 2° o 4° nucleótido del extremo
3´.

34. Ventajas:
 No es radiactivo y es bastante rápido,
sencillo, exacto.
Desventaja:
 Solo permite detectar mutaciones puntuales
conocidas.

35. Secuencia
del gen
APOE
HUMANO
en Gen
Bank
Diseño de
PRIMERS

36. PROTOCOLO
Consideraciones importantes:
 Hay un control (+) interno
 Cada muestra debe procesarse por duplicado (se
hace una Mix para dos cebadores ARMS Cys y la
otra para dos cebadores ARMS Arg).
 Las variables de la PCR deben ser aún más
controladas hasta poner a punto la técnica, debido a
que trabajamos con varios primers:




Secuencia de primers y sus concentraciones
Mg2+, dNTPs
ADN Molde y secuencia de interés
Tiempos de extension y de anneling. Tº de anneling

37. RESULTADOS

39. PERSPECTIVAS
Conseguir un tratamiento efectivo y una forma rápida de
pronosticar y prevenir el Alzheimer es todavía una utopía,
más aún por lo complicado de su génesis y su estudio
solamente en ratones y autopsias; pero con los constantes
avances y la integración Investigación- Mejora de la
calidad de vida, seguramente en un futuro muchos
aspectos claves de la terapéutica podrán ser abordados y
resueltos.
ANIMO!

40. MUCHAS GRACIAS!
-La calidad
nunca es un
accidente;
siempre es el
resultado de un
esfuerzo de la
inteligencia.-