Enzimas

ENZIMAS

Prof.: Angel Roco Videla

Introducción

Las enzimas son catalizadores biológicos, la cuales
pueden no sólo aumentar la velocidad en factores que van
desde 106 a 1012 , sino que son altamente especifica.
Actúan sólo en determinadas moléculas, llamadas sustrato
(esto es, reactivos). Se ha calculado que una célula
promedio puede contener unas 3000 enzimas diferentes,
cada una de las cuales cataliza una reacción específica.


Las enzimas no operan independientemente, existe un
control interno que activa ciertas enzimas cuando se
requieren, y las desactiva cuando se ha formado suficiente
producto.

Una teoría sobre la especificidad de las enzimas es la
llamada teoría de la “llave cerradura”. Una enzima es
generalmente una molécula grande de proteína que
contiene uno o más sitios activos donde se lleva a cabo
las reacciones con los sustratos, el resto de la molécula
mantiene la integridad tridimensional de la red.


PRODUCTOS

ENZIMA

MODELO LLAVE CERRADURA


Sustrato Productos

Enzima Complejo Enzima
enzima-
sustrato


De acuerdo con la Hipótesis el sitio activo tiene una
estructura rígida , similar a una cerradura. Una molécula
de sustrato tiene la estructura complementaria que causa
que embonen, y funciona como una llave.

Aunque parece perfecta la hipótesis existen varias
discrepancias, por ejemplo se sabe que sustratos de
diferentes tamaños embonan con el mismo tipo de
enzima. Hoy se sabe que el sitio activo de una enzima
tiene gran flexibilidad , durante una reacción cambia para
acomodarse a la molécula de sustrato.


Propiedades de las enzimas

Las enzimas son muy específicas para los reactantes o
sustratos, sobre los cuales actúan. Una enzima puede
reaccionar con un grupo de sustancias de estructuras
estrechamente relacionadas, mientras que otra sólo
puede actuar sobre un compuesto molecular único.
Muchas enzimas presentan estereoespecificidad, lo cual
significa, que actúan sobre un solo estereoisómero del
sutrato.


Tal vez el aspecto general más importante de la
especificidad de las enzimas es la especificidad de
reacción, esto es, la falta de formación de subproductos
de desecho. La especificidad de reacción se refleja en los
rendimientos excepcionales de producto, los cuales son
prácticamente del 100%. La eficiencia de las enzimas no
solo ahorra energía para la célula viva, sino que también
evita la formación de subproductos del metabolismo
potencialmente tóxicos.


Algunas enzimas funcionan como puntos de control en el
metabolismo el metabolismo puede ser controlado a través
de:
* alteraciones en las concentraciones de enzimas
* Alteraciones en las concentraciones de sustratos y de
inhibidores de enzimas
* Con la modulación de los niveles de actividad de algunas
enzimas.


Las enzimas más comunes son proteínas globulares y
poseen la capacidad para unirse específicamente a una o
varías moléculas.

Las moléculas de sustrato se unen, en una hendidura un poco
hidrofóbica que se conoce como el sitio activo, el cual con
frecuencia está situado entre dos dominios o subunidades de
una proteína o en una indentación, algo parecido una bolsa
de un extremo de un barril.


Las enzimas que intervienen en la regulación del metabolismo
son por lo general de mayor complejidad que las enzimas que no
son reguladoras.
Las enzimas son moléculas oligoméricas que tienen sitios de
unión diferentes para sustratos y para moduladores, (compuestos
que actúan como señales reguladoras).

Clasificación de las enzimas
La mayor parte de las enzimas tienen un nombre que se forma
adicionando el fijo quot;-asaquot; al nombre del sustrato sobre el cual
actúan o a un término que describe las reacciones que catalizan.


Por ejemplo, la ureasa tiene la urea como sutrato. La
alcoholdeshidrogenasa cataliza la remoción de hidrógenos de
los alcoholes.

A pesar de ello, algunas enzimas, como tripsina o la
quimotripsina, aún se reconocen por sus nombres históricos.

La Unión Internacional de Bioquímica asigna un número a cada
enzima y clasifica a las enzimas en seis grupos importantes de
acuerdo a la clase general de reacciones químicas que catalizan:


1.- Las óxidorreductasas catalizan reacciones de oxidación-
reducción. La mayor parte de estas enzimas se conocen como
deshidrogenasas, pero algunas de ellas reciben el nombre de
oxidasas, peroxidasa, oxigenasas, o reductasas.

Ejemplo

Enzima : Lactato deshidrogenasa

Descripción de la reacción :Oxidación de alcohol secundario.
Lactato a piruvato ( una cetona)

Coenzima que participa: NAD+ ( Nicotínamida adenina
dinucleótido)


O
-
C O
L-lactato

NAD+
+
HO C H

CH3

O
-
piruvato C O

H+
+ NADH +
O C

CH3

2.- Las transferasas catalizan reacciones de transferencia de
grupos. Muchas de ellas requieren de la existencia de
coenzimas. Estas enzimas o sus coenzimas son sustituidas en
forma covalente por una porción de la molécula del sustrato.

Ejemplo

Enzima :Alanina transaminasa ( Alanina aminotransferasa)

Descripción de la reacción :Transferencia de un grupo amino

Coenzima que participa: Fosfato de piridoxal


O
O
-
CO
-
L-alanina C O
α-cetoglutarato
CO
+
+
CH2
H3N C H
CH2
-
CH3 CO

O

O
O
piruvato -
CO
L-glutamato
-
C O +
H3N CH

+ CH2
O C CH2
-
CO
CH3
O


3.- Las hidrolasas catalizan la hidrólisis. Son una clase
especial de transferasas, el agua les sirve como un
receptor del grupo transferido.

Ejemplo

Enzima :tripsina

Descripción de la reacción :Hidrólisis del enlaces peptídicos Lis-Y
o de Arg-Y donde Y es igual o diferente a Pro,

Coenzima que participa: Ninguna


+
NH3
Residuo de lisina dentro de una
CH2
cadena peptídica
CH2
CH2

CH2
H2O
+
O
- CH NH C
NH -
C CH

O R

Fragmento de
+
NH3
polipéptido con O
CH2
lisina C-terminal.
+
CH2
H3N C
CH2
-
CH
+
CH2
Fragmento de
R
- CH
polipéptido nuevo
NH -
CO N-terminal
O

4.- Las liasas catalizan las reacciones de eliminación no
hidrolítica, no oxidante, o la lisis de un sustrato en reacciones
que generan un enlace doble. En la dirección inversa, una
liasa cataliza la adición de un sutrato a un doble enlace de un
segundo sustrato. Una liasa que cataliza una reacción de
adición en las células se denomina con frecuencia sintasa

Ejemplo

Enzima :piruvato descarboxilasa

Descripción de la reacción :Descarboxilación de piruvato

Coenzima que participa: Tiamina pirofosfato


O
piruvato
-
C O

H+
+
O C

CH3

HC O
+ CO2
CH3

Acetaldehido


5.- Las isomerasas catalizan reacciones de
isomerización. Debido a que estas reacciones tienen
un solo sustrato y un producto, son por lo regular
reacciones enzimáticas más sencillas

Ejemplo

Enzima :Alanina racemasa

Descripción de la reacción :Interconversión de isómeros y de
D L
alanina

Coenzima que participa: Fosfato de piridoxal


O O
- -
CO CO

+
+
H C NH3
H3N C H

CH3
CH3

L-Alanina D-Alanina


6.- Las ligasas catalizan la ligadura o unión de dos
sustratos en reacciones sintéticas que requieren el ingreso
de la energía química potencial de un nucleósido
trifosfato, como el ATP. A las ligasas se les da el nombre
de sintetasas

Ejemplo

Enzima :Glutamina sintetasa

Descripción de la reacción :Síntesis de L-glutamina, dependiente de
ATP

Coenzima que participa: ATP


O
-
C O
+
H3N C H +
+ ATP + NH4
CH2
CH2
-
OC O

O
-
C O
+
H3N C H +
ADP Pi
+
CH2
CH2
OC NH2


La ecuación de velocidad enzimática

Los datos cinéticos reflejan las relaciones entre la cantidad de
producto P de la reacción formada en la unidad de tiempo,
∆[P]/∆t, y las condiciones experimentales bajo las cuales la
reacción tiene lugar.
La base de la mayor parte de las mediciones cinéticas es la
observación de que la rapidez o velocidad (v) de una reacción
varía directamente con la concentración de cada sustrato o de
cada catalizador. Esta afirmación se escribe en una ecuación
que se llama ecuación de la velocidad.


Por ejemplo, la velocidad de ecuación para la conversión
no enzimática de S→P una reacción de isomerización se
escribe como:

∆[P]/∆t = v = k [S]

El símbolo k es la constante de velocidad. Las constantes
de velocidad indican la rapidez o la eficiencia de una
reacción. Una gráfica de velocidad en comparación a [S]
para esta reacción podría ser una línea recta que aumenta
linealmente con la concentración del sustrato.


El orden cinético general de una reacción es la suma de
los exponentes en la ecuación de velocidad y nos dice
cuantas moléculas están reaccionando en la etapa más
lenta de la reacción.

Un reacción de primer orden es aquella en la cual un
solo componente está reaccionando. La constante de
velocidad para una reacción de primer orden se
expresa en unidades de la recíproca del tiempo ( s-1)


Reacción de primer orden

v

[E]


Para una reacción complicada como la reacción
de S1 + S2 → P1 + P2
La velocidad se determina por las concentraciones de
ambos sustratos.-
Si ambos sustratos están a concentraciones similares la
ecuación de velocidad es :
v = k [S1]1 [S2]1

Esta reacción es de primer orden con respecto a cada
reactante y de segundo orden general.-


Las reacciones de segundo orden también se denomina
bimolecular porque dos moléculas reaccionan formando
los productos. Las constantes de velocidad para las
reacciones de orden tienen las unidades M-1 s-1. Con
frecuencia se estudian reacciones con más de dos
reactantes, pero debido a que los cálculos se pueden
volver muy complejos, se escogen condiciones de modo
que las reacciones se efectúen en varias etapas, y que
cada etapa sea de primer o de segundo orden.-


Si la concentración de uno de los reactantes es tan alta
que permanece prácticamente constante durante el curso
de la reacción se dice que la reacción es de pseudo
primer orden.

v= k [S1]1 [S2]o = k’ [S1]1

Las condiciones de psuedo primer-orden se utilizan en
análisis que se llaman ensayos enzimáticos que determinan
las concentraciones de las enzimas.


En los ensayos enzimáticos, todos los reactantes, con
excepción de la enzima, existen en exceso para asegurar
que las condiciones de la reacción sean de pseudo - primer
orden . El ensayo se lleva a cabo a una temperatura
constante lo suficiente elevada para producir una actividad
alta, pero no para desnaturalizar a la enzima.
Baja estas condiciones, hay suficientes moléculas de
sustrato para convertir todas las moléculas de E en ES (
saturación).


En los ensayos, por lo regular las enzimas están en
concentraciones muy bajas en comparación con los
sustratos. Sin embargo, en el interior de las células, no
están necesariamente saturadas. La concentración de
una enzima en una muestra de prueba se puede
determinar con facilidad por comparación de su
actividad con una curva de referencia


Los momentos iniciales de una reacción bimolecular se
puede escribir como:

k1 kcat
E+S ES E+P
k-1

La velocidad medida durante este corto periodo se
denomina velocidad inicial vo


Las velocidades iniciales se obtienen a partir de curvas de progreso,
gráficas de la concentración del producto contra el tiempo. La velocidad
es la tangente o pendiente ∆[P]/ ∆t en el origen de una curva de
progreso.

2E

[P]

E

Tiempo

La ecuación de Michaelis-Menten

Cuando se comenzaron a analizar las variaciones en las
concentraciones del sustrato con el fin de derivar las
ecuaciones de velocidad de los procesos enzimáticos, se
hicieron dos observaciones importantes.

1º.- a concentraciones elevadas de sustrato, E esta
saturada con S, y la velocidad de reacción es
independiente de la concentración de sustrato. El valor de
vo para una solución de E que está saturada con S se
llama velocidad máxima vmáx.


2.- A concentraciones bajas de sustrato , la reacción es de
primer orden con respecto al sustrato (segundo orden
general : de primer orden con respecto a S y de primer
orden con respecto a E). La forma de la curva de vo en
comparación a [S] es una hipérbola rectangular.

vmáx

vo Orden cero con respecto a S

Primer orden con respecto a S

0
[S]

La ecuación de velocidad para una hipérbola de este tipo es

y= ax
b+x

Donde a es la asíntota de la curva ( el valor de y a un valor
infinito de x) y b es el punto sobre el eje de la x que
corresponde a un valor de y al infinito /2. Podemos obtener la
ecuación de velocidad para la reacción bimolecular:

E+S ES E+P


Por sustitución de cuatro términos de la cinética enzimática
en la ecuación general para una hipérbola rectangular tenemos
y = vo , x = [S], a = vmáx. El cuarto termino b en la ecuación
general es la constante de Michaelis Km definida como la
concentración de sustrato cuando vo es igual a la mitad vmáx.

vmáx

vo = vmáx
2

0
[S]

La ecuación completa de velocidad:

y= vmáx[S]
km + [S]

Esta se denomina ecuación de Michaelis-Menten.


Constante de velocidad y la eficiencia catalítica

Las constantes cinéticas de las reacciones enzimáticas Km
y kcat se pueden utilizar para medir la eficiencia catalítica
de las enzimas.-

Km es una medida de la estabilidad del complejo ES

kcat es la constante de velocidad de primer orden para la
conversión de ES a E + P. Es una medida de la actividad
catalítica de una enzima y nos dice cuantas reacciones
por segundo puede catalizar una molécula de enzima.


La relación kcat / Km es una constante de velocidad de
segundo orden aparente para la formación de E + P a
partir de E + S cuando la reacción general está limitada
por el encuentro de S con E. Esta constante se aproxima a
108 a 109 M-1s-1. , que es la mayor velocidad a la cual dos
solutos sin carga se pueden aproximar entre si por
difusión.

Los valores absolutos de estas constantes indican la
potencia de cada enzima como catalizador.


vmáx

Región A
vo
vo = kcat [E]1 [S]0

0
[S]
La constante catalítica , es la constante
Región B
de velocidad de primer orden para la
conversión del complejo ES a E+P . Se
vo = kcat/km [E]1 [S]1 mide con mayor facilidad cuando la
enzima esta saturada de sustrato.

La relación kcat/km es la constante de
velocidad de segundo orden a
concentraciones muy bajas de sustrato


Conversión de la ecuación de Michaelis-Menten

Par hacer más fácil el estudio de la cinética de una reacción
enzimática es posible transformar la ecuación de una
hipérbola a una ecuación lineal. La transformación más
utilizada es la gráfica de Lineweaver-Burk o de reciprocos
dobles.

1 = Km 1 + 1
vo Vmáx [S] Vmáx


Se usan los valores de 1/vo contra 1/[S] para la gráfica. El
valor absoluto de 1/km se obtiene de la intercepción de la
línea en el eje de la x y el valor de 1/Vmáx se obtiene del
intercepto en el eje de las y.
Los valores de kcat se pueden obtener a partir de
mediciones de Vmáx sólo cuando se conoce la
concentración absoluta de la enzima. Los valores de km se
pueden determinar aún cuando las enzimas no se hayan
purificado, mientras una enzima en una preparación
impura pueda catalizar la reacción que se observa.


1/vo
ECUACIÓN DE
LINEWEAVER-BURK
1/vmáx

1/[S]
-1/km


FACTORES QUE AFECTAN
LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Y EL EFECTO DE LOS
INHIBIDORES ENZIMÁTICOS

Prof: Angel Roco Videla

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

Aunque los perfiles de las curvas de actividad en función del pH de
muchas enzimas son acampanadas, pueden variar
considerablemente de forma.


La relación entre pH y la actividad de cualquier enzima
depende del comportamiento ácido-base de la enzima y del
sustrato.
La forma de la curva de actividad-pH varía con la
concentración del sustrato, ya que el valor de KM de muchas
enzimas varía con el pH.

La relación pH actividad de una enzima puede constituir un
factor en el control intracelular de su actividad, esto debido a
que el pH optimo de una enzima no es necesariamente
idéntico al pH de su entorno intracelular normal.


Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

Aunque las reacciones catalizadas por las enzimas parecen,
con frecuencia tener una temperatura optima, el pick que se
observa al representar la actividad versus temperatura se
produce porque las enzimas se desnaturalizan por la acción
del calor y se inactivan cuando la temperatura sobrepasa
cierto punto.
La aparente temperatura optima es el resultado de dos
procesos
1.- el incremento habitual de la velocidad de reacción con la
temperatura.

2.- el incremento en la velocidad de desnaturalización térmica
de la enzima al sobrepasar una temperatura critica.


La mayoría de las
enzimas se inactivan a
temperaturas entre los 55
y 60ºC. Aunque existen
enzimas capaces de
seguir activas hasta los
85ºC como las enzimas de
las bacterias termofílicas.


Algunas enzimas, como
la ribonucleasa, pierden
actividad por calefacción,
pero la recuperan por
enfriamiento, lo cual
indica que su cadena
polipeptídica desplegada
vuelve rápidamente a
adoptar su conformación
nativa.


Inhibición de las enzimas

Inhibición competitiva

La característica de la inhibición competitiva es que el
inhibidor puede combinarse con la enzima libre de tal modo
que compite con el sustrato normal para unirse al centro
activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con
la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor (EI)
análogo al complejo enzima-sustrato:

E+I EI


La molecula del inhibidor no resulta químicamente alterada por la
enzima. Es posible definir entonces la constante de inhibición como
Kj. Y esta sería comparable con Ks que es la constante de
disociación del complejo enzimas sustrato.

La inhibición competitiva se reconoce experimentalmente, debido a
que el porcentaje de inhibición para una concentración de inhibidor
constante disminuye al incrementar la concentración del sustrato.

Kj = [E][I]
[EI]


Gráficamente este tipo de
inhibición se caracteriza
por proporcionar una
familia de líneas rectas
cuyo punto de
intersección común se
haya sobre el eje de 1/vº.
La presencia de un
inhibidor competitivo
incrementa KM aparente
de la enzima por el
sustrato, provocando que
se necesite
concentraciones mayores
de sustrato para que se
alcance la velocidad
máxima.

Inhibición acompetitiva

El inhibidor no se combina con la enzima liebre ni
afecta a su reacción con el sustrato normal, sin
embargo se combina con el complejo ES para
formar un complejo inactivo ESI, el cual no
experimenta posteriores transformaciones.

[ES][I]
ES + I ESI Kj =
[ESI]


El grado de inhibición
puede aumentar cuando la
concentración de sustrato
se ve aumentada. Esta
inhibición se puede
reconocer gráficamente al
representar 1/vº frente a
1/[S] para concentraciones
constantes de inhibidor. Lo
característico de este tipo
de inhibición es que
pendiente permanece
constante al aumentar a
concentración del inhibidor
pero la Vmax decrece.


Inhibición no competitiva
Un inhibidor no competitivo puede combinarse con la
enzima libre o bien con el complejo ES, interfiriendo con
la acción de ambos. Los inhibidores no competitivos se
unen a un centro de la enzima distinto del centro activo,
a menudo para deformar a la enzima, de modo que no
pueda formarse en complejo ES a su velocidad normal y
que una vez formado no se descomponga a su velocidad
habitual para liberarlos productos. Sus efectos no se
anulan al aumentar la concentración de sustrato.


En la inhibición no competitiva la reacción con en inhibidor produce
dos formas inactivas, EI y ESI:

Kj = [E][I]
E+I EI
[EI]

[ES][I]
Kj =
ES + I ESI
[ESI]


Esta inhibición se
reconoce gráficamente en
el hecho que las líneas no
comparten un punto de
intersección común. El
valor de la intersección es
mayor para la enzima
inhibida que para las no
inhibidas, lo que indica que
la Vmax decrece en
presencia del inhibidor y
no puede restablecerse su
valor aunque se aumente
la concentración de
sustrato.


Inhibición irreversible: modificación de la enzima

Este tipo de moléculas son capaces de unirse
covalentemente con la enzima y modifican de
modo permanentemente el grupo funcional,
necesario para la catálisis. Este tipo de inhibición
no puede ser tratado por los principios de
Michaelis-Menten, que suponía la formación de
complejos reversibles.
Este tipo de inhibición es muy útil para
identificarlos grupos funcionales esenciales para
el proceso de catálisis


TAREA

¿QUE SON LAS ENZIMAS REGULADAS
ALOSTERICAMENTE (ENZIMAS ALOSTERICAS) Y
LAS ENZIMAS MODULADAS COVALENTEMENTE?

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