El documento describe los efectos protectores de los productos naturales como Citrolive en enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Estudios en animales y humanos muestran que Citrolive reduce los niveles de colesterol y protege las células del daño oxidativo. También se investigan los efectos antiinflamatorios de compuestos polifenólicos en células cerebrales, lo que sugiere su potencial para prevenir enfermedades como el Alzheimer.

1. “ Efecto protector de los productos naturales en enfermedades degenerativas: Ateroesclerosis y Neurodegeneración”

4. Ensayo en Animales: Cerdos de Guinea (Alemania) Estudio del efecto hipocolesterolémico de Citrolive  en comparación con otros compuestos reductores del colesterol

5. Ratio Fitoesteroles / Citrolive 20 : 1 Objetivo : Comparar el efecto del consumo de Citrolive durante 4 semanas sobre el perfil lipídico de cerdos de guinea. Después de un periodo de adaptación todos los animales fueron aleatoriamente repartidos en cada uno de los 5 grupos de tratamiento: (a) Control (b) Fitoesteroles (1%) (c) Policosanoles (20 mg/ kg Peso) (d) Citrolive (0.05%) (e) Estatinas (10 mg/ kg Peso) Los ingredientes fueron adicionados en el agua de bebida durante 28 días. 9 animales fueron asignados a cada grupo. Las comparaciones en cada grupo se hicieron entre el día 0 y el 28 . Estadística Para determinar la significación estadística se usó el Test de la T de Students. P <0.05 fue considerado significativo. *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001.

6. Resultados 1) Como se esperaba el periodo de pretratamiento con una dieta rica en colesterol condujo a un significativo incremento de 3-4 veces en el colesterol total en plasma (p <0.05 para todos los grupos). Este incremento fue mayoritariamente del LDL-c. 2) La suplementación con fitoesteroles y Citrolive condujo a un significativo descenso del 43% y 29%, respectivamente, en el colesterol total (p<0.05). Los grupos (a) y (c) presentaron una reducción no significativa del colesterol del 10 y 13%, respectivamente. Citrolive mostró también un significativo descenso de los triglicéridos (31%, p<0.05).

7. Propiedades Hipolipidémicas e Hipocolesterólemicas de Citrolive  Estudios de intervención en Humanos Ensayos Previos (I) Nutrafur S.A.

8. Niveles de Colesterol Total a los 60 días de la ingesta de Citrolive  .

11. Estudios de intervención en Humanos Universidad Católica de Murcia (UCAM) (II) EFECTO DE CITROLIVE SOBRE LA OXIDACIÓN DE LIPOPROTEINAS DE BAJA DENSIDAD (LDL ox-LDL)

17. Papel Protector de los Polifenoles en la Neurodegeneración

18. Estructuras características en los cerebros de Pacientes de enfermedades Neurodegenerativas Fibras de Alfa sinucleìna Placas seniles (Proteína amiloide) Ovillos neurofibrilares (Proteína Tau) Déficit cognitivo

19. Placas de proteína amiloide y ovillos neurofibrilares Degradación de la actividad cerebral Placa amiloide vista con el microscopio de fluorescencia

22. La necesaria combinación entre AGEs y proteina A  para “desencadenar” la agresión “pro-inflamatoría” de la microglía activada Presencia de AGEs y proteína A  en placas neuríticas: AGEs (verde) y A  (rojo) se colocalizan en las placas neuríticas (células reactivas de glia en amarillo). Placas conteniendo únicamente A  (rojo), no muestran en su cercanía la presencia de células activas de microglía. Esto indicaría que solo la combinación de AGEs y A  resultaría relevante en la generación de procesos inflamatorios en la patología del Alzheimer.

23. Además de la acumulación generalizada de péptidos amiloides (PLACAS) y de proteínas tau (OVILLOS), sucede algo trascendental….. proteína proteína proteína lisina arginina glucosa Bases de Schiff días oxidación Compuestos de Amadori Semanas, meses,…. AGEs

24. Vía Inflamatoria “microglial”

27. Inducción en la producción de NO por LPS en células de microglia N-11 y macrófagos RAW264

28. Efecto de extractos de diversas plantas sobre la producción de oxido nítrico (NO) en microglia (N11) activadas con LPS y la viabilidad celular en términos de consumo de rojo neutro (NR) y reducción de MTT (MTT). 125 125 15 5 90 Apigenina 15 ND 110 NA NA 10 Valeriana 14 ND 90 NA NA 20 Tomillo 13 ND 100 NA NA 10 Salvia 12 ND 100 NA NA 20 Romero 11 ND 20 18 6 95 Acido Carnosico 10 90 90 CE 40 50 Labiadas 9 90 90 CE 20 50 Hoja de olivo 8 ND 90 NA NA 20 Pomelo 7 60 110 NA NA 20 Piel de uva 6 80 80 CE 26 90 Semilla de uva 5 100 ND NA NA 0 Echinacea purpurea 4 90 ND NA NA 0 Camomila 3 100 110 NA NA 10 Naranja amarga 2 95 110 CE 16 95 Uva ursi 1 % % μM μg/ml % Extracto Nr MTT NR IC 50 max inhibición Viabilidad NO N11

29. Efecto de extractos de diversas plantas sobre la producción de oxido nítrico (NO) en microglia (N11) activadas con LPS y la viabilidad celular en términos de consumo de rojo neutro (NR) y reducción de MTT (MTT). 80 40 12 8 100 Silymarina 29 60 100 NA NA 0 Hydroxytyrosol 28 100 100 NA NA 0 Dental Care 27 60 80 NA NA 0 Citrolive 26 100 110 NA NA 30 Citroflavan-3-ol 25 115 100 NA NA 30 AntimicRO 24 110 100 NA NA 40 Citrus Biof. WS 23 110 105 NA NA 30 Naringina WS 22 60 70 70 43 40 Naringina 21 80 60 40 12 70 Naringenina 20 100 ND NA NA 20 Hesperidina 19 80 90 100 32 50 Hesperetina 18 100 ND 90 58 60 Diosmina 17 140 120 19 6 90 Diosmetina 16 % % μM μg/ml % Extracto Nr MTT NR IC 50 max inhibición Viabilidad NO N11

30. Efectos de diferentes compuestos polifenólicos sobre la producción de NO en macrófagos (RAW264.7) activados con LPS. Análisis de la viabilidad celular (NR y MTT). RAW264.7 NO Viabilidad celular máxima inhibición IC 50 NR MTT Nr Extracto % μg/ml μM % % 1 Extracto de Uva ursi 30 NA NA 100 100 5 Extracto de Semilla de Uva 90 45 CE 80 50 8 Extracto de Hoja de Olivo 40 NA NA 110 ND 9 Extracto de Labiadas 0 14 CE 120 ND 15 Apigenina 90 2 7 130 ND 16 Diosmetina 80 5 16 100 ND 29 Silymarina 80 15 25 80 ND

31. Producción de TNF α por macrófagos RAW264.7 activados con LPS en presencia de determinados polifenoles .

32. Producción de NO Efectos Tóxicos e Inflamatorios de AGEs sobre Microglía.

33. Producción de TNF- α Efectos Tóxicos e Inflamatorios de AGEs sobre Microglía.

34. Inhibición de la producción de NO y TNF- α : cultivos de microglia

35. Inhibición de la producción de NO y TNF- α : cultivos de microglia

36. Inhibición de la producción de NO y TNF- α : cultivos de microglia

37. Inhibición de la producción de NO y TNF- α : cultivos de microglia

38. Inhibición de la producción de NO y TNF- α : cultivos de microglia

39. Efectos de diferentes compuestos polifenólicos sobre la producción de NO y TNF-alfa en células de microglía activadas con 750 μ M de BSA-AGEs. Análisis de la viabilidad celular (MTT). NO TNF-α Viabilidad celular en % (a EC 50 para NO ) EC 50 EC 50 Alamar Blue MTT Extracto μM μg/ml μM μg/ml % % Apigenina 14 - 8 - > 85 > 85 Diosmetina 19 - 39 - > 85 > 85 Silymarina --- 8 --- 10 > 85 > 85 Extracto de Hoja de Olivo --- 65 --- NA > 85 > 85 Extracto de Uva Ursi --- 25 --- NA > 85 70

41. Viabilidad celular (expresada en neuronas-EGFP) en cultivos de neuronas incubadas 24 horas con Triton X-100. La viabilidad se midió por Alamar Blue, Ioduro de Propidio, y EGFP fluorescencia después de 24 h. Este ensayo se repitió también con H2O2, NaN3 y Etanol. Viabilidad celular (expresada en neuronas-EGFP) en cultivos de neuronas incubadas 24 horas con Triton X-100. La viabilidad celular se comparó entre MTP (micro titer plate based) y Citometría de flujo (FACS). Este ensayo se repitió también con H2O2, NaN3 y Etanol. Estadios en la muerte celular de neuronas-EGFP tratadas con Triton X-100 Neuronas Neuro2a expresando EGFP, incubadas con 15µM de Triton X-100 durante 6 h hasta visualizar la muerte celular. Se uso Ioduro de propidio para marcar el núcleo celular y observar así la desintegración

42. Co-cultivo de Neuronas-EGFP y microglía N-11. A. Neuronas-EGFP (verde fluorescente) y células de microglía N-11 en una proporción 1:1, visualizadas con un estereomicroscopio (480nm ex/520nm em). B. Análisis por citometría de flujo de neuronas 2A-EGFP y células de microglía N-11.

43. Co-cultivo de Neuronas-EGFP y microglía N-11. A. Neuronas-EGFP (verde fluorescente) y células de microglía N-11 en una proporción 1:1, visualizadas con un estereomicroscopio (480nm ex/520nm em). La activación de la microglía con 10U/ml IFN-γ y 10 µg/ml LPS conduce a la muerte de las neuronas (puntos amarillos). C. Análisis por citometría de flujo de neuronas 2A-EGFP y células de microglía N-11.

44. Estudio dósis-respuesta del efecto de diversos compuestos antioxidantes sobre la muerte neuronal inducida por IFN-  y LPS en co-cultivos de neuronas-EGFP y células de microglía N-11, despues de 48 horas. Los co-cultivos fueron pre-incubados con los antioxidantes 90 min antes de la activación con 10U/ml IFN-  y 10 µg/ml LPS. Consideremos que el 100% sería el valor de viabilidad del co-cultivo sin activación alguna de la microglía. La expresión de las neuronas-EGFP se analizó con MTP y FACS.

48. Grupo/ días Día 1 Día 7 Día 14 Día 21 Día 28 Día 35 Día 42 Día 49 Día 56 Salino 10/10 9/10 7/10 5/10 3/10 0/10 0/10 0/10 0/10 Apigenina 10/10 9/10 9/10 9/10 8/10 8/10 8/10 6/10 6/10