Estudio de las alteraciones transcripcionales y funcionales causadas por mutaciones identificadas en pacientes del registro español de enfermedad de Von Willebrand (PCM-EVW-ES)
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Por Nina Borràs Agustí
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- 1. ESTUDIO DE LAS ALTERACIONES TRANSCRIPCIONALES Y FUNCIONALES CAUSADAS POR MUTACIONES IDENTIFICADAS EN PACIENTES DEL REGISTRO ESPAÑOL DE ENFERMEDAD DE VON WILLEBRAND (PCM-EVW-ES)
- 2. PCM-EVW-ES 38 Hospitales 557 Pacientes 330 Familias Clinical and Molecular Profile of the von Willebrand Disease in Spain. Spanish Registry (PCM-EVW-ES) Estudio Fenotípico Estudio Genotípico 480 Pacientes 280 Familias 723 mutaciones 283 únicas
- 3. OBJETIVO Investigar el mecanismo molecular y efecto patogénico de mutaciones de interés en VWF mediante análisis del RNA y/o estudios funcionales in vitro utilizando BOECs. Mecanismo patogénico desconocido o controvertido Mutaciones no descritas previamente Mutaciones VWF Analisi in silico Estudios funcionales RNA Proteína Plaquetas Leucocitos In vitro BOECs
- 4. Estudios RNA: M&M QIAamp RNA Blood Mini Eritrocitos Leucocitos y Plaquetas Plasma (PRP) Plaquetas: Expresión del gen VWF Amplificación de mRNA-VWF en Plaquetas y Leucocitos Obtención de RNA Plaquetas y Leucocitos Leucocitos: Expresión ectópica del gen VWF RNA Plaquetas RNA Leucocitos Sequenciación de la regiones de interés
- 5. Estudios RNA: análisis mutaciones
- 6. Estudios RNA: c.7082-2A>G (I41) RNA Leucocitos RNA Plaquetas Seq de referencia E42 Sequenciación de Sanger Amplificación NGS P C P C Leuocitos Plaquetas r.7082_7088del p.Ala2361GlyfsTer40 E42 RNA Leucocitos E42 RNA Plaquetas
- 7. Estudios BOECs Extracción de sangre (40-80ml) Recolectar el buffy coat Producción de BOECs (Blood Outgrowth Endotelial cells) Obtención de BOECs 3 individuos control p.Cys370Tyr p.Lys1297Glu p.Cys1169Arg p.Trp1120Cys p.Arg2118Trp p.Pro1127Ser p. Ala594Gly p.Thr2647Met p.Arg2313Cys Selección de mutaciones del registro PCM-EVW-ES: 9 mutaciones missense
- 8. Estudios BOECs: Controles Caracterización de BOECs Western Blot Immunofluorescencia RNA VWF, verde CD31, rojo 185 KDa 115 KDa 80 KDa 65 KDa 50 KDa 30 KDa MW HUVECp#9 HUVECp#9 CONTROL1a CONTROL1b Haemate25ng MW HUVECp#9 HUVECp#9 CONTROL1a CONTROL1b Haemate25ng Extractocelular Sobrenadante 1 2 3 HUVEC CONTROL1 CONTROL2 Leucocitos 600 bp Gen eNOS
- 9. • Los estudios a nivel de RNA tienen una gran importancia, no solo para las mutaciones potenciales de splicing, sino también, para las mutaciones sinónimas y missense. • Ambos abordajes demuestran su utilidad para el estudio funcional y transcripcional de las mutaciones seleccionadas del PCM-EVW-ES. • El análisis concomitante de tránscritos de plaquetas, leucocitos y células endoteliales del paciente, junto con el estudio funcional de la proteína en BOECs, representa un nuevo enfoque para el estudio integral del mecanismo patológico de las mutaciones. CONCLUSIONES
- 10. AGRADECIMIENTOS MINECO-FIS-ISCIII (PI1201494 PI15/01643 y RD12/0042/0053). Grants Baxalta/Shire (H16-32544), Baxter BioScience (H13-000845). CIBERCV is an initiative of ISCIII co-financed by Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) a way to build Europe. AUTORES: Borràs N1,2, Martorell L1,2, Orriols G1, Pérez-Rodríguez A4, Ramírez L1,2, Comes N1,2, Parra R1,3, Altisent C3, Batlle J4, Cid AR5; Bonanad S5, Mingot- Castellano ME6, Navarro N7, Vidal F1,2,8, Corrales I1,2, en nombre de los participantes y grupo PCM-EVW-ES. CENTRO DE TRABAJO: 1Departamento de Coagulopatías Congénitas. Banco de Sangre y Tejidos, Barcelona. 2Unidad de Diagnóstico y Terapia Molecular. Instituto de recerca Vall d’Hebron, Barcelona. 3Unidad de Hemofilia. Hospital Universitario Vall d’Hebron, Barcelona. 4Complexo Hospitalario Universitario A Coruña, INIBIC, A Coruña.5Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia. 6Hospital Regional Universitario de Málaga, Málaga. 7Hospital Universitario Dr. Negrín, Las Palmas de Gran Canaria. 8CIBER de Enfermedades Cardiovasculares. Grupo: Banco de Sangre y Tejidos
Notas del editor
- Buenos días yo os presentare el trabajo que ha consistido en el estudio…
- - En el registro nacional de la enfemedad de VWD participaron 38 hospitales, lo que resulto en un reclutamiento de 557 pacientes y 330 familias. - El estudio genotípico y fenotípico se realizo en todos ellos de forma centralizada, lo que condujo al diagnostico definitivo de VWD en 480 pacientes - En total, se identificaron un total de 723 mutaciones, de las cuales, 283 son unicas.
- En todas las mutaciones identificadas en el registro nacional se realizo en analisi in silico. Como ya sabeis, el analisi in silico tiene un cierto potencial predictivo y para determinar el mecanismo patogenico son necesarios estudios funcionales Estos estudios se pueden abordar: a nivel de RNA, analizando el efecto de las mutaciones sobre el splicing, o a nivel proteico, mediante estudios in vitro que tradicionalmente se han realizado utilizando líneas celulares heterólogas (COS7, AtT-20 y HEK293). O bien utilizando un protocolo descrito recientemente que permite la obtencion de celulas endoteliales derivadas del paciente. - Todos los pacientes del registro ha sido bien caracterizado, pero vamos mas alla, y el siguiente objetivo del proyecto consiste en… - Para ellos se han seleccionado esas mutaciones que presentan…
- En primer lugar, os presentare los estudios de las mutaciones del VWF sobre el splicing. A partir de una muestra de sangre periferica del paciente se obtiene RNA de plaquetas y RNA de leucocitos, que oferce un estudio complementario de la mutación. A continuación se amplifican las regiones de interés donde se localiza la mutación mediante RT-PCR y se analizan por Next Generation Sequencing y Sanger.
- Hasta el momento se han estudiado a nivel de RNA: 3 mutaciones intronicas 4 sinonimas 4 missense 1 delins 1 nonsense
- Para el estudio de la mutación intronica c.7082-2A>G situada en el intron 41, Se amplifica la región de interés donde recae la mutacion en el RNA de leucocitos y plaquetas del paciente i de un control. EN rojo se muestra la region analizada. Tanto por Sanger como por NGS se observa una doble sequencia en el RNA de leucocitos. Mientras que en el RNA de plaquetas se observa una unica sequencia, ya que se ha eliminado el allelo portador de la mutacion por un mecanismo conocido como NMD. Además al secuenciar por NGS, nos proporciona una informacion qualitativiva addicional, ya que teniendo en cuenta el numero reads sabemos que el allelo mutado en leucocitos aparece en 14% de reads. En conlusion esta mutacion intronica …
- Otra alternativa para estudiar el efecto patogenico de las mutaciones es mediante la utilizacion de BOECs. Las BOECs son celulas endoteliales del paciente obtenidas a partir de sangre periferica del paciente. En este sentido, despues de realizar un estudio en profundidad de todas las mutaciones identificadas en el registro nacional, se han seleccionado 10 mutaciones missense que seran estudiadas mediante este protocolo y actualmente ya estamos reclutando a los paciente para obtener BOECs. Paralelamente se han puesto en marxa las tecnicas que se utilizaran para el estudio de estas mutaciones a partir de 3 individuos control. Las BOECS de los controles se han obtenido a partir de una muestra de sangre periferica de 40-80ml. Despues de cultivar las celulas en un medio selectivo, aparecen las primeras colonias de celulas endoteliales del paciente, en este caso son individuos control.
- Las BOECs de los individuos control mediante 3 tecnicas distintas. A continuación se muestran los resultados de las BOECs obtenidas del PRIMER CONTROL. immunofluoresencia: EN VERDE se muestra la localización intracelular del VWF y en rojo una proteina de la membrana celular. En esta imagen se observa el solapamiento de las dos anteriores. Expresion genica: BOECs tambien se ha extraido RNA, y se ha amplificado un gen especifico de celula endotelial lo que ha confirmado el linaje de las celulas derivadas del paciente Y finalmente, por WB se localiza la proteina VWF En el extracto celular donde se observan 2 bandas: una correspondeinte al tamaño del VWF maduro y la otra al tamaño del VWF maduro unido al propeptido Por el contrario, en el sobrenadante se observa con mas intensidad unicamente el VWF maduro.
- que permitirá ampliar el conocimiento de las bases moleculares y celulares de la VWD.