Manual contador de colonias

CONTADOR DE COLONIAS
(SENSOR)
MANUAL DE USO PARA EL ALUMNO
DE LA UTTEC

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[Escribaeltítulodeldocumento]|[Seleccionarfecha] CONTADOR DE COLONIAS
MANUAL DE USO DE UN CONTADOR DE COLONIA
CONTADOR DE COLONIAS (SENSOR)
TIPOS DE CONTADORES
1. Contador de colonias electrónico de mano
El recuento de colonias a simple vista es una tarea lenta y tediosa para lo
cual para facilitar el proceso de reconteo se han creado instrumentos
electrónicos llamados “contadores de colonias” que se pueden encontrar
de las siguientes presentaciones:

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[Escribaeltítulodeldocumento]|[Seleccionarfecha]
2.- CONTADOR DE COLONIAS (SENSOR)
3.-CONTADOR MANUAL

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4.-CONTADOR MANUAL 4 DÍGITOS
5.- CONTADOR MANUAL 5 DÍGITOS
6.- CONTADOR ELECTRONICO

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EN ESTE CASO SE ENFOCARÁ AL USO DE UN CONTADOR DE COLONIAS
DE SENSOR TAL Y COMO SE MUESTRA EN LA IMAGEN C1.1 Y C1.2.
El contador de colonias (con código de almacén en la UTTEC “Q20”) que
facilita y acelera este proceso mediante el uso de una lupa y una iluminación
adecuada. Este instrumento es una herramienta necesaria para cualquier práctica o
investigación de laboratorio de microbiología que realice recuentos en placa.
Las placas de Petri
(ver imagen c1.4) se colocan
en el Contador de Colonias en
la posición central prevista
para ello, se iluminan y
amplían. Las colonias pueden
marcarse con un rotulador o
C1.2
C1.4

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un puntero de recuento. Un monitor digital muestra el recuento. Cada vez que se
toca la placa con el puntero de recuento se incrementa una unidad en el contador y
suena un avisador.
CUIDADOS Y PASOS A SEGUIR PARA SU USO
El cuidado que tenga al leer y seguir las instrucciones de este instructivo
determinará el servicio y calidad del equipo (contador de colonias manual de
sensor).
Desempaque e inspección.
Este equipo se empaca en forma especial para evitar daños en su
transporte y almacenaje. Sin embargo es recomendable que al pedirlo en el
almacén de química al momento de recibirlo se revise y en caso de detectar golpes
en el exterior, desempacarlo en presencia de la persona encargada en ese momento
y acentuarlo en el formato de daños en el equipo el cual será extendido de manera
gratuita, una vez llenado con letra de molde se hará efectivo el seguro de transporte
y uso en caso de que llegue a dañarse más el equipo.
Así mismo se recomienda que cada vez que se requiera transportar el
equipo se empaque adecuadamente en la manera en como la encontró.
Instalación:
El contador de colonias se debe de operar en posición horizontal, estos equipos
están dotados de patas de hule semi-flexibles, las cuales eliminan ruidos y
vibraciones.
El contador debe ser instalado preferentemente en un lugar limpio, ventilado y lo
suficiente mente amplio, deje al menos un espacio de 15 cm. Entre el contador de
colonias y cualquier superficie u objeto,. Debe estar nivelado y sentar firmemente
sobre cualquier superficie o mesa plana.
Antes de conectar el contador a la red eléctrica, asegúrese de que esta coincida con
el voltaje, fases y frecuencia adecuados así como tenga la capacidad en watts para
soportarlo (ver placa de especificaciones).

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ESPECIFICACIONES TÉCNICAS
• Contador: Cuatro dígitos de 9mm de altura, recuento hasta 9999
• Entradas: Marcador por presión. Puntero por contacto.
• Lupas: Vidrio, biconvexa, 100 ó 120mm diámetro, 4 dioptrías DIN 2x
• Alimentación: 100/240 V, 50/60 Hz
• Potencia: 20W
• Dimensiones (Ancho x Prof. x Alto): 20x30x40 cm / 7.9x11.8x15.7 in
• Peso: 3 Kg / 6.6 lb
Se recomienda que las variaciones de voltaje no sean mayores al 10%.

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NOTA: NUNCA LEVANTE EL CONTADOR DE COLONIA SOSTENIENDO POR EL
BRAZO FLEXIBLE, ES IMPORTANTE QUE PARA AJUSTAR LA POSICIÓN DE LA
LUPA CON EL BRAZO FLEXIBLE, SUJETE LA BASE DEL BRAZO CON UNA
MANO Y HAGA LOS AJUATES CON LA OTRA PARA PREVENIR LA POSIBILIDAD
QUE SE AFLOJE EL BRAZO DE LA BASE.
PRECAUCIÓN: para realizar cualquier labor de mantenimiento desconecte el equipo
de la fuente de energía.
Variaciones en el voltaje pueden dañar los componentes electrónicos.
MANTENIMIENTO DEL EQUIPO (PERSONAL DEL ALMACEN DE EQUIPOS).
Como cualquier producto manufacturado, después de un tiempo de operación
algunas partes del equipo pueden dañarse. Para reemplazarlas use partes genuinas
de fábrica, una lista de partes se incluye en este instructivo. Ordene siempre con el
número de parte. Todas las refacciones, servicios de reparación y garantía, pueden
ser solicitadas con nuestros distribuidores o directamente a la Planta.
LISTA DE PARTES/PART LIST
No. Descripción/Description pzs
1 Gabinete Control / Control Cabinet 1
2 Soporte Gabinete / Cabinet Support 1
3 Base Arrancador / Starter Base 1
4 Arrancador / Starter 1
5 Balastra 1x22 / Starter 1
7 Lampara Fluorescente / Lamp 1
8 Vidrio Grabado / Printed Glass 1
9 Tuerca Brazo / Arm nut 2
10 Gromet Cal. 16 / Cable Gasket 1
11 Cable Alimentación / Plug Cable 1
12 Pluma Contadora / Counter Pen 1
13 Repuesto Pluma / Plotter Pen 1
14 Soporte Caja Petri / Support 1
15 Plug Soporte / Plug Support 1
16 Tarjeta de Control / Control Board 1
18 Alarma Auditiva / Buzzer 1
19 Botón Control / Control Button 2
20 Brazo Flexible / Flexible Arm 1

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21 Lupa / Magnifying 1
22 Conector Pluma / Pen Conector 1
23 Interruptor Piloto / Pilotó Sw itch 2
24 Arnés de Conexiones / Connecting Arnés 1
25 Acrílico Grabado / Printed Acrílico 1
26 Soporte Lampara / Lamp Support 3
27 Separador Aluminio / Insulator 4
28 Fondo Negro 1
29 Pata de Hule / Bolt 4
33 Pija A.R. 8 x 1/2 / St. Scree 8x1/2 4
34 Tuerca 10-32 / Hex Nut 2
35 Tornillo 10-32 x 3/8 / Screw 10-32 x 3/8 2
36 Tuerca Latón 1/8 / Brass Nut 11
CHASIS Y PARTES DEL DISPOSITIVO DE MANERA GRAFICA

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INVENTARIO DE CUENTA COLONIAS EN EXISTENCIA EN LA UTTEC:
MODELO CANTIDAD FUNCIONANDO DESCOMPUESTOS
Q-20 (SENSOR) 5 3 2
MANUAL 4
DIGITOS
3 3 1
MANUAL 5
DIGITOS
4 4 4

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ELECTRONICO
DE
MANO(PLUMA)
2 1 1
UTT-123 2 2 0
EQUIPO DE SEGURIDAD:
Medidas de seguridad
Nombre, Descripción
COFIA,
GOGLES DE SEGURIDAD,
BATA,
GUANTES DE LATEX,
ZAPATOS CERRADOS,
CUBREBOCAS,
NOMBRE DESCRIPCIÓN
COFIA EVITA QUE CAIGA ALGÚN PELO
HUMANO EN LA SUSTANCIA Y SE
CONTAMINE
GOGLES DE SEGURIDAD EVITA QUE LOS OJOS SE IRRITEN
EN PRESENCIA DE UN FACTOR
IRRITANTE VOLÁTIL
BATA PROTEGE DE DERRAMES
QUÍMICOS O BACTERIANOS EN LA
ROPA
GUANTES DE LATEX PREVIENE EL CONTACTO DIRECTO
CON MICROBIOS O BACTERIAS
ZAPATOS CERRADOS DA SEGURIDAD A LOS PIES EN
CASO DE DERRAMES
CUBREBOCAS IMPIDE LA INHALACIÓN DE
TÓXICOS O MATERIALES
PATÓGENOS EN DIRECTO
MÉTODOS DE CONTROL QUÍMICO DEL CRECIMIENTO DE LOS
MICROORGANISMOS
Hay dos tipos de métodos:
• Químicos
• Físicos
1. Métodos químicos.

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A. Agente antimicrobiano.
Son compuestos químicos que son tóxicos para los microorganismos. Dentro
de estos hay unos componentes quimioterapéuticos y que tienen características
peculiares que es la de tener una toxicidad selectiva, lo que significa que es tóxico
frente al microorganismo pero no frente al huésped que lo contienen. Podemos
hacer una clasificación general. Dos grupos en función de que inhiban el crecimiento
de los microorganismos o que los maten.
En los que inhiben el crecimiento pueden ser:
- Bacteriostáticos inhiben a bacterias.
- Fungiestáticos inhiben a hongos.
- Virostáticos inhiben a virus.
En los que matan a los microorganimos pueden ser:
- Bactericidas matan a bacterias
- Fungicidad matan a hongos.
- Viricidas matan a virus.
Vamos a ver que ocurre cuando añadimos sobre un cultivo bacteriano un
microorganismo bacteriostático, bactericida o bacteriolítico.
 al añadir un componente bacteriostático lo que ocurre es que dejan de
crecer pero las células siguen vivas. Y el número de células iniciales es igual al
número de células finales.
 al añadir un componente bacteriolítico que mata las células, las lisa y las
degrada. Las células totales descienden y las viales también.
 al añadir u componente bactericida, las células totales, siguen siendo las
mismas pero las células viales mueren y descienden.
a) Método para saber el número de células de un cultivo.
 Método de diluciones.

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En un medio líquido tenemos un cultivo. En el cultivo sin crecer cogemo 1 ml y
los echamos en 9 ml obteniendo una dilución. Después se cogen las diluciones y se
ponen en placas, en las cuales se observan cuantas célula hay.
Si por ejemplo en el primero hay 10 en el seguno habrá 1 porque cada vez se va
dividiendo el número de células entre 10.
 Método de absorbancia.
En este método se realiza emitiendo luz a un cultivo. Si somos capaces de
calcular la luz emitida y después la luz transmitida (luz que queda después de haber
pasado por el cultivo) podemos saber lo denso que es el cultivo. Para hacer esto hay
unos aparatos llamados espectrofotómeros. Sabiendo la cantidad de luz que
absorve el cultivo (absorvancia) podemos trasladarlo al número de células que ya
vienen asignadas.
Ejemplo: la Escherichia coli: 1Uab= 8*108
celulas/ml.
b) Distintos grupos de agentes antimicrobianos.
MIC: concentración mínima inhibitoria que se defina como la concentración
mínima de un compuesto antimicrobiano necesario para inhibir el crecimiento de un
microorganismo.
Esto se da en una tabla que nos indica que para cierta patología es necesario
utilizar un medicamento determinado y en la cantidad adecuada.
Los tipos son:
 antisépticos y desinfectantes:
Compuestos antimicrobiano de uso común. Los desinfectantes no se pueden
usar en los seres vivos y los antisépticos sí.
 análogos de factores de crecimiento:
Un factor de crecimiento son moléculas orgánicas que requieren los
microorganismos a bajas concentraciones para su crecimiento. Formados por estos
grupos:
• Vitaminas
• Aminoácidos
• Purinas
• Pirimidinas
El análogo es muy parecido a los factores de crecimiento con una pequeña
variedad, y puede ser utilizado por la célula.
Ejemplo: las sulfamidas estas son análogos de un compuesto llamada PAVA
(paraaminobenzoico). Este está implicado en la síntesis del ácido fólico que es una
vitamina. Este ácido fólico esta implicado en la síntesis de purinas y piriminas. Lo
que va a suceder es que en vez de utilizar el PABA utilizan las sulfamidas y al
suceder esto no se sintetizan ni ácido fólico ni purinas y pirimidinas, por tanto la
célula muere porque no se forman los ácidos nucleicos. Hay que añadir que se
utilizan las sulfamidas en vez de PABA porque las sulfamidas están en una
concentración mucho más alto.
Otro ejemplo: fluorouracilo este es un análogo del uracilo lo único que cambia
es que añaden fluor.

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 antibióticos:
Compuestos orgánicos de bajo peso molecular que son producidos por
microorganismos y que inhiben el crecimiento de otros microorganismos.
Dede el putno de vista de la acción que realizan en general podemos dividir
entre:
• Amplio espectro: afectan a bacterias gram+ como gram-.
• Específicos: afectan a grupos caoncretos de microorganismos.
Desde el punto de vista químico hay once clases.
Desde el punto de vista del modo de acción sobre los microorganismos podemos
diferenciar:
• Los que afectan a la síntesis de la pared celular:
- Antibióticos B-lactámicos penicilina, cefaloesporina
- Peptídicos cicloserina
• Los que afectan al metabolismo del ácido fólico:
- Sulfonamidas.
• Los que afectan a la estructura de la membrana plasmática:
- Polimixinas
• Los que afectan a la síntesis de las proteínas. Varios grupos:
- Inhiben la función 30s tetraciclinas
- Inhiben la función 50s cloranfenicol
- Se unen al tRNA puromicina
• Inhiben la RNA polimerasa:
- Rifampicina.
• Inhiben la acción de la ADN girasa.
- Ácido napidíxico.
 Resistencia a los antibióticos.
Capacidad de un microorganismo a resistir ante un antibiótico al que antes era
sensible. Esta capacidad viene determinada genéticamente y proviene de los
microorganismos productores de antibióticos.
 Mecanismos de resistencia:
- Aquel por el que un microorganismo es resistente al antibiótico porque
carece de la estructura sobre la que afecta al antibiótico
mycoplasma. No hay ningún gen. Carece de los genes que codifican la
pared.
- Puede ser resistente porque sea impermeable al antibiótico
penicilina. Los genes se encuentran en el cromosoma
- Puede ser resistente porque modifique quimicamente al AB B-
lactámicos es transformado por las bacterias entéricas; el clorafenicol
que es transformado por la bacteria staphylococus aureus. Se
encuentran tanto en los cromosomas como en los plásmidos.
- Puede ser resistente porque modifique la diana sobre la que actúan los
antibióticos:
 los que modifican la RNA polimerasa y hay algunos antibióticos que
ya no reconocen esta RNA polimerasa modificada como es el caso
de Rimfampicina.

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 Los que modifican los ribosomas las cuales ya no son reconocidos
por eritromicina.
- Pueden ser resistentes porque crea rutas alternativas sulfamidas y es
utilizado por las bacterias entéricas.
- Pueden ser resistentes porque expulsa el AB tetraciclina y es utilizado
por las bacterias entéricas.
 Estrategias para evitar la aparición de microorganismos resistentes. (****)
- Utilizar los antibióticos solo cuando sean necesarios, en las dosis
adecuadas y durante el tiempo necesario.
- Utilizar mezclas de antibióticos que tensan distintos mecanismos de
resistencia.
Tener en cuenta la consideración de que cuadno se deja de utilizar un antibiótico en
una población el nivel de resistencia de bacterias en esa población va a caer
notablemente.
PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA
INDICE
Página
Introducción y observaciones preliminares 1
Material por pareja 2
Medios de cultivo 3
Esterilización 4
Siembra de microorganismos 5
Fermentación de azúcares 6
Observación de las bacterias 6
Ensayos bioquímicos estandarizados 8
Antibiosis 9
Actividad catalasa 11
Análisis microbiológico de aguas contaminadas 11
Transferencia genética entre bacterias Gram negativas
Conjugación 13
Transformación 14
Titulación de un virus bacteriano y Transducción 15
Crecimiento bacteriano 17
Aislamiento de bacterias lácticas y producción de yogur 18
OBJETIVOS
El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas
de las técnicas más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiología y
permitir la observación experimental de los conceptos aprendidos durante las
clases de teoría.

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NORMAS DE SEGURIDAD
Aunque los microorganismos que vamos a manejar no son patógenos
habituales, su ingestión masiva o el contacto con heridas puede provocar diversos
problemas. Por ello hay que seguir unas cuantas normas de seguridad:
1) No se puede fumar ni comer en el laboratorio
2) Es obligatorio la utilización de la bata
3) La ropa y los objetos personales no deben mantenerse cerca de las
zonas de trabajo
4) Al comenzar las prácticas conviene colocar un papel de filtro sobre la
zona de manipulación, y retirarlo al terminar el día.
5) Lavarse las manos cuidadosamente antes de salir del laboratorio
CALIFICACIÓN
Cada alumno deberá completar un cuaderno donde anotará con detalle los
fundamentos de la práctica correspondiente, los resultados obtenidos y la
explicación de éstos.

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ORGANIZACION
Las prácticas se desarrollarán por parejas en dos periodos de una semana
cada uno. El programa diario que se describe a continuación puede ser sujeto a
modificaciones dependiendo del calendario concreto de cada grupo.
Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes
SEMANA 1
Preparación
de medios de
Cultivo
Siembra Siembra
Antib.
OMac.
OMic.I
Siembra API
Antib.
OMicII
Rdo. API
Rdo. antib.
Catalasa
Rdo.BacPro
b
Siembra
Yogur
SEMANA 2
AnAguasI
Conjug. I
Transformació
n I
Inoculación
Leche
AnAguasII
Conjug.II
Transformaci
ónII
AnYogur
AnAguas III
Rdo. Conjug.
Rdo. Transf.
TVirus
Transduc.
Rdo TVirus
Rdo.
Transduc.
CrecBact.
SEMINARIO
Abreviaturas. An.AguasI, II, III, Rdo.) Análisis de aguas y resultados; Antib.)
Antibiosis; Rdo.Antib) Resultado antibiosis; Conjug.I,II, Rdo.) Conjugación y
resultados; CrecBact.) Crecimiento bacteriano; OMac) Observación
macroscópica: OMicI) Observación por contraste de fases y tinción de Gram;
RdoBacProb) Resultados de identificación de la bacteria problema. OMicII)
Tinción de esporas; TVirus) Titulación de un virus bacteriófago; API) Ensayos
bioquímicos estandarizados. Transduc) Transducción. AnYogur) Análisis
microscópico de yogur.
MATERIAL POR PAREJA
A cada pareja se le asignará una clave consistente en el número de la mesa
seguido de una letra de la A a la D y dispondrá de una taquilla numerada. En esa
taquilla debe de encontrarse el material para prácticas que se indica en el listado,
y es responsabilidad de cada pareja comprobar su estado al principio de la
práctica y asegurarse de que queda completo una vez concluidas éstas.
Diariamente hay que abrir la taquilla con la llave localizada en el tablero junto a las
pizarras ( ¡no dejeis las llaves puestas en los candados porque se doblan!).
Equipo:
Un trípode Rejilla para trípode
Un cristalizador Un puente de tinción
Unas pinzas Un asa de siembra
Un rotulador Un Microscopio

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Una Propipeta
Colección de colorantes y reactivos.
Cristal violeta Lugol
Safranina Azul de metileno
Verde malaquita Etanol
Frasco lavador con agua Aceite de inmersión.
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MEDIOS DE CULTIVO
Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio de Microbiología se requiere
disponer de una serie de medios de cultivo estériles. Aunque se darán ya
preparados por falta de tiempo, resulta necesario conocer los métodos de
preparación y esterilización utilizados habitualmente en el laboratorio.
Los medios de cultivo que vamos a utilizar son indefinidos o naturales, porque
en su preparación siempre se incluye algún extracto de composición química
desconocida. El más utilizado, el caldo común o su versión solidificada con agar,
es un medio que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias que se van
a utilizar en estas prácticas, pero también se emplean otros que contienen
inhibidores semiespecíficos como el agar de McConkey, cuyas sales biliares
inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas. En algunos
casos, se utilizarán medios que contienen componentes tales como indicadores
de pH que cambian de color cuando el microorganismo realiza una actividad
metabólica preferente sobre substratos concretos (Ej: fermentación).
Preparación de medios de cultivo:
Caldo común. Composición por litro.
Extracto de carne 3 g
Peptona bacteriológica 10 g
Cloruro sódico 5 g
Para prepararlo, se añaden los distintos componentes en un matraz de dos
litros, se disuelven en agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 (en nuestro caso no es
necesario porque el pH queda ajustado directamente) y se lleva al volumen final
correspondiente. Posteriormente, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar
con todo el volumen, 5 ml/tubo. El resto del medio se reparte en matraces con 50
y 75 ml. Los recipientes se aíslan con tapones metálicos o de algodón graso
envuelto en gasa y se esterilizan a 1 atm de sobrepresión durante 20 minutos.
Agar nutritivo. La composición es la misma que la del caldo común, pero se añade
antes de esterilizar 15 g de agar por litro, disolviéndolo durante la esterilización.
Cuando aún está caliente, se agita para hacer la disolución de agar homogénea y
se extiende en placas (a 45ºC) y en tubos, que seguidamente son inclinados para
obtener una superficie más extensa.
Medio base para la fermentación de azúcares. Inicialmente se prepara un medio
base pobre en aminoácidos de la siguiente composición por litro:
Extracto de carne 1 g
Peptona bacteriológica 10 g
Cloruro sódico 5 g
Una vez disueltos los componentes, se ajusta el pH a 7 y se añaden 2 ml de
solución de púrpura de bromocresol (PBC: 1.6 g en 100 ml de etanol al 45%. Se
disuelve inicialmente en etanol al 95 y posteriormente se diluye con agua) por

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litro. Este es un indicador de pH que vira a amarillo por debajo de pH 5.2, por lo
que permite la detección de la producción de ácido en el medio. El medio se
reparte en tres volúmenes iguales a los que se añade 10 g por litro de glucosa,
lactosa (Gal-Glu) o sacarosa (Glu-Fru). Una vez disuelto, se reparten, utilizando
una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 7 ml/tubo, en el que previamente
se ha introducido una campana Durham, pequeño tubo de ensayo que se dispone
en posición invertida para detectar la presencia de gases. El medio ha de ocupar
completamente el interior de estas campanas para poder detectar posteriormente
el desprendimiento de gases en la fermentación. (No olvidar marcar cada tubo
con la inicial del azúcar que contenga). Una vez taponados, se esterilizan a 0.5
atm de sobrepresión durante 20 min.
El resto de los medios utilizados ya vienen premezclados en forma
deshidratada y listos para su reconstitución. Las principales características a
destacar de su composición son:
Agar de McConkey. Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que vira
hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Además, contiene sales
biliares que inhiben el crecimiento de muchas bacterias, especialmente Gram
positivas.
Agar al verde brillante (AVB). Contiene lactosa, sacarosa, una elevada
concentración de aminoácidos, verde brillante como inhibidor de crecimiento de
muchos fermentadores, y rojo de fenol como indicador de pH. Los oxidativos
producen amonio a partir de los aminoácidos y generan color rosa. Los
fermentativos o no crecen o dan color amarillo.
Agar de tres azúcares e hierro (TSI). Contiene lactosa, sacarosa y glucosa,
citrato férrico y tiosulfato de sodio, elevada concentración de aminoácidos y rojo
fenol como indicador. Se prepara en tubos inclinados pero de mucho volumen.
Las bacterias se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial.
Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa
sobre la superficie (basificación). Las sulfitoreductoras dan sulfuro de hierro que
resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica.
Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB). Se trata de un medio rico lactosado con dos
colorantes, eosina y azul de metileno, que también funcionan como inhibidores del
crecimiento de Gram positivos. En este medio E.coli crece como colonias negras
con brillo verde metálico.
Caldo de urea-Indol. Es un medio muy pobre y bastante tamponado que permite
determinar la presencia de la actividad ureasa y la producción de indol a partir de
triptófano. En estas prácticas se empleará sólamente para determinar la presencia
de actividad ureasa, cuya actividad provoca la degradación de la urea presente en
el medio (un 2% p/v) a CO2 y Amonio, con la consiguinte alcalinización. Este
cambio de pH es detectado por cambio de color del indicador azul de bromotimol
desdee el verde original al azul intenso. Si se quisiera determinar la producción de
indol bastaría añadir al medio tras la incubación 0.3 ml el reactivo de Kovacs

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(reactivo IND del ensayo API), siendo positiva si se produce cambio de color al
rojo..
Agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe). Se trata de un medio natural muy rico que
contiene polisorbato, acetato, magnesio y manganeso que actúan como factores
de crecimiento para muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuará en medios
microaerófilos empleando jarras para el cultivo de organismos anaeróbicos y un
sistema comercial para la eliminación del oxígeno.
ESTERILIZACIÓN
La presencia de microorganismos en todos los medios ambientales hace
imprescindible que para estudiar una bacteria determinada sea necesario destruir
todas aquellas que pudieran encontrarse contaminando los medios o los
instrumentos de trabajo. Esto se consigue mediante la ESTERILIZACION,
consistente en la destrucción de todo microorganismo.
En estas prácticas vamos a utilizar especialmente el calor como método de
esterilización rutinario, aunque tal y como se ha explicado en clase existen otras
posibilidades. Los medios con contenido acuoso han de ser esterilizados en el
AUTOCLAVE mediante calor húmedo, obtenido por calentamiento en un depósito
hermético que contiene agua y del que previamente ha sido evacuado el aire con
el fin de limitar las oxidaciones. En este sistema el vapor de agua sobrecalentado
a 121 (2 atm) o 111 ºC (1.5 atm) difunde muy rápidamente, haciendo que los
elementos termosensibles de las células se desnaturalicen, especialmente sus
enzimas.
Por lo tanto, una vez preparados los medios de cultivo hay que proceder a su
esterilización en autoclave, realizada habitualmente a 1 atm de sobrepresión
(121ºC) durante 15 ó 20 min., salvo en el caso de medios cuyos componentes
sufran alteraciones tales que los hagan inadecuados para el crecimiento. Este es
el caso de los azúcares utilizados en los ensayos de fermentación, que se suelen
esterilzar a menor presión [0.5 atm. de sobrepresión (111ºC)] para evitar su
"caramelización" , una modificación consistente en su oxidación y consecuente
conversión en formas tóxicas para el metabolismo de las bacterias, o en el caso
de la urea, que conviene esterilizarla independientemente por filtración.
Por otra parte, todo el material de vidrio se esteriliza mediante calor seco en
el Horno Pasteur. Una vez limpio, el material se envuelve en aluminio o se
introduce en un contenedor (ej: pipetas en pipetero) y se mantiene en el horno
durante dos horas a 160ºC. En el caso de los portainóculos que se están
utilizando constantemente, se utiliza el calor directo del mechero, que también
sirve para flamear los bordes de tubos, matraces, pipetas, etc.
Práctica:
En esta práctica vamos a proceder a la preparación de caldo común, de
medios para la fermentación de azúcares y de placas de agar común siguiendo

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los protocolos descritos anteriormente (ver "caldo común", "medio base para la
fermentación de azúcares" y "agar nutritivo", respectivamernte) y las instrucciones
de los monitores.
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el cual se
lleva una porción de una población de microorganismos, denominada entonces
inóculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este
proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente
esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de prácticas. La
principal advertencia consiste en trabajar siempre próximos a la llama del
mechero que, debido a las corrientes de convección verticales que genera, es
capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo
de la llama.
Como instrumento portainóculos más frecuente se utiliza el asa de siembra,
con el que se puede tomar inóculo a partir de colonias o de medio líquido, debido
a que mantiene un pequeño volumen de agua por tensión superficial. Para
depositar el inóculo en líquido basta con introducir el extremo en el medio y agitar
ligeramente. Sobre sólido hay que hacer un recorrido largo sobre la superficie
salvo en el caso del medio TSI, en el que también hay que inocular picando en
profundidad para observar reacciones metabólicas en anaerobiosis. A veces se
utilizan pipetas para transportar volúmenes grandes de inóculos como en la
práctica de crecimiento bacteriano.
Procedimiento: Cada pareja deberá inocular y mantener durante la mayor parte
de las prácticas una serie de bacterias conocidas que denominaremos colección y
una bacteria sin nombre que constituirá el problema y que deberá de ser
identificado después de realizar toda una serie de ensayos. Las bacterias de la
colección y sus temperaturas de crecimiento son:
Escherichia coli 37ºC Gram negativa
Pseudomonas aeruginosa 37ºC Gram negativa
Staphylococcus aureus 37ºC Gram positiva
Micrococcus luteus 30ºC Gram positiva
Nocardia corallina 30ºC Gram positiva
Bacillus cereus 37ºC Gram positiva (¡Cuidado porque
forma esporas!)
En esta práctica se inocularán cada una de las bacterias de la colección en un
tubo de caldo común y en otro de agar inclinado. La bacteria problema, además
de en estos medios, será inoculada en una placa de agar común al objeto de
obtener colonias aisladas, bien por agotamiento de la siembra o bien por siembra
y esterilización entre recorridos solapantes, según las explicaciones de los
monitores. Una vez inoculado, incubar cada bacteria a su temperatura óptima de
crecimiento y no olvidarse de marcar el nombre de la bacteria y la clave de pareja
de prácticas.

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FERMENTACION DE AZUCARES
Se entiende por fermentación a reacciones de mantenimiento que no
requieren la participación de una cadena de transporte de electrones, aunque en
ciertos casos éstas pueden jugar papeles auxiliares. En el caso de azúcares se
trata de procesos de óxido-reducción capaces de regenerar NAD y que
comúnmente tienen como productos finales alcoholes (etanol, isopropanol, n-
butanol, etc.), ácidos (acético, fórmico, láctico, etc.) acompañados o no por la
formación de gases.
Además de su interés bioquímico, la capacidad para fermentar diferentes
azúcares es una propiedad utilizada muy frecuentemente en taxonomía. En
nuestro caso utilizaremos un procedimiento clásico para ensayar la capacidad de
fermentación de tres azúcares: Glucosa, Sacarosa y Lactosa. La producción de
ácidos se observará por el viraje a amarillo del Púrpura de Bromocresol. La
producción de gas por su acumulación en las Campanas Durham, de donde habrá
desplazado parte del líquido inicialmente incluído. Ambas determinaciones se
efectuarán a las 24 y 48 horas de incubación para así tener una idea de la rapidez
de su producción. Asímismo, se hará una cuantificación en función de la extensión
del viraje del indicador y de la cantidad de gas producida.
Procedimiento:
Inocular con la bacteria problema y con una de la colección (escogidas de
forma que no estén repetidas en la mesa) e inocular cada una de ellas en tres
tubos que contengan cada uno de los tres azúcares (G,S,L). Incubarlos a las
correspondientes temperaturas de crecimiento. Hacer las determinaciones a las
24 y 48 horas y apuntar los datos del problema y de toda la colección en el
cuaderno de prácticas.
OBSERVACION DE LAS BACTERIAS
a) Observación macroscópica.
El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las
colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede
estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel
morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del
borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc.
Incluso sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para
su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su
metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo
hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.
b) Observación microscópica.

13
Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma
de observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste
con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido con colorantes o
mediante la disposición de una óptica especial de contraste, generalmente de
fases, en el microscopio.
La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las
bacterias vivas y determinar algunas características tales como su movimiento.
Para ello, disponer una gota de cultivo líquido, previamente agitado, sobre un
portaobjetos y taparlo con un cubre de forma que se establezca una delgada
película entre ambos cristales. Posteriormente, se observa con el objetivo de
contraste de 40x (ojo!, tiene una banda roja y no todos los microscopios disponen
de él) y el condensador anular (se desplaza horizontalmente y con suavidad hasta
alcanzar su posición en el camino óptico). Con este sistema se deben de poder
distinguir aquellas bacterias con flagelación polar, que se mueven en zig-zags
muy rápidos, de la perítricas, de movimientos más suaves y ondulados. En las
inmóviles se producen desplazamientos generales por la existencia de corrientes
y vibraciones en el medio de observación. Determinar la forma y capacidad de
movimiento de la bacteria problema, y observar también alguna preparación de
las de la colección: Pseudomonas (polar), E.coli (perítrica), etc.
Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su
fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando
en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se
deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano
como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la
llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción.
Tinción de Gram. Se trata de una tinción diferencial muy utilizada que distingue
las bacterias por las características de su pared celular. Con el fin de disponer de
controles internos que nos permitan saber si la tinción ha sido correcta se
efectúan tres tinciones como mínimo: una con la bacteria problema sóla, y otras
dos en las que ésta es mezclada (a nivel del frotis!) con una bacteria G+ o con
una G- de morfología distinta a la problema. Así, si todo va como debe la bacteria
problema ha de mantener su coloración Gram constante en los tres frotis,
apareciendo en una de las mezclas otras bacterias de coloración Gram contraria.
El proceso de tinción se efectúa siguiendo el siguiente protocolo:
1) Hacer un frotis y fijar según se indica anteriormente.
2) Cubrir con cristal violeta durante 1 minuto. En este paso, todas las
células quedan teñidas por el colorante.
3) Eliminar el cristal violeta volcando el porta y tratar con lugol durante 1
minuto. De esta forma se refuerza la interacción entre el colorante y la
pared celular.
4) Lavar con alcohol por goteo continuado durante 20 segundos. Añadir
inmediatamente agua para evitar el arrastre completo de todo el
colorante. En esta fase se produce la decoloración diferencial de las
Gram negativas.
5) Tratar con safranina durante 1 minuto como colorante de contraste.

14
6) Lavar con agua abundante, secar al aire y observar en inmersión (100x).
En esta fase las Gram negativas adquirirán color rojo de la safranina
mientras que las Gram positivas continuarán con el color azul propio del
primer colorante.
Tinción de esporas. Se trata de otra tinción diferencial que se efectúa de forma
separada con la bacteria problema y con Bacillus subtilis (de la colección) como
productor de esporas. El procedimiento a seguir es el siguiente:
1) Hacer dos frotis de cultivos procedente de medio sólido de la bacteria
problema y de Bacillus de la colección. Fijarlos por calor de la forma ya
descrita.
2) Colocar los portas sobre el trípode y cubrir la preparación con tres
papeles de filtro recortados de forma que no sobresalgan.
3) Añadir verde de malaquita hasta que los papeles queden empapados y
pegados a los frotis. Coger el mechero por su base y calentar
lentamente las preparaciones hasta que estas empiecen a emitir un
vapor blanquecino (detectable mejor sobre fondo negro). Mantener esa
emisión con el mechero durante 5 a 7 minutos sin dejar que se sequen
las muestras (se añade más colorante). En esta fase se tiñen las formas
vegetativas y las esporas.
4) Coger las preparaciones con pinzas (¡queman!) y lavarlas intensamente
con agua fría hasta que se observe muy poca coloración. Durante este
lavado diferencial el agua arrastra el colorante de las formas
vegetativas, mientras que el incluido en las esporas se mantiene en el
interior debido al enfriamiento de las envolturas, que se vuelven de esta
forma mucho menos permeables.
5) Teñir con un colorante de contraste como la safranina, ahora en frío,
durante 1 minuto. Este sólo teñirá a las formas vegetativas, mientras
que las esporas permanecerán refractarias a su entrada.
6) Desteñir con agua fría. Secar al aire y observar con el objetivo de
inmersión.
Si todo va como debe, las esporas aparecerán de color verde y las formas
vegetativas en rojo. Determinar si la bacteria problema forma esporas o no.

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ENSAYOS BIOQUIMICOS ESTANDARIZADOS (API20E)
Además de las fermentaciones de azúcares, existe una gran diversidad de
ensayos bioquímicos que permiten identificar a un determinado organismo. No
obstante, el desarrollo individualizado de un conjunto de estos ensayos es muy
lento, y requiere la manipulación de gran cantidad de material, lo que a efectos
prácticos los hace inviables en laboratorios de análisis rutinarios. Para éstos, se
han desarrollado sistemas miniaturizados que permiten el ensayo a gran escala y
de forma sencilla de muchos ensayos bioquímicos simultáneos. Uno de estos
ensayos es el denominado galería API20E, especialmente diseñados para
Enterobacterias, pero que puede ser aplicado a otras bacterias. En nuestro caso,
usaremos una galería de ensayo de este tipo para caracterizar algunas
reacciones bioquímicas de la bacteria problema.
Actividades a ensayar. La galería API20E consta de 10 reacciones específicas de
fermentación para los azúcares y otras 10 reacciones de utilización de sustratos o
presencia de determinadas enzimas según se detalla en el siguiente cuadro:
TESTS SUBSTRATOS REACCIONES/
ENZIMAS
NEGATIVO POSITIVO
ONPG Orto-nitro-fenil-
galactósido
-galactosidasa incoloro amarillo (1)
ADH Arginina arginina dihidrolasa amarillo rojo/naranja (2)
LDC Lisina lisina descarboxilasa amarillo naranja
ODC Ornitina ornitina
descarboxilasa
amarillo rojo/naranja (2)
(CIT) Citrato sódico utilización de citrato verde-pálido/
amarillo
azul-verde/ azul
(3)
H2S Tiosulfato sódico producción de
sulfídrico
incoloro/ gris depósito negro
URE Urea ureasa amarillo rojo/naranja
TDA Triptófano triptófano deaminasa amarillo* marrón*
IND Triptófano producción de indol anarillo* anillo rojizo*
(VP) piruvato sódico producción de
acetoína
incoloro* rojo-rosa
(GEL) gelatina de Kohn gelatinasa No difusión difusión de
pigmento negro
GLU Glucosa fermentación/Oxidaci
ón (4)
Azul/verdoso Amarillo
MAN Manitol fermentación/Oxidaci
ón (4)
INO Inositol fermentación/Oxidaci
ón (4)
SOR Sorbitol fermentación/Oxidaci
ón (4)
RHA Ramnosa fermentación/Oxidaci
ón (4)
SAC Sacarosa fermentación/Oxidaci
ón (4)
MEL Melibiosa fermentación/Oxidaci
ón (4)

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AMY Amigdalina fermentación/Oxidaci
ón (4)
ARA Arabinosa fermentación/Oxidaci
ón (4)
*) Requiere la adición de reactivos
1) Un amarillo muy pálido debe considerarse positivo
2) Un color naranja pálido después de 24 horas de incubación podría
considerarse negativo
3) La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis)
4) La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, la oxidación en la
superior
Materiales y reactivos:
Galería de identificación API20E
P-200 y puntas estériles
Pipetas de 5 ml estériles
Tubo 5 ml estéril
Solución salina estéril (Cloruro sódico 0.9%)
Aceite de parafina estéril
Reactivo TDA Cloruro férrico 3.4 g
Agua 100 ml
Reactivo IND Paradimetil-amino-benzaldehido 5 g
Alcohol isoamílico 75 ml
HCl 37 % 25 ml
Reactivo VP1 KOH 40 g
Agua 100 ml
Reactivo VP2 1 naftol 6 g
Etanol 100 ml
Procedimiento:
1) Preparar una cámara de incubación con su tapa correspondiente y repartir 5
ml de agua en los alveolos para proporcionar un atmósfera húmeda. Anotar el
número de pareja en el lateral de la galería.
2) Colocar la galería en la cámara de incubación.
3) Disponer 5 ml de solución salina estéril en el tubo. Tomar mediante el asa de
siembra una colonia aislada y homogeneizar la suspensión con el agitador.
4) Inoculación de la galería (ver el esquema)
- Llenar los tubos pero no las cúpulas ( A) de los tests salvo los indicados
abajo.
- Llenar el tubo y la cúpula (B) de los test (CIT), (VP) y (GEL) con la
suspensión anterior.

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- Llenar la cúpula de los test ADH, LDC, ODC, URE, H2S con aceite de
parafina (C) para obtener atmósfera anaerobia.
5) Cerrar la cámara de incubación e incubar a 35-37ºC durante 24 horas.
A B C
Lectura de la galería (Anotad todos los datos obtenidos en el cuaderno!):
1) Leer los resultados de las reacciones espontáneas de acuerdo con la tabla de
positivos y negativos. Anotadlo en el cuaderno.
2) Revelado de (VP): Añadir 1 gota de reactivo VP1 y otra de VP2. Esperar 10
min. Si sale rojo o rosa es positivo.
3) Revelado TDA: Añadir una gota de reactivo TDA. La aparición inmediata de
un color marrón oscuro es resultado positivo.
4) Revelado IND: Añadir una gota de reactivo IND y esperar dos minutos. Un
anillo rojo indica reacción positiva.
ANTIBIOSIS
Existen diferentes técnicas para estudiar la actividad de los antibióticos frente
a distintos microorganismos, utilizándose en clínica pruebas esencialmente
cualitativas, aunque en muchos casos se requieren determinaciones cuantitativas.
En estas prácticas vamos a efectuar ensayos de ambos tipos. Las pruebas
cualitativas o antibiograma se van a efectuar con la bacteria problema mientras
que las cuantitativas las haremos con una bacteria conocida (E.coli ). Cada pareja
deberá pues inocular el día anterior al del ensayo su bacteria problema E. coli en
sendos tubos de caldo común, procurando evitar contaminaciones.
Las pruebas que vamos a realizar se basan en la difusión del antibiótico sobre
una placa de medio a partir de un punto central. En este caso, una cantidad
concreta del antibiótico se encuentra incluido en un disco de papel que se
deposita sobre una placa de agar común, que ha sido previamente inoculada con
una fuerte dosis de la bacteria a ensayar. Así, el disco de papel absorbe agua de
la placa, se disuelve el antibiótico y se inicia el proceso de difusión de éste hacia
las zonas que lo rodean, generándose un gradiente de concentración cuyo nivel
máximo se encuentra bajo el disco. Las bacterias que se inocularon crecerán
durante su incubación allí donde la concentración del antibiótico sea lo
suficientemente baja como para no impedírselo (normalmente alejado del disco),

14
mientras que no podrán hacerlo en las proximidades del disco donde las
concentraciones del antibiótico son elevadas. Puesto que los límites de
concentración de antibiótico que afectan al cultivo son por regla general muy
estrechos, se suelen formar halos de inhibición, esto es, zonas sin bacterias
alrededor de los discos, de bordes bastantes definidos y cuyo diámetro tiene que
ver con la concentración de antibiótico que había en el disco y con la sensibilidad
a éste de las bacterias ensayadas.
Procedimiento:
Antibiograma: El objetivo es determinar a qué antibióticos es sensible la bacteria
problema. Se utilizarán discos comerciales con los antibióticos y dosis que se
especifican en la tabla.
Antibiótico Abreviatura Dosis (g/ disco) Efecto Inhibidor
Cloranfenicol C 30 Síntesis de proteínas
Cefalotina CR 30 Síntesis de
peptidoglicano
Tetraciclina TE 30 S. de proteínas
A. Nalidíxico NA 30 Replicación
Eritromicina E 15 S. de proteínas
Estreptomicina S 10 S. de proteínas
Trimetoprim TMP 5 Síntesis A. fólico
Inicialmente se extiende con la bolitas de vidrio un inóculo de 0,2 ml de la
bacteria problema a partir de un cultivo denso en medio líquido (Utilizando las
pipetas automáticas como potainóculos: ¡No se os ocurra flamearlas, que son de
plástico!). Después se van disponiendo los discos de cada antibiótico sobre la
placa (hay que presionar ligeramente) y a distancias equivalentes, empleando
unas pinzas esterilizadas por calentamiento y enfriadas al aire. Para extraer los
discos de sus contenedores hay que seguir las instrucciones de los monitores.
Prueba cuantitativa. Se trata de determinar el grado de sensibilidad o
concentración mínima inhibitoria (CMI) de un antibiótico frente a la bacteria
ensayada. Cada pareja sembrará de la forma descrita un césped de E. coli, y
colocará cinco discos con cantidades crecientes de Estreptomicina. Para preparar
los discos, cada pareja preparará 5 diluciones seriadas (1:4 en agua estéril) a
partir de una disolución valorada que le darán los monitores, y añadirán 10 l de
cada una de éstas diluciones a sendos discos de papel estériles. Puesto que los
discos no están marcados, es imprescindible indicar su concentración debajo de la
placa. Siempre resulta conveniente mantener un orden creciente en la disposición
de los discos.
Una vez colocados los discos de ambos experimentos, las placas se incuban
en posición invertida durante toda la noche a la temperatura óptima de crecimiento
de la bacteria que se esté utilizando. A la mañana siguiente hay que medir el
diámetro de los halos de inhibición y anotarlos en el cuaderno.

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Resultados:
En el caso del antibiograma, se hará un cuadro de sensibilidad (S) o
resistencia (R) para cada uno de los antibióticos frente a esta estirpe, y
posteriormente serán utilizados como criterio para la determinación de la bacteria
problema. El criterio a seguir, internacionalmente reconocido, será:
Sensible (S) si el diámetro del halo es mayor de 15 mm
Resistente (R) si el diámetro del halo es menor de 13 mm
Intermedio (R/S) si el diámetro del halo está comprendido entre 13 y 15 mm
En el caso del ensayo cuantitativo se representará el diámetro del halo frente
al logaritmo de la concentración correspondiente. Los puntos obtenidos entonces
se ajustarán a una recta, de la que se extrapolará la concentración necesaria para
generar un halo de 15 mm, que será considerada como la concentración mínima
inhibitoria (CMI) de este antibiótico frente a la bacteria ensayada.
ACTIVIDAD CATALASA
Se trata de un ensayo muy simple que intenta determinar si la bacteria
problema tiene capacidad para degradar el peróxido de hidrógeno, uno de los
agentes oxidantes producidos como consecuencia de determinadas reacciones
metabólicas oxidativas propias del metabolismo aerobio. La enzima encargada de
degradar este producto es denominada catalasa y aparece en casi todos los
microorganismos aerobios obligados o facultativos. Existen sin embargo
organismos anaerobios o microaerófilos que carecen de dicha actividad,
constituyendo esta prueba un importante elemento taxonómico.
El ensayo es muy sencillo, pues basta con añadir una gota de agua
oxigenada sobre una colonia del cultivo y observar si de ésta se empiezan a
desprender burbujas de oxígeno como consecuencia de la actividad enzimática
de la catalasa:
2H2O2 ==========> 2H2O + O2
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
La detección de microorganismos contaminantes en alimentos y bebidas
constituye una práctica habitual en cualquier laboratorio de Bromatología. Para
ello se utilizan medios selectivos, indicadores y generales que nos permiten
identificar desde el total de bacterias contaminantes (realmente sólo se detecta
una cierta parte de la población total) hasta grupos de bacterias concretas, de
especial interés como agentes contaminantes por su posible peligrosidad, o por
tratarse de indicadores de procesos sufridos por el producto durante su
manufacturado o almacenamiento.

14
Por razones prácticas, en este experimento sólo vamos a tratar de distinguir
la presencia y cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:
Escherichia coli
Samonella typhimurium
Morganella morganii
Enterobacter aerogenes.
El método a seguir consistirá en efectuar una serie de diluciones decimales
del agua contaminada en solución fisiológica, siguiendo el esquema que se
representa a continuación:
0.1ml
10 10 10 10 10
-1 -2 -3 -4 -5MUESTRA
0.1ml 0.1ml
0.9 ml CC+Mg
+2
0.1ml 0.1ml
A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:
Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las
diluciones 10-5, 10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar común, e incubarlas a 37ºC
durante la noche en posición invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el número
de colonias y se multiplica por los factores de dilución correspondientes.
Determinación de bacterias fermentadoras de lactosa. Se extiende 0.1 ml
de las diluciones 10-4 y 10-3 sobre dos placas de agar MacConkey, incubándolas
de la forma descrita. Una vez crecidas, se cuentan las colonias rojas y las
rosáceas y se multiplican ambos números por los factores de dilución. Una vez
efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y se
extiende un inóculo denso sobre la superficie de una placa de agar EMB,
incubando a continuación a 37ºC durante toda la noche. En este medio,
confirmativo para E. coli, esta especie debe dar lugar a colonias negras con
reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da colonias más rosáceas
y nunca reflejos. Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli, sobre
el total de coliformes.
Determinación de Salmonella y Morganella. Se extienden 0.1 ml de las
diluciones 10-5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37ºC
durante 24-48 horas. Sobre este medio Salmonella y Morganella generan
metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las colonias se vuelvan
rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el
amarillo (una buena forma de detectar coliformes).
SF

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Con estos datos, hay que deducir el número de bacterias (por ml) de agua
contaminada que dan colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o
Morganella, hay que reinocularlas en caldo de urea-indol y en TSI. Sobre caldo de
urea la estirpe de Morganella debe generar color azul, y en TSI únicamente la
estirpe de Salmonella debe aparecer con precipitados negros (por producción de
SH2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto de los caracteres
siguientes:
Fondo* Pendiente Ennegrecimiento
S. typhimurium A+G Alcalino Sí
M. morganii A+G Alcalino No
*) A indica producción de ácido y G de gas
TRANSFERENCIA GENETICA ENTRE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
I) Conjugación
Uno de los mecanismos más comunes de diseminación de genes en la
naturaleza es la conjugación, un fenómeno mediante el cual una cepa portadora
de un plásmido, denominado conjugativo, es capaz de transferir una copia de éste
a una bacteria receptora casi siempre de la misma especie. No obstante, existen
los denominados plásmidos conjugativos promiscuos, esto es capaces de saltar la
barrera de especie y, en ciertos casos, la de género. Este mecanismo es el
causante primario de la difusión de genes de resistencia a antibióticos y, por tanto,
de la pérdida de efectividad de éstos observada durante los últimos años.
Superpuesto sobre la capacidad de transferencia interespecífica de plásmidos
se encuentra la movilización de los genes de resistencia a antibióticos promovida
por elementos genéticos denominados transposones. Un transposón es un
fragmento de DNA con capacidad para cambiar de localización dentro de la
misma molécula de DNA o entre moléculas distintas (ej: plásmido a cromosoma o
al revés) y que en muchas ocasiones es portador de genes de resistencia a
antibióticos, contribuyendo de esta forma a su diseminación.
Objetivos: Vamos a transferir un transposón que confiere resistencia a
Kanamicina desde una cepa de E.coli a una cepa de Salmonella typhimurium,
utilizando plásmidos derivados del conjugativo y promiscuo RP4. Como medidas
de seguridad, tanto las cepas donadoras y receptoras como los plásmidos que
vamos a emplear son derivados inocuos de las formas naturales obtenidos en el
laboratorio.
Material biológico:
Plásmido: se utilizará el plásmido pUT (5.2 kpb). Este plásmido contiene el origen
de replicación de R6K, que sólo funciona en cepas de E.coli que expresen la
proteína  desde un bacteriofago lisogénico  (pir), y el origen de

14
transferencia del plásmido conjugativo RP4. El plásmido contiene también el gen
de la transposasa (tnp) y un gen de resistencia a Kanamicina entre los extremos
I/O de recombinación (transferible mediante la actividad transposasa). Como
elemento de selección del plásmido, también lleva un gen de resistencia a
Ampicilina (una -lactamasa, bla). Para que sea transferido, este plásmido
requiere otras funciones propias de RP4, que solo se encuentran en la cepa E.
coli S17-1pir. El mapa de restricción del plásmido se presenta a continuación:
k m
I
O
ori R6K
oriT
RP4
t n p
bla
p U T
5 . 2 kp b
Cepas de E.coli: se emplearán las cepas de E.coli CC118pir y S17-1pir
transformadas con el plásmido pUT. Sólo la cepa S17-1pir posee la capacidad
de transferir el plásmido a otras cepas, pues contiene en el cromosoma genes de
RP4 necesarios para la conjugación. La cepa CC118pir será empleada como
control negativo en la transferencia.
Cepa de Salmonella. Utilizaremos como receptor la cepa de S. typhimurium
LB5010-R2 (resistente a Estreptomicina y a Rifampicina). Esta cepa posee otras
características especiales: es restricción menos, permitiendo una mayor
frecuencia de transferencia, y carece de la proteína , por lo que el plásmido pUT
no puede replicarse en ella.
Material no biológico:
Placas de agar común.
Placas de selección: se empleará agar común con Rifampicina (80 g/ml), y
Kanamicina (10 g/ml).
Solución de lavado. Solución estéril de ClNa al 0.9 % (p/v).
Solución de conjugación : SO4Mg 10 mM (estéril).
Procedimiento:
1) Crecimiento de las cepas (lo harán los monitores): Se emplearán cultivos de
24 horas crecidos en caldo común conteniendo, para las dos cepas de E. coli
Ampicilina (100 g/ml) y Kanamicina (30 g/ml), y para la cepa de Salmonella,
Rifampicina (80 g/ml). Una vez crecidas, las células serán lavadas por
centrifugación y resuspendidas en 1/10 del volumen inicial de SO4Mg 10 mM.

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2) Sobre una placa de agar común, depositar dos filtros estériles de nitrocelulosa
separados (actuarán de soporte sólido para la conjugación). Marcad en las placas
debajo de cada filtro CC118 y S17. Añadir 10 l de la suspensión de Salmonella
en cada uno de ellos, dejar que absorba el líquido y añadir sobre uno de los filtros
10 l de la suspensión de E.coli CC118pir, y sobre el otro 10 l de la de S17-
1pir. Incubar toda la noche a 37ºC.
3) Al día siguiente, tomar cada filtro con las pinzas (en condiciones de
esterilidad), introducirlo en sendos tubos estériles. Añadir 5 ml de SO4Mg 10 mM,
agitar intensamente y extender 100 l en dos placas de selección (Rifampicina
80, Kanamicina 10). Dejar crecer a 37ºC durante toda la noche.
Resultados: Confirmar la aparición de colonias únicamente en la conjugación entre
E. coli S17-pir y Salmonella. Contar las colonias. Explicad los resultados obtenidos
en el cuaderno de prácticas.
II) Transformación
La transformación es un proceso a través del cual el DNA es introducido
dentro de un microorganismo. En algunas bacterias la transformación es un proceso
natural e inducible que les permite la adquisición de manera activa de DNA exógeno.
En otros muchos la transformación puede producirse de forma artificial mediante
tratamientos químicos o físicos. En esta práctica vamos a proceder a introducir
plásmidos de clonaje en una cepa de E. coli mediante el tratamiento químico de
éstas.
Materiales:
Cepa de E. coli JM83. Se trata de una cepa carente de actividad -
galactosidasa, aunque dispone de las permeasas específicas de lactosa. En
ausencia de plásmidos esta cepa es sensible a ampicilina e incapaz de fermentar la
lactosa, por lo que genera colonias blancas en agar lactosado de McConkey.
Cuando esta cepa es transformada con un plásmido que porta un fragmento del gen
de la -galactosidasa (fragmento alfa) la actividad enzimática es funcional y se
obtienen bacterias fermentadoras de lactosa (colonias rojas en este medio). Cuando
el gen de la -galactosidasa portado por el plásmido es interrumpido artificialmente
mediante la introducción de un fragmento de DNA exógeno, este gen deja de
funcionar dando lugar a colonias blancas, una propiedad muy utilizada en como
indicador de clonaje.
Plásmidos: cada pareja dispondrá de una mezcla de los plásmidos pUC119 y
pUC119-X. Se trata de plásmidos con un origen de replicación autónoma funcional
en E. coli, un gen de resistencia a ampicilina, y el sistema de selección de clones
con inserto dependientes del gen -galactosidasa comentado más arriba. En
pUC119 este sistema está intacto, mientras que en pUC119-X el gen de la -
galactosidasa ha sido interrumpido por la inserción de un fragmento de DNA (X) de
otro organismo.

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Material no biológico:
Soluciones frías de Cl2Ca y Cl2Mg a 100 mM
Dos placas de agar lactosado de McConkey con 100 g/ml de ampicilina (Agar Mc
de selección)
Caldo común estéril
Procedimiento:
1) Cada pareja deberá centrifugar 1,5 ml (~ un tubo Eppendorf lleno) de cultivo
exponencial de la bacteria (5 min a 5.000 rpm) y resuspenderlas con cuidado y en
condiciones de esterilidad en 1 ml de Cl2Mg frío (4 ºC). Tras volver a centrifugar en
las mismas condiciones, las células serán resuspendidas en 200 l de Cl2Ca 100
mM, también frío, y dejadas en la nevera hasta el día siguiente. Durante este tiempo
se produce una inducción de competencia artificial en E. coli mediada por las sales
de calcio.
2) Tras esta incubación, distribuir las células tratadas con el Cl2Ca en dos tubos con
100 l cada uno. Añadir 10 l de la mezcla de plásmidos a uno de ellos, dejando el
otro sin DNA (control negativo). Incubar ambos en hielo durante 20 min. Someterlos
posteriormente a un choque térmico a 42 ºC durante 90 segundos exactamente en
un baño de agua previamente estabilizado a esta temperatura. Volver a enfriar en
hielo (2 minutos), añadir 800 l de caldo común e incubarlos en la estufa de 37 ºC
durante 30 min para que se exprese el gen de resistencia al antibiótico. Tras ese
tiempo, extender 100 l de cada tubo sobre sendas placas de agar Mc de selección
e incubarlas a 37ºC durante 24 h
3) Observar la cantidad y tipo de colonias que aparecen sobre cada una de las
placas.
III) Transducción (Ver la práctica de titulación)
TITULACION DE UN VIRUS BACTERIANO y TRANSDUCCION
Titular una suspensión de virus consiste en determinar el número de unidades
infectivas por ml presente en la misma. En el caso de los virus bacterianos líticos,
la titulación se realiza asumiendo que cada unidad infectiva es capaz de producir
una placa de lisis sobre un césped bacteriano, lo que es cierto para bajas
multiplicidades de infección. Así, determinando el número de placas de lisis
pUC119
pUC119-XAmp
Amp
β-gal X

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producidas al infectar con distintas diluciones de la suspensión de virus, podremos
calcular el número de unidades infectivas presentes en la muestra original.
Utilizaremos la estirpe de E. coli JM83 que permite la expresión de un
bacteriófago lambda utilizado en ingeniería genética (derivado de RS45) que
porta el gen de la -galactosidasa bajo el control de un potente promotor de
transcripción constitutivo, y un gen de resistencia a kanamicina, de forma que
podremos seleccionar y detectar la integración en la práctica simultánea de
transducción. Como medios para el cultivo e infección se puede utilizar
directamente caldo y agar común a los que se añade siempre Cl2Mg a una
concentración final de 10mM, al objeto de evitar la disgregación de los
componentes de la cápsida del virus. También se utilizará agar blando, que se
obtiene añadiendo 0.6% (p/v) de agar al caldo común (con el Cl2Mg presente), y
que tiene como función el permitir una difusión limitada de la progenie vírica tras la
lisis de la bacteria. Para el ensayo de transducción emplearemos placas de agar
de McConkey con el antibiótico kanamicina
Procedimiento:
1) Se prepara un inóculo de la cepa de E. coli a infectar (ojo! NO es la misma que
se emplea en la colección) en un medio que contiene 10 mM de Cl2Mg y maltosa
al 0.2%, y se deja incubando a 37ºC y con agitación durante la noche anterior
(Esto lo hacen los monitores para todo el grupo).
2) Se funden los matraces con el agar blando (con 10mM de Cl2Mg) y se
mantienen en estado líquido en los baños a 50ºC (Los monitores hacen esto).
3) Preparar diluciones decimales (tantas como indiquen los monitores) de la
suspensión de virus utilizando el caldo común con el magnesio.
4) Disponer 0.2 ml del cultivo de bacterias ya crecido en cinco tubos estériles, y
añadir a cada uno 0.1 ml de tres diluciones consecutivas del virus, siguiendo las
indicaciones de los monitores. Homogeneizar suavemente e incubar a 37ºC
durante 15 minutos con el fin de permitir la adsorción del virus a la superficie de
las bacterias.
5) Añadir también 0,1 ml de la dilución 10-1
a otro tubo con 0,1 ml de la bacteria
para la práctica de transducción. Incubar en la estufa como en el punto 4. Hacer
un control paralelo con igual cantidad de bacterias, pero sin virus.
0.1ml
10 10 10 10 10
-1 -2 -3 -4 -5MUESTRA
0.1ml 0.1ml
0.9 ml CC+Mg
+2
0.1ml 0.1ml

14
6) Añadir 3-4 ml del agar blando (a 45-50ºC) sobre los tres tubos más diluídos,
homogeneizar y extender sobre placas de agar común procurando que no queden
burbujas. Dejar que se solidifique este agar manteniendo las placas sobre la
mesa durante 5-10 minutos.
7) Extender directamente los tubos para la transducción sobre placas de
selección de McConkey con kanamicina, empleando para ello bolitas de cristal
estériles.
8) Incubar a 37ºC en posición invertida durante toda la noche.
9) Al día siguiente contar las placas de lisis que se han formado en las placas
con el agar blando. Puesto que cada una de ellas corresponde a un proceso de
infección por un virus único, multiplicando por los factores de dilución
correspondientes en cada caso se podrá determinar el TITULO del fago, esto es,
el número de unidades infectivas por ml.
10) En las placas de Mc con kanamicina observar si aparecen colonias y el color
de éstas. La aparición de colonias rojas indicará que el fago se ha integrado en el
cromososoma confiréndo a esta bacteria resistencia al antibiótico de selección y
capacidad de utilización de lactosa mediante la introducción de genes
procedentes de otras bacterias (Transducción).
CRECIMIENTO BACTERIANO
En esta práctica, realizada en grupos de 4 personas, seguiremos el
crecimiento de un cultivo estático de E.coli y observaremos el efecto producido
sobre éste por algunos agentes antibacterianos de uso habitual en medicina como
la Ampicilina y la Estreptomicina.
Procedimiento:
A partir de un cultivo crecido que os darán los monitores, inocular en
condiciones de esterilidad 5 ml de éste en un matraz que contenga 75 ml de caldo
común enriquecido con 0.2% (p/v) de glucosa (añadir 0.75 ml de glucosa al 20%
en el matraz en condiciones de esterilidad si no lo hicieron previamente los
monitores). A continuación, tomar de la mezcla 5 ml con una pipeta estéril,
dejarlos en un tubo de ensayo (que no tiene por qué ser estéril), e introducir
inmediatamente el matraz en el baño de incubación (hay que procurar que las
bacterias no se enfríen a lo largo del proceso de crecimiento), apuntando la hora a
la que se tomó esta muestra que será considerada como tiempo 0.

13
Con los 5 ml de la muestra hay que efectuar medidas de pH y turbidez. El pH
se mide para valorar la producción de ácido como consecuencia del metabolismo
bacteriano, y es el parámetro que hay que medir en primer lugar. Después se
mide la turbidez o densidad óptica en un colorímetro a una longitud de onda de
550 nm. Este valor refleja un parámetro proporcional a la concentración de masa
celular (siguiendo la ley de Lambert-Beer) hasta un valor de 0.5, a partir del cual
se pierde esta proporcionalidad. Por esta razón, cuando al medir obtengamos un
valor superior a 0.5 se procederá a la dilución (1 ml de cultivo + 4 ml de caldo) con
medio de cultivo, de forma que el valor que se obtenga, multiplicado por el factor
de dilución (5 x), mantenga la proporcionalidad con la concentración de la masa
bacteriana.
A partir del tiempo considerado como 0 se seguirán tomando muestras de 5
ml cada 45 ml en las que se medirá el pH y la turbidez para reflejarlo con
posterioridad en una gráfica.
Cuando los cultivos alcancen una DO de 0.4-0.5, las parejas C-D de las
mesas añadirán las concentraciones de antibióticos que se indican, continuando
la incubación y la toma de muestras cada 45 min.
Mesa 1 100 (g/ ml) de Ampicilina
Mesa 2 100 (g/ ml) de Estreptomicina
Mesa 3 100 (g/ ml) de Ampicilina +
Estreptomicina
Mesa 4 100 (g/ ml) de Estreptomicina

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Resultados:
Los resultados de DO de cada uno de los experimentos se irán apuntando en
la pizarra para que sean a continuación representados sobre papel
semilogarítmico (en éste, la escala logarítmica transforma directamente los
valores obtenidos en las posiciones de sus logaritmos correspondientes), de
forma que en el cuadernillo final aparezcan una gráfica del cultivo no tratado y
otras tres de los tratados con los antibióticos. De estas gráficas se podrá
observar: 1) Fases exponencial y entrada en estacionaria (la fase de latencia no
se ve en este medio y condiciones, y la de muerte tarda mucho en llegar); 2)
Tiempo de generación, calculable a partir de la pendiente de la gráfica en su fase
exponencial.; 3) Efectos de los antibióticos, lítico para Ampicilina y no lítico para
Estreptomicina.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS LÁCTICAS Y PRODUCCIóN DE YOGUR
Las bacterias lácticas están implicadas en una gran variedad de procesos de
transformación de alimentos. En esta práctica vamos a aislar bacterias de yogur y
las vamos a emplear para inocular leche y comprobar su capacidad fermentativa.
Materiales: Cada pareja se encargará de traer un yogur natural como fuente de
lactobacilos. Para el aislamiento, emplearemos el medio MRS (Man, Rogosa y
Sharpe). Se trata de de un medio natural muy rico que contiene polisorbato,
acetato, magnesio y manganeso que actúan como factores de crecimiento para
muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuará en medios microaerófilos
empleando jarras para el cultivo de organismos anaeróbicos y un sistema
comercial para la eliminación del oxígeno. Para la producción de yogur se
empleará leche estéril (UHT) y tubos de plástico de 5 ml.
Procedimiento:
1) Tomar 50 l del suero de yogur con una pipeta estéril (puntas amarillas) y
diluirlos en 1 ml de solución salina. Hacer una o varias diluciones 1/10 en solución
salina según indiquen los monitores, y extender 50 l de la más diluída sobre una
placa de agar MRS (que no esté muy seca) empleando bolitas estétiles. Incubar
boca abajo en condiciones de microaerofilia durante 48 horas a 37 ºC.
2) Observar si las colonias crecidas sobre la placa son homogéneas y calcular su
número aproximado. Utilizar varias colonias para inocular con el asa de siembra
un tubo conteniendo 5 ml de leche estéril (UHT). Mantener el segundo tubo sin
inocular. Incubar ambos tubos a 37ºC hasta el día siguiente.

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3) Observar el grado de gelificación del tubo inoculado y compararlo con el no
inoculado. Abrir el tubo y proceder como en el paso 1 para obtener una
suspensión del contenido del yogur. Hacer un frotis y una tinción simple para
observar los organismos que han crecido.

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