Dossier: Técnicas de diagnóstico de microbiología

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UNIVERSIDAD LATINA DE PANAMA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA
SALUD
LIC. MEDICINA Y CIRUGIA
Microbiología médica
Estudiantes:
Genesis Quezada
8-970-10003
Y
Carlos Maestre
4-810-1518
Dossier:
“Técnicas de laboratorio”
Prof. Ricardo Saldaña
Fecha de entrega:
29 de septiembre del 2021

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“Un poco de ciencia aleja de Dios, pero mucha ciencia devuelve a él.“
-Louis Pasteur

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Indice
Autopresentación……………………………………………………………..pág 4.
Objetivos……………………………………………………………………….pág 5.
Introducción……………………………………………………………………pág 6.
I. Recolección y procesamiento del espécimen…………………pág 7.
IA.Resumen……………………………………………………….pág 7.
IB.Análisis…………………………………………………………pág 10.
II. Exámen microscópico de materiales provenientes
de sitios infectados………………………………………………pág 11.
IIA.Resumen………………………………………………………pág 11.
IIB.Análisis…………………………………………………………pág 14.
III. Uso de morfología de las colonias para
identificación presuntiva de microorganismos…………………pág 15.
IIIA.Resumen………………………………………………………pág 15.
IIIB.Análisis…………………………………………………………pág 18.
IV. Identificación bioquímica de bacterias Gram negativas……….pág 19.
IVA.Resumen………………………………………………………pág 19.
IVB.Análisis…………………………………………………………pág 22.
V. Inmunodiagnóstico de enfermedades infecciosas……………..pág 23.
VA.Resumen………………………………………………………..pág 23.
VB.Análisis…………………………………………………………..pág 26.
VI. Mecanismos de acción antibacterial y
mecanismo de resistencia de las bacterias………………………pág 27.
VIA.Resumen……………………………………………………….pág 27.
VIB.Análisis…………………………………………………………pág 30.
VII. Aplicaciones del diagnóstico molecular…………………………pág 31.
VIIA.Resumen………………………………………………………pág 31.
VIIB.Análisis…………………………………………………………pág 34.
VIII. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos………………pág 35.
VIIIA.Resumen……………………………………………………pág 35.
VIIIB.Análisis……………………………………………………….pág 38.
Conclusión………………………………………………………………………pág 39.
Bibliografía………………………………………………………………………pág 40.
Anexo…………………………………………………………………………….pág 41.

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Autopresentación
Mi nombre como es señalado en la presentación, es Genesis Quezada, tengo 20 años y
soy estudiante de medicina de 2do año, estudie en Changuinola American Academy y he
residido en Bocas del Toro por 10 años; para mi esta carrera es una puerta hacia la
posibilidad de ayudar a personas, no solo a los enfermos, sino para todos aquellos que lo
necesiten; principalmente las madres, futuras madres y los niños. Si se toman en cuenta
estos elementos de la sociedad y se protegen y educan, la vida de los niños así como el
futuro puede cambiar radicalmente.
Yo me llamo Carlos Maestre tengo 23 años, soy estudiante de medicina 4to semestre,
vivía en David san mateo, luego puerto armuelles y finalmente caldera gracias a los
esfuerzos de mi labor y ahorros, sobre todo a Dios por brindarme esta oportunidad y
bendición de llegar hasta aquí hoy dia, he perdido muchas personas cercanas a mí a lo
largo de mi vida y siempre culpe a todo y a todos menos a mí por no poder hacer nada,
veo a los médicos como héroes que dejan sus vidas en los hospitales para hacer felices y
salvar a los demás eso quiero de mí y hasta allí quiero llegar dentro de mi carrera.

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Objetivos
 Reconocer y estudiar los diversos mecanismos de resistencia de
microorganismos.
 Ser capaz de aplicar la teoría en un campo de laboratorio práctico.
 Conocer los métodos más eficacez para el diagnóstico de patologías causadas
por microorganismos.
 Determinar el papel de las nuevas tecnologías en los procesos de diagnóstico de
microorganismos.
 Comparar conocimientos previos de genética con los aplicados para el
diagnóstico molecular o de ADN de los microorganismos.

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Introducción
Cómo estudiantes de medicina, debemos reconocer los distintos métodos de diagnóstico
a los que podemos recurrir para el correcto manejo de un caso. Si bien no se relacionan
mucho con la práctica de laboratorio, como cualquier tema en la medicina es necesario
que se conozcan los principios básicos, de los mecanismos y práctica de laboratorio de
microbiología. Muchas de las enfermedades, que son transmitidas hospitalizaciones, son
causadas por la acción de bacterias o microorganismos, cuál es tienden a ser muy
cambiantes debido a la frecuentes mutaciones a las que son sometidos con el fin de
aumentar su patogenicidad y su resistencia a fármacos utilizados generalmente para su
eliminación del organismo del hospedador. Éstos factores deben ser estudiados y
comprendidos para evitar que en el futuro no se pueden encontrar soluciones
farmacológicas o del tratamiento contra estas enfermedades causadas por agentes
microbianos. Por ello en este dos cierre se incluirán diversos capítulos resumidos, con el
fin incluir o abarcar los temas y puntos más importantes de cada uno de los capítulos a
tratar.
I. Recolección y procesamiento del espécimen

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IA. Resumen
Aspectos fundamentales en la recolección:
 Si es posible, recolectar el espécimen en la fase aguda de la infección y antes de
administrar antibióticos.
 Seleccionar el sitio anatómico correcto para la recolección del espécimen.
 Recolectar el espécimen utilizando una técnica y los suministros apropiados, con
contaminnación mínima por biota normal.
 Recolectar la cantidad apropiada del espécimen.
 Empacar el espécimen en un contenedor o medio de transporte diseñado para
mantener la viabilidad de los organismos y evitar peligros de unna fuga.
 Marcar con presición el espécimen, indicando el sitio anatómico específico y la
información del paciente (nombre del paciente, número de identificación, fecha y
hora de la recolección de la muestra).
 Transportar el espécimen con rapidez al laboratorio o hacer preparativos para
almacenar el espécimen en un ambiente que no degrade los organismos
sospechosos.
 Notificar por adelantado al laboratorio si se sospechan patógenos inusuales o
agentes de bioterrorismo.
Algunas muestras deben ser tomadas por el mismo paciente, como: las heces, orina y
esputo (esputo espectorado).
La información del etiquetado y formalario , ya que para realizar un análisis de calidad el
laboratorio necesita información específica concerniente al paciente y la muestra. La falta
dee información puede formar eslabón debíl.
El personal de salud debe adherirse al sistema de seguridad necesario para analisar una
muestra. Cada espécimen debe tener un almacenamiento específico dependiendo del tipo
de muestra y agente sospechoso.
Dos tipos de muestras con las que puede utilizarse preservativos son la orina y heces, se
ha utilizado ácido bórico para mantener colonias urinarias. En el caso de las heces estas,
se pueden refrigerar para preservarlas pero si este tiempo sobrepasa las 2 horas se debe
añadir medio de transporte Cary-Blair.
Los anticoagulantes se usan para prevenir la coagulación de los especímenes, incluso la
sangre, la médula ósea y el líquido sinovial. Es difícil aislar organimos en un material
coagulado. Es importante la concentración y el tipo de anticoagulante, el polianetol
sulfonato sódico es el mayormente utilizado.
Los medios de sostén o transporte son otro medio de preservación que ayuda a que los
microorganismos no se reproduzcan o crezcan y se arruine la muestra. Es común utilizar
medios de transporte Stuart o Amie. Los especímenes de N.gonorrhoeae pueden colocarse
de anera directa en sistema JEMBEC. Los especímenes recolectados en la cabecera del
paciente suelen ser más suceptibles a contaminaciones.
Recepción y procesamiento del espécimen
Los especímenes requieren de un procesamiento expedito luego de su llegada al
laboratorio, aveces esto puede ser imposible. Para ello estas se dividen en niveles: nivel
1, deben procesarce inmediatamente son críticos e invasivos (muestra de líquido
amniótico, sangre, LCR, válvulas cardíacas y líquido pericárdico); nivel 2, son muestras

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no preservadas que deben ser procesadas rápidamente para evitar la perdida de la muestra;
nivel 3, se basa en especímenes que requieren ser cuantificados y porello no se puede
retrasar el procesamiento, ya que esto significaría un aumento o disminución del número
de especímenes en la muestra; y el nivel 4 son las que se pueden retrasar, ya que no son
críticas e invasivas, y la parte más importante esque ya vienen procesadas.
Hay casos en que los especímenes pueden ser inadecuados, como en los siguientes casos:
 La información del formulario no coincide con la de la muestra.
 No hay identificación del paciente en el envase de la muestra.
 El espécimen no se transporta en un medio adecuado presenta fugas.
 La cantidad del espécimen en inadecuada para desarrollar todas las muestras
requeridas.
 El tiempo de transporte del espécimen ha sido mayor a 2 horas y no ha sido
preservado.
 El espécimen se recibe en un fijador como la formalina.
 Se solicita un cultivo anaeróbico en un espécimen en el cual los anaerobios son
nativos.
 El procesado dee microbiología de una muestra particular produce datos
cuestionables.
 El espécimen esta seco
 Se envió más de una muestra de la misma fuente y del mismo paciente en el
mismo día.
 Se envió un hisopo con múltiples peticiones para diversos organismos.
 La colaración de Gram del esputo expectorado revela al menos de 25 leucocitos
y más de 10 células epiteliales por campo de bajo aumento, y flora microbiana
mixta.
El procesamieento de las muestras inicia con la observación macroscópica, ya que esta
proporciona informacílon muy útil, principalmente características físicas, las anotaciones
que se deben realizar deben incluir: claridad del líquido, presencia de sangre o moco,
consistencia de las heces, hisopado o aspirado, volumen y el color. Esta etapa ayuda a
determinar si es necesario realizar un procesamiento especial.
El exámen de microscopia directa es de gran utilidad, ya que es rápida. Puede determinar
la calidad del espécimen. En algunos especímenes puede no ser la mejor opciónn o no
proporcionar información adecuada. La coloración Gram es la más utilizada.
Existen diversos tipos de cultivo, que pueden dividirse de acuerdo a su capacidad de
soportar el crecimiento bacteriano: medios no selectivos (soportan la mayoría de bacterias
no exigentes), medios selectivos (ayudan al crecimiento de ciertas bacterias e inhiben el
de otras), medios enriquecidos (contienen estimuladores de crecimiento), caldo
enriquecido (estimula crecimiento de un número pequeño de bacterias), medios tipo caldo
(son suplementos).
La elección del tipo de medio depende de la especie y tipo de muestra. Los medios de
sembrado primario incluyen: un medio agar no selectivo, medio enriquecido para
organismos exigentes o de líquidos corporales normalmente estériles, medios selectivos

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y diferenciales para organismos Gram negativos entéricos, medios selectivos para Gram
positivos y Gram negativos mixtos, medio selectivo adicional o caldo de enriquecimiento
para patógenos específicos, medio tipo caldo para especímenes de líquidos corporales.
Los especímenes como los fluidos corporales estériles, pus, orina y esputo se pueden
inocular directamente en medios seleccionados. Los especímenes en hisotopos también
se pueden inocular directamente. Los tejidos se deben homogenizar. Los especímenes se
pueden inocular en placas de agar con un trazo de aislamiento de propósito general para
producir un estimado semicuantitativo del crecimiento. La estría de aislamiento de
propósito general e útil para la mayoría de los especímenes; las muestras de orina se
inoculan al utilizar un aislamiento cuantitativo. Después se deben establecer las
condiciones de incubación, ya sea aerobios o anaerobios, incluso aquellas bacterias que
son capnófilas y requieren una cconcentración aumentada de CO2.
A medida que se realizan estos procedimientos se debe considerar las preguntas ¿Cuál es
la fuente del espécimen?¿Esta fuente tiene biota normal o es unna fuente estéril? ¿Qué
bacterias se encuentran y como lucen estas colonias? ¿Cuáles son los patógenos más
probables en esta muestra? ¿Cuál es la morfología de las colonias de los patógenos? ¿Cuál
medio esta demostrando crecimiento y cuál es el propósito del medio? Para ello se
requiere entrenamiento profesional. Hay especímenes que son rutinarios y por ello poseen
procedimientos de evaluación estandar muy establecidos. En las situaciones en las que
se observen especímenes no rutinarios, el laboratorio debe utilizar un medio bien pensado
quee garantice que se cultiven de manera adecuada. Las muestras no rutinarias pueden
incluir injertos venosos, catéteres de múltiples luces, válvulas cardiacas, soluciones de
impregnación de implantes, perfundidos, muestras de agua y equipo. Ya existen
procedimientos de aalguunas de ellas, como las muestras para esterilidad del agua,
soluciones de impregnación de implantes.
La fase postanalítica se basa en la comunicación de los resultados. Se debe hacer lo
posible para proporcionar información precisa y oportuna. Se deben comunicar los
resultados primarios. Informe debe estar libre de jerga y abreviaturas microbiologícas. En
casos críticos se deben tener listos lo antes posible y reportarse de manera inmediata al
médico.

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IB. Análisis
En este capítulo se nos resume acerca de los diversos métodos que se pueden utilizar para
la toma de muestras, su inoculación, incubación, análisis y comunicación de los
resultados.
Es importante que el estudiante de medicina conozca estos conceptos, usos y medios de
empleo; ya que ello ayudaría a la mejor selección de prueba, además de que el médico es
generalmente el que toma las muestras de tejido, lesión, o cualquier líquido corporal
(sangre, LCR). Una de las principales razones por las cuales se rechazan muestras, es una
muestra inadecuada; debido a que se seleccionó un lugar anatómico inadecuado, poca
cantidad de muestra, muestra contaminada, o una muestra no adecuada para el tipo de
especie de la cual se sospecha. Por ello, es clave que el estudiante de medicina se entrene
para la toma de muestras correctas, claves para un correcto diagnóstico.
Estos análisis además poseen una rutina, gracias a que existen patógenos que son muy
frecuentes; esto es positivo ya que puede agilizar los procesos de cultivo, observación,
obtención de resultados; gracias a ello se pueden detectar mucho más rápido la causa de
la enfermedad por bacterias comunes en casos de meningitis, diarrea, malestar general,
indigestión, ETS, entre otros. Patógenos como S. Aureus, S.pneumoniae, B.antrax, y otros
y poseen un planeamiento o rutina en su cultivo y análisis.
La comunicación de los resultados la vemos como la parte más fundamental y que debe
ser sencilla y sin jergas microbiologas, esto debido a que los médicos NO son
microbilogos, los médicos son enseñados para realizar posibles hipótesis de diagnóstico
que comprobaran con la solicitud de diversas pruebas y estos resultados seran evaluados
para determinar un tratamiento adecuado a cada paciente. Esto es de clara importtancia,
un lenguaje no conocido puede dificultar este proceso o retrasarlo, y ello puede poner en
riesgo la vida del paciente.

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II. Examen microscopico de materiales provinientes de sitios
infectados.
IIA. Resumen
En 1884 Christian Gram desarrollo la coloración de Gram.
La visualización directa de los patógenos se convierte en evidencia priimaria, o directa,
que confirma o refuta la impresión clínica inicial del médico. Los resultados de cultivo
casi siempre se resiven demasiado tarde como paea cambiar la terapia presuntiva. En la
mayoría de los casos estos sirven como confirmación de exactitud de las elecciones
terapéuticas ya tomadas e implementas.
En la preparación de muestras, como en los frotis, los especímenes deben examinarse en
forma macroscópica para determinar un mejor abordaje, este debe producir monocapas y
no deben ser opacas.
 Frotis de hisopos: no deben prepararse frotis a partir de un hisopo luegoo de que
este se haya utilizado para inocular medios de cultivo. Estos frotis se preparan al
rodar el mismo hacia adelante y hacia atrás sobre áreas contiguas de la lámina de
vidria para depositar una capa delgada de material.
 Frotis de líquidos espesos o semisólidos: hisotopo se puede usar en muestras de
heces, se sumerge en el espécimen por varios segundos y se utiliza para preparar
una diseminación delgada del material sobre la lámina de vidrio para su coloración
y visualización.
 Frotis de materiales espesos, granulares o mucoides: el material opaco debe
diseminnarse en forma delgada, de forma tal que se deposite una moonocapa de
material en algunas áreas. Lo mejor esque hayan capas delgadas y gruesas. Si hay
granulos estos debeen triturarse con la ayuda de otra lámina.
 Frotis de líquidos claros: orina, LCR y trasudados; deben colocarse een la lámina
en forma dee gota y no ser diseminados. Se deb marcar el área de la gota. La
centrifugación es la técnica preferida para este tipo de espécimen. Si el líquido es
turbio u opaco se debee diseminar en la placa o utilizar el método anterior.
 Preparaciones de citocentrífuga: método excelente para líquidos no viscosos. Este
deposita loss elementos celulares y los microorganismo de la muestra en la
superficie. Lo cual facilita su observación.
La tinción da un color artificial a los elementos del frotis. Existen muchos tipos de
coloración como las simplles, diferencialess y las mediadas por sonda. Algunas
coloraciones se utilizan como montajes húmedos en especímenes líquidos, como la tinta
china para el LCR.
El examen de especímenes debe comenzar conn una evaluación macroscópica y luego ir
avanzando en el nivel de aumento necesario para la identidicación de un patógeno o
incluso su ausencia. El caballo de battalla de un laoratorio es el microscopio de campo
claro.

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La coloración de Gram o la coloración ácido-alcohol resistente es el método más rápido
y menos costoso para lograr un diagnóstico presuntivo en contextos clínicos comunes.
Hay más de 10 a la 5 unidades formadoas. De colonias de oorrganismos infecciosos porr
milimetro en la infecciones clínicamente visibles. Es impoortantte que se distingan las
infecciones monomicrobianas de las polimicrobianas. Las presentaciones
polimicrobianas requieren de un mayor análisis, y estas generalmente surgen de la
microbiota desplazada o alterada, casi siempre se presenta en la región cutánea, la
orofarínge, gastrointestinal y la vaginal.
Siempre se debe revisar la lámina a simple vista y reealizar anotaciones de su consistencia
y distribución del material. Los especímenes pueeden ser homogéneos o heteregéneos y
pueden contener patógenos distribuidos de manera regular a lo largo del espécimen o
limitados a un campo visuall. Debeb seguirse una línea de veriificación mental de
iinquietuudes hasta que se desarrolle el hábito sistemático de búusqueda en la lámina. Los
restos amorfos usualmente constituyen el remanente de tejido mezclado con los productos
de degradación o los líquidos de la inflamación aguda, estos siempre deben someterse a
una búsqueda de organismos. Se deben tomar en cuenta estructuras inesperadas como la
espiral de Curschmann, un tapón de moco encontrado con facilidad en los pacientes con
asma y se reconoce con mucha más facilidad en observaciones de bajo aumento.
Todos los gránulos o granos, y el transfondo debn examinarse de manera cuidadosa. Debn
mantenerse criterios estrictos ooara los morfotipos microbianos. Se debn evitar
istracciones por una tinción Gram positiva muy precipitada o por la presencia de gránulos,
queratohialinos u otros artefactos. Deben evaluarse los microorganismos para evaluar su
morfología y reacción a Gramm. Bacterias con una pared celular dañada, muertas o
tratadas con antimicrobianos pueden presentar una coloración Gram negativa falsa.
El examen microscópico tambien puede revalar la utilidad de una muestra para el
diagnóstico el manejo del cultivo. El procesamiento e interpretación del cultivoo de estos
especímenes no representativos puede llevar a un retrasos en el tratamiento debido aun
falso negativo o a una terapia antimicrobiana inapropiada, secundaria a un falso positivo
proviniente del crecimiento de biota normal o biota alterada por antimicrobianos. Se han
derivado varios sistemas de gradación o clasificación para ayudar al científico a llegar a
decisiones relacionadas con el cultivo del espécimen. El puntaje Q de Barlett de las
muestras de esputo y el método de Murray Washington para la evaluación de
contaminación de una muestra documenta la asociación de 10-20 células epiteliales
escamosas por campo de aumento de 100X con especímenes inacptables y 10-25 PMN
por campo a 100X con especímenes significativos. Sistema de puntuación de Nugent para
los frotis vaginales coloreados con Gram se utiliza para el diagnóstico de la vaginois
bacteriana.
Los materiales contaminantes se reconocen como materiales no provenientes del sitio de
recolección, no aportados por la respuesta inflamatoria de los tejidos o sin probabilidad
de contener el organismo infectante. Los materiales contaminantes más molestos son

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aquellos que contienen microorganismos que crecerán en el cultivo y confundirán
potencialmente la interpretación del mismo.
Algunos criterios son que debe haber menos de 25 células PMN por campo de bajo
aumento y más de 10 células epiteliales o bacterias mixtas por LPF.
Los materiales contaminantes se cuantifican coomo 1+ (leves), 2+ (moderados), 3+
(moderadamente abundantes) o 4+ (abundantes).
En caso de contaminación debe pedirse un cultivo nuevo utilizando una técnica de
recolección cuidadosa.
En cuanto a la evaluación de la suceptibilidad a antimicrobianos excepto para los
patógenos primarios, no es apropiado realizar estas evaluaciones.
Los materiales locales, son aquellos que se observan menos de 25 leucocitos PMN por
LPF y menos de 10 células epiteliales contaminantes por LPF, junto con elementos
celulares y líquidos locales del área muestreada. La biota microbiana local se cuuanntifica
como 1+ a 4+. Pueden usarse la designación de microbiota usual o una descripción
presuntiva breve de crecimiento tipo colonia. Ninguna prueba de susceptibilidad a
antimicrobianos es apropiada.
La purulencia; menos de 25 leucocitos PMN por LPF y ninguna o pocas células epiteliales
menor a 10 con bacterias mixtas por LPF, puede haber moco o material proteináceo
espeso. Solo se cuantifican los organismos asociados íntimamente con WBC, moco
exudado proteináceo. El crecimiento de colonias debe correlacionarse con el frotis
coloreado con Gram.
Los materiales mixtos consisten en exudado purulento, materiales contaminantes y
materiales locales en un solo frotis. Menos de 25 leucocitos PMN por LPF y menos de 10
células epiteliales o bacterias contaminantes por LPF, pueden haber secreciones locales.
Solo se cuantifican los organismos asociados de manera íntima con el exudado purulento,
las cantidades de otros materiales también se cuantifican. Debe solicitarse uun cultivo
nuevo si se exhibe purulencia y no pueden interpretarse los resultados cultivos. Deben
establecerse pautas para purulencia en la evaluación de los organismos que parezcan ser
significativos.
Los reportes de los resultados del examen directo del espécimen deben ponerse a
disposición tan pronto sean culminados. Estos reportes deben ser simples e incluir todos
los elementos informativos que necesite el médico para entender el reporte.

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IIB. Análisis
Las indicaciones sobre la realización del frotis son muy específicas y estas dependen del
tipo de muestra que se haya enviado al laboratorio. Aunque el médico no participe mucho
en esta parte del procesamiento de las muestras, pero por un lado es necesario que conozca
los principales principios de las pruebas con el fin de que se identifiquen los posibles
obstáculos para el diagnóstico definitivo.
Aparte de ello, vemos que cada tipo de muestra posee un método de realizamiento
específico para evitar errores al momento de observar los materiales que esta muestra
contenga, lo que determina la observación de una cantidad adecuada de microorganismos
y también de materia contaminante. Debido a la gran variabilidad de muestras que pueden
ser sólidas, semisólidas o líquidas; aunque al igual el médico no posee mucha
interferencia en esta parte del diagnóstico, si puede ayudarlo en caso de que las pruebas
puedan ser erróneas a dar una pista de las razones por la cual los resultados no ffueran
correctos o verídicos del todo.
Se nos presentan muchos indicadores de niveles de contaminación en las muestras,
muchas pueden tener diversos materiales que pueden llegar a confundir al personal de
laoratorio; para evitar estos casos es necesario que se conozcan los elementos que pueden
ser considerados contaminantes y cuales son diagnósticos, esto se logra mediante el
estudio de las morfologías de los patógenos que se quieran encontrar, al igual que depende
de factores como una buena elaboración del frotis y la experencia laboral.

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III. Uso de morfología de las colonias para la identificación presuntiva
de microorganismos.
IIIA. Resumen
La importancia de la capacidad para rreconocer y describir la morfología de las colonias
de los aislados recuperados en medios de cultivo, así como la interpretación de los frotis
de especímenes clínicos teñidos con Gram, nunca se enfatiza lo suficiente.la descripción
de las carácterísticas fisicas del crecimiento de los microorganismos en los medios de
laboratorio facilita los procesos de identificación inicial.
La capacidad del microbiólogo para proporcionar una identificación presuntiva; extiende
la utilidad del diagnóstico mucho más allá de la identificación, se puede aportar una
identificación presuntivva para el médico reduciendo el tiempo que conlleva preparar la
muestra y esperar los resultados, aumenta la calidad de la atención al paciente mediante
el reporte rápido de los resultados y el incremento de la relación costo-efectividad de las
pruebas de laborotario y jugar un papel significativo en el control de calidad
especialmente de los procedimientos automatizados y otros sistemas de identificación
diponibles a nivel comercial.
La siembra primaria se refiere a la inoculación del espécimen clínico en medios de
laboratorio. Generalmente, se observan la morfología de las colonias de organismos
aislados en cultivos primarios luego de 18-24 horas de incubación. Este tiempo. Puede
diferir de acuerdo a las especies y el tipo de medio que se utilice. Se debe estar conciente
de factores que puedan alterar la morfología de los organismos; estos comprenden el
medio de cultivo naturaleza inhibitoria de los organismos, agentes antimicrobianos que
pueden alterar el medio.
La interpretación de los cultivos primarios, referida como lectura de placa, es un examen
comparativo de las morfologías de las colonias de microorganismos que crecen en
diversos medios de cultivo. Cada tipo de placa de agar se examina en reelación a otra. Se
lleva a cabo un examen comparativo del crecimiento de las colonias de un espécimen en
un grupo de medios de cultivo.
Algunos medio de cultivo pueden ser selectivos o diferenciales; en los medios selectivos
se añaden agentes para inhibir el crecimiento de algunas bacterias, lo que permite una
mejor recuperación de las bacterias patógenas que son resistentes a agentes inhibitorios;
lo medios diferenciales permiten diferenciar entre cepas bacterianas con base en la
morfología de las colonias, se basan en la capacidad de algunas bacterias para utiliza
sustrato que produce con frecuencia un cambio en el pH que se detecta por el cambio de
color. Estos medios ayudan a realizar una distinción inicial entre los aislados Gram
positivos y los Gram negativos. Medios como el agar SBA y el agar CHOC apoyan el
crecimiento de varios organismos exigentes, así como de organismos no tan exigentes.

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Por lo general, los organismo que crecen en agar SBA lo hacen en agar CHOC, aunque
no todos los organismos que crecen en agar CHOC crecen en agar SBA. El crecimiento
en agar SBA y CHOC, así como en ausencia en agar MAC, es indicativo de un aislado
Gram positivoo o de bacilos/cocos Gram negativos exigentes. Los bacilos Gram
negativos se describen mejor en agar MAC debido a que estos organismos producen
colonis de aspecto similar en el agar SBA y en el agar CHOC. En estos últimos dos agares,
los bacilos Gram negativos producen colonias grandes de color gris y de aspecto algunas
veces mucoides; cuando son hemolíticos se aprecia la presencia de hemolísis en SBA. El
agar MAC es muy util para identificar bacterias fermentadoras de lactosa de aquellas que
no lo son, las fermentadoras provocan un cambio en el pH de su medio cambiando el
colorr a tonos rosados. Las colonias no fermentadoras por otro lado, no cambian el color
de su medio y conservan un aspecto claro e incoloro. Esta diferenciación es
particularmente importante en el tamizaje de patógenos entéricos en los cultivos de heces.
En el SA, la hemolísis observada en el medio que rodea o se encuentra inmeediatamente
por debajo de una colonia constituye una reacción ocasionada por la actividad enzimática
o de toxinas de las bacterias. La hemólisis en el SBA es útil para la ideentificación
presuntiva. Es importante determinar si la decoloración del medio es consecuencia de una
verdadera hemolísis causada por el organismo en crecimiento en la placa. Muchas veces
se debe remover la colonia con el fin de observar el patrónn hemolítico o por
transiluminación.
 La alfa hemolísis representa el lisado parcial de los eritrocitos en una placa de
SBA alrededor y por debajo de la colonia, lo que provee de una decoloración verde
del medio.
 La ß-hemolísis representa el aclarado completo de los eritrocitos en el SBA
alrededor o por debajo de las colonias debido a la lisis completa de los RBC. Se
dividen en grupos:
o Grupo A se presenta una decoloración de zona ancha y
profunda.
o Grupo B producen uuna zona difusa y estrecha cerca de
la colonia.
Estas características son indicios útiles para la identificación de ciertas especies
bacterianas. El agar CHOC no muestra hemolísis debido a que los RBC presentes en el
medio han sido lisados durante la preparación del medio. Los organismos que son alfa
hemolíticos o beta hemolíticos en SBA casi siempre exhiben una coloración verde
alrededor de la colonia en agar CHOC. Pero esta coloración no debe ser considerada como
una característica hemolítica.
Las colonias se describen como grandes, medianas, pequeñas o puntiformes. Rara vez se
mide la colonia. El tamaño casi siempre es una comparación visual entre géneros y
especies.
Debe observarse el borde de las colonias y debe describirse la forma o margen como:

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 Liso
 Filamentoso
 Rugoso/rizoide
 Irregular
Ciertos organismos pueden formar un ejambre que es un manto borroso de crecimiento,
situado en la superficie, que se extiende mucho más allá de las líneas de siembra. Los
difteroides producen colonias que tienen una apariencia reseca. Ciertas levaduras
producen colonias que pueden ser cremosas, blancas con superficie mate; los
estafilococos producen colonias húmedas, cremosas, de color blanco a amarillento.
La elevación debe determinarse al inclinar la placa de cultivo y observar la parte lateral
de la colonia; puede ser convexa, plana, umbilicada o umbonada. Los estreptococos beta
hemolíticos generalmente producen colonias planas.
La densidad de de la colonia puede ser transparente, traslúcida u opaca. Para apreciarla
es útil recurrir a la transiluminación.
En contraste con la pigmentación el color es un término usado para describir un género
en particular en forma general. Las colonias pueden ser blancas, grises, amarillas o
colorantes.
La consistencia se determina al tocar la colonia con un asa estéril. La consistencia de una
colonia puede ser quebradiza, cremosa, seca/cerosa, incluso pegajosa.
La producción de pigmento es una característica inherente de un organismo específico,
confinada por lo general a la colonia, aunque algunos pigmentos se pueden difundir por
el medio. Casi siempre la producción de pigmento se aumenta al hacer crecer el cultivo
a temperatura ambiente. Los pigmentos pueden ser azules, púrpuras, verdes metálicos o
incluso negro.
Debe determinarse el olor cuando se retira la tapa del cultivo y el olor se disipa en el
ambiente circulante. Nunca se debe inhalar la placa directamente. Los olores que se
pueden llegar a percibir en algunas colonias de especies específicas son: olor similar a
frutas (uvas), calcetines viejos, pútrido, olor a nido de ratón. Las colonias pueden adoptar
múltiples de estas características mencionadas.
También se pueden detectar indicios importantes para la identificación de un organismo
mediante la observación del crecimiento del mismo en medios líquidos como el
tioglicolato. Las serpentinas o enredaderas y bolas algodonosas se asocian con ciertas
especies de estreptococos. La turbidez, que se refiere a la nubosidad del medio debida al
crecimiento, es producida por muchas Enterobacterias.

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IIIB. Análisis
Las características morfológicas de muchas bacterias al producir colonias en cultivos de
dictados al diagnóstico puede ayudar en la identificación de los géneros y especies de
cada familia bacteriana. Es importante, que estas características sean tomadas como una
fuente rápida mediante la visualización de la colonia para qué terminal a primera vista,
cuál es la identificación o patógeno causante de la sintomatología. Aunque el médico
tampoco participa en esta parte del diagnóstico, el microbiólogo puedo utilizar éstas
características para agilizar el proceso, y al agilizarlo podemos informar a los médicos de
forma más rápida acerca de la identidad del patógeno. Al agilizar, el diagnóstico también,
se agiliza el proceso o asignación de un tratamiento. Podemos ver que cada una de las
características morfológicas observables a simple vista, son distintas para cada una de las
especies e incluso pueden llegar a mostrar varias de estas características en una sola
muestra; lo cual nos ayuda a confirmar de forma rápida no entra sospechas acerca de lo
de entidad del patógeno. Características con el color, el olor, la forma, elevación,
densidad; son características propias de las bacterias y aunque muchas veces como
estudiantes solamente se ve el atractivo visual que esto provoca, no señalan no sólo la
identidad del patógeno, sino también sus características patológicas picados en este tipo
de lesiones en los cultivos y por lo tanto también en tejidos; por lo cual pueden provocar
cambios tisulares y grandes escalas en aquellos afectados por la acción o presencia de
estos organismos. Así que no sólo se trata de una característica física percibíble por los
sentidos, sino qué forma una señal o signo que nos puede indicar el modo de actuar o de
acción del microorganismo al momento de infectar un tejido o célula; Y si nos dan Esta
información, podemos imaginar o armar un rompecabezas de la posible estructura
bacteriana que presenta el patógeno, Dándonos la oportunidad de analizar y crear un
esquema de esta posible estructura con el fin de encontrar las diversas debilidades de este
estructura y por lo tanto encontrar, los posibles tratamientos o mecanismos para la
eliminación del patógeno en el organismo.

19
IV. Identificación bioquímica de bacterias Gram negativas.
IVA. Resumen
Las pruebas bioquímicas se basan en el fenotipo de los microorganismos y detectan
características observables y cuantificables. Se realizaba al principio en tubos de ensayo,
aunque estos medios eran complejos y generalmente utilizaban mucho tiempo para la
preparación y final obtención de resultados. Por ello, se han desarrollado métodos
automatizados que permitan un proceso más eficaz y rápido. Luego de la inoculación un
sistema computarizado, realiza un análisis en su base de datos e identifica al patógeno.
Los sistemas automatizados pueden proporcionar identificación y patrones de
susceptibilidad a antimicrobianos preliminares en pocas horas.
La serotipificación, se utiliza en ocasiones con las pruebas bioquímicas para identificar
diferentes cepas de bacterias dentro de una especie. Esta usa anticuerpos para detectar
antígenos específicos localizados en la superficie bacteriana. Los análisis de biología
molecular se basan en el genotipo del organismo y se cree que son más precisos que los
exámenes de fenotipo. Los ensayos de ácido nucleico, basados en la secuencia de ácidos
nucleicos, son sumamente sensibles, específicos y rápidos, proporcionando resultados en
pocas horas después del inicio de la prueba genotipica.
Entre las bacterias hay una gran diversidad en la capacidad de usar el carbohidrato, sin
embargo, la prueba de determinación de carbohidratos más importante es la
determinación del uso de lactosa. Se necesitan dos moléculas esenciales para que una
bacteria capte la lactosa: lactosa permeasa que sirve como enzima de transporte que
facilita el ingreso de la la molécula de lactosa a través de la membrana de la bacteria; la
otra molécula, es la beta galactosidasa la enzima hidroliza la lactosa en glucosa y
galactosa, luego la primera queda disponible para el metabolismo en su mayor parte a
través de la vía de EMP, también llamada como el proceso glicólisis. Algunas bacterias
solo son capaces de utilizar los carbohidratos en su forma más simple que es la glucosa,
por lo que no son capaces de atacar el disacárido lactosa. De forma muy similar las
especies bacterianas que no pueden fermentar glucosa, son incapaces de utilizar la lactosa.
Algunas bacterias son totalmente incapaces de utilizar cualquier carbohidrato; en su lugar,
llegan a utilizar otras moléculas orgánicas como lo son los aminoácidos, para poder
producir energía y también como una fuente de carbono. Este tipo de organismos fueron
bautizados como asacarolíticos.
 Pruebas de oxidación-fermentación: Las bacterias pueden utilizar carbohidratos
mediante oxidación, fermentación o por ambas vías, esta es importante para la
identificación de la bacteria. Estas pruebas determinan la capacidad de fermentar
carbohidratos en un medio basal. Después de la glicólisis, el resultado final es un
ácido o ácido con gas. Por lo que indicadores de pH determinan la presencia de
un ácido. Hay bacterias que producen un solo ácido y orras que son fermentadores
de ácidos mixtos. En cuanto a la oxidación, se requiere de un medio aeróbico y
produce dióxido de carbono; la fermentación produce mucha más acidez en
comparación con la oxidación pero la fermentación genera menos energía en

20
comparación. El medio basal O/F contiene 1% de carbohidratos y es utilizada para
realizar este tipo de pruebas de identificación.
 Agar triple azúcar hierro: el agar TSI y el agar Kliger Hierro KIA son útiles para
la identificación presuntiva de bacterias entéricas Gram negativas,
particularmente en el tamizaje de patógenos intestinales. Poseen la misma
preparación excepto que el agar TSI contiene lactosa, sacarosa y glucosa. Ambos
agares son utiles para detectar la capacidad de los microorganismos de fermentar
carbohidratos para producir gas a partir de la fermentación de azúcares y para
detectar la producción de H2S. Es importante que las reacciones se lean en un
periode incubación de 18 a 24 horas; de lo contrario es posible obtener resultados
erróneos. Reacciones que pueden ser observadas:
o Sin fermentación: pueden degradar peptonas pero no
fermentar u oxidar.
o Fermentación solo de glucosa
o Fermentación de lactosa/sacarosa
o Producción de H2S
o Producción de gas o ausencia de la misma
 Prueba de orto-nitrofenil-B-D-galactopiranósido: los organismos que son dLF
aparecen como colonias no fermentadorasen el medio de aislamiento primario. En
este caso el organismo carece de la enzima B-galactósido permeasa, pero posee
B-galactosidasa.
Metabolismo de la glucosa y sus productos metabólicos:
 Prueba rojo metilo: las bacterias se incuban en un medio caldo que contiene
glucosa. Debe incubarse por 3 a 5 días a 35ºC. Luego se pasa la mitad del caldo a
un tubo limpio para la pruebade VP. Si la glucosa se metaboliza por vía de
fermentación ácido mixta que lleva a un pH bajo que con la adición de pH MR se
vuelve rojo y si es negativa permanecen amarillos.
 Prueba de Voges-Proskauer: en algunas bacterias, los ácidos formados durante la
fermentación pueden metabolizarce todavía más a 2,3-butanediol a través de la
acetoína intermedia. Luego de incubación, se añade alfa-naftol como
intensificador de color, luego se se añada KOH y 40% de NaOH y luego se agita
para promover la oxidación. En presencia de estos compuestos el diacetilo se torna
rojo con pH neutral, lo que es un resultado positivo. Una bacteria nunca puede
ser positiva para ambos, MR o VP.
Utilización de aminoácidos:
 Pruebas de descarboxilasa y dihidrolasa: las pruebas de descarboxilasa
determinan si una bacteria posee enzimas capaces de descarboxilar aminoácidos
específicos presentes en el medio de prueba. Los productos de la descarboxilación
son moléculas de amina o diamina y CO2 con producción de alcalinidad. La
prueba para detectar la descarboxilación utiliza medio base de descarboxilasa de
Moeller, es un caldo que contiene glucosa, peptonas, 2 indicadores de pH, púrpura
bromocresol y rojo cresol, un aminoácido específico con una concentración de
1%. Si el organismo produce la descarboxilasa específica y se ataca el aminoácido

21
en el medio, la liberación de los productos aminas ocasiona un cambio en el pH
alcalino, lo que lleva a la aparición de un color púrpura que señala un resultado
positivo. Si no se produce descarboxilasa, el color se mantiene amarillo y la
prueba sería negativa.
 Prueba de la desaminasa: aminoácidos pueden ser metabolizados por las
desaminasas. La prueba de la fenilalanina desaminasa determina si un
microorganismo posee la enzima que desamina la fenilalanina a ácido
fenilpirúvico. Medio agar inclinado con 0,2% de fenilalanina, se inocula la colonia
y si hay reacción de color verde es positivo.
Pruebas misceláneas:
 Utilización de citrato: determina si un organismo puede utilizar citrato de sodio
como única fuente de carbono. Las bacterias capaces de utilizar citrato utilizarán
las sales de amonio, con liberación de este compuesto, lo que resulta en un pH
alcalino que cambia el medio de verde a azul.
 DNasa: DNasa bacterianas en su mayoría sonendonucleasas que clivan los enlaces
internos de fosfodiéster y llevan a la producción de subunidades más pequeñas.
El medio de prueba casi siempre contiene ADN al 0,2%. El ADN no hidrolizado
es insoluble en HCl y forma un precipitado. Los oligonucleótidos formados por la
acción de la DNasa se disuelven en el ácido y forman un halo alrededor del inóculo
que se comprende como un resultado positivo.
 Producción de indol: productos de degradación de triptofano. Se inoculan
bacterias en caldo triptófano o peptona. Prueba de indol de Ehrlich, si hay indol
se desarrolla un color rojo.
 Agar inclinado de lisina hierro: contiene aminoácido lisina, glucosa, citrato de
amonio férrico y tiosulfato de sodio. Indicador de pH es púrpura bromocresol. Se
utiliza en su mayor parte para determinar si las bacterias descarboxilan a la lisina.
 Agar motilidad-indol-ornitina: medio agar semisólido que se usa para detectar la
presencia de motilidad, la producción de indol y ornitina descarboxilasa. La
motilidad se muestra por la nubosidad del medio o diseminación del crecimiento
de la línea de crecimiento. La descarboxilación de la ornitina se indica por
presencia de color púrpura en todo el medio.

22
IV.Análisis
En este capítulo, se profundizan Acerca de las características bioquímicas de organismos
Gram negativos; que poseen características muy interesantes en el área de la química.
Muchas de estas, forman parte de sus métodos de acción para la causa de patologías en
los hospedadores. Si bien, éstas no solamente se limitan a eso, sino que son un objeto de
análisis para la realización de estudios de laboratorio bioquímicos para el diagnóstico de
enfermedades. El estudiante de medicina, no tiende a practicar mucho estas pruebas,
excepto en prácticas de microbiología, puede resultar interesante para el estudio de las
características propias de cada bacteria. Es curioso que en este capítulo solo se incluyera
a las bacterias Gram negativas y no a las positivas, lo cual puede deberse a la gran
variabilidad de las propiedades bioquímicas de el grupo de bacterias Gram negativas. No
hay mucho que especificar de este capítulo, además, de resaltar estos puntos de interés.
Vemos también que la coloración es un punto clave para detectar de forma simple si la
reacción es positiva o negativa; sin el uso de pigmentos, la observación o identificación
de la producción de una reacción de fermentación u oxidación sería muy compleja y
requeriría mucha experiencia y práctica; sin embargo, esta simplifica el proceso de
identificación al señalar una reacción por un sencillo cambio de color. Para lograr, este
tipo de identificación identificación, se tuvo que analizar la estructura química de muchos
componentes que forman parte de las reacciones y que pudieran reaccionar como un
pigmento principalmente de acuerdo a los niveles de pH de una reacción bioquímica,
como es en el caso de la fermentación y oxidación ya sea de carbohidratos o aminoácidos;
esto nos quiere decir, que la microbiología no solamente es el estudio de microorganismos
por sí solo, sino que integra otras de otras disciplinas que pueden ayudar para el
reconocimiento y análisis de estos organismos que llegan a causar patologías y que por
ello lo presentan elementos muy importantes en la disciplina de la medicina, integrando
los conocimientos de estas tres disciplinas ya sea la medicina por sí misma, en conjunto
con la microbiología y ésta a su vez con la bioquímica y muchas otras disciplinas más
que ayudan en el estudio correcto y también en la ampliación de los conocimientos
previos que tenemos de esta rama de la ciencia.
La integración de tecnologías, para los sistemas automatizados de diagnóstico; deben ser
resultados ya que le presentan un gran avance para agilizar los procesos de diagnóstico y
por lo tanto para la asignación de un tratamiento adecuado y efectivo; en un límite de
tiempo muy corto a comparación de otros métodos de laboratorio para el diagnóstico de
enfermedades causadas por bacterias gran negativas.

23
V. Inmunodiagnóstico de las enfermedades infecciosas
VA.Resumen
En 1896 se descubrió el fenómeno de la aglutinación bacteriana en el suero humano y
rápidamente fue reconocido como una herramienta muy poderosa. Se determino que el
suero no solo era de gran ayuda para la serotipificación, sino también para evaluar la
capacidad de aglutinación de las bacterias. La reacción del suero de los pacientes con
bacterias era indicativa de una exposición previa al organismo, también determina el nivel
de la respuesta inmune y la protección contra el agente infeccioso.
Los anticuerpos son proteínas que produce el suero humano como resultado de una infecc
por bacterias o virus. La serología estudia estas proteínas y su reacción con antígenos.
Las pruebas serológicas se referian originalmente a muestras corporales como el suero o
la sangre, pero hoy en día también incluyen LCR y orina. También se utilizan enzayos
inmunológicos basados en los principios de las reacciones antígeno-anticuerpo para
detectar y cuantificar analitos, como proteínas séricas, hormonas, y fármacos.
La mayor ventaja de los estudios serológicos es la posibilidad de estudiar y detectar
organismos que son prácticamente imposibles de cultivar. También se pueden utilizar
como una herramienta que determinara el pronóstico o la monitorización de terapias. Una
de las grandes desventajas es el tiempo que se debe esperar para obtener resultados
satisfactorios, para medir la respuesta inmune del huésped frente a un organismo denen
pasar alrededor de 10 a14 días luego del inicio de la infección. También, el anticuerpo
que se va a detectar puede haberse producido contra otro organismo y se puede observar
una prueba con un falso positivo.
Anticuerpos en pruebas serológicas
Antígenos: muchos son específicos y de bajo peso molecular. El anticuerpo policlonal
representa una mezcla de múltiples anticuerpos derivados de múltiples células contra
varios epítopes encontrados en un antígeno o dirigidas frente a diferentes antígenos.
Primera respuesta inmune IgM, seguida de una respuesta inmune anamnésica con IgG.
Las pruebas serológicas que están diseñadas para detectar anticuerpos IgG e IgM por
separado toman ventaja de las diferencias en la producción de IgM entre la respuesta
inmune primaria y una secundaria. A menos que una prueba serológica se diseñe para
medir anticuerpos específicos de tipo IgM e IgG en un solo espécimen de suero, el
diagnóstico serológico de una enfermedad infecciosa requiere de la medición de la
concentración total de anticuerpos en especímenes de suero tanto en fase aguda como de
fase convaleciente. Las desventajas de las pruebas séricas agudas y convalecientes
incluyen múltiples visitas para la extracción de sangre del paciente, así como el tiempo
necesario para detectar una elevación en el título de anticuerpos. Se pueden recolectar
sueros demasiado temprano en el curso de la enfermedad dando como resultado falsos
positivos, en este caso la muestra de la fase convaleciente sería positiva y la de fase aguda
sería negativa; esto se denomina seroconversión que toma lugar entre 2 a 3 semanas luego

24
del comienzo de la enfermedad. Los problemas con los anticuerpos policlonales pueden
reducirse al utilizar anticuerpos monoclonales, estos rara vez aparecen de manera natural
y casi siempre se asocian con algún tipo de proceso anormal de enfermedad inmune.
Tienen avidez y son muy específicos. Si una población bacteriana contiene una forma
alterada o mutada del antígeno puede que no reaccione con el antígeno monoclonal y de
un falso negativo.
La mayoría de las reacciones antígeno-anticuerpo tienen una especificidad elevada, esto
es, los sitios de fijación de antígeno en la molécula de anticuerpo reaccionan con epítopes
específicos y no con otros antígenos que contienen diferente epítopes. Los anticuerpos
producidos en respuesta a una molécula que reacciona también contra un antígeno de una
fuente no relacionada se denominan anticuerpos heterófilos. Debido a la reactividad
cruzada del anticuerpo, muchas veces es mejor llevar a cabo una batería de pruebas
serológicas con organismos que se sabe que mostrarían una reactividad cruzada y hacerlas
con sueros pareados.
Una prueba serológica ideal debería tener una precisión diagnóstica del 100%, en la
práctica estas no cumplen este ideal. Con el objeto de determinar el porcentaje de
individuos expuestos o infectados con anterioridad por los agentes en un área geográfica,
pueden realizarce pruebas serológicas para un agente infeccioso en específico o una
batería de agentes. En algunas situaciones, puede llegar a ser muy importante determinar
si un individuo es inmune a una enfermedad infecciosa específica. Las pruebas
serológicas se utilizan con frecuencia para ayudar a diagnosticar infecciones congénitas
en un recién nacido. Algunos agentes infecciosos tienen la capacidad de cruzar la placenta
y ocasionar infección en el feto. Dichas infecciones pueden ocasionar sólo síntomas
mínimos en la madre durante el embarazo y pueden pasar desapercibidas en ese momento.
Sin embargo, si la madre ni es inmune, la infección puede ser significativa para el feto.
La evaluación del suero de la madre para detectar anticuerpos IgG es inútil a menos que
haya sido sometida a tamizaje prenatalmente o al comienzo del embarazo y los resultados
de las pruebas de anticuerpos hayan sido negativos. La detección de anticuerpos IgM en
el suero neonatal es el método de elección para el diagnóstico serológico de la infección
congénita. La detección de anticuerpos puede requerir una gran cantidad de tiempo para
hacerse positiva. Las muestras se adquieren de casi cualquier fluido corporal.
La reacción de precipitación se encuentra en los ensayos que involucran la difusión de un
antígeno y anticuerpo soluble. La reacción de precipitación tiene su mayor estabilidad
cuando se llevan a cabo en gel de agarosa.
 Inmunodifusión doble: también llamada difusión en gel de Ouchterlony. Esta se
utiliza con mayor frecuencia para detectar exoantígenos micóticos o anticuerpos
séricos. Las reacciones pueden tomar 48 a 72 horas para desarrollarse.
 Inmunodifusión radial simple: se utiliza para cuantificar la concentración del
antígeno, aunque no se usa con mucha frecuencia hoy en día. Es muy lenta.
 Floculación: variación de las pruebas de precipitación. La reacción antígeno-
anticuerpo forma un aglutinado. Detecta anticuerpos reagina.

25
Ensayos de aglutinación (pasiva/activa)
 Aglutinación de latex: la fuerza y rapidez de la reacción varían según las
condiciones de la prueba y según la concentración del antígeno del espécimen.
 Coaglutinación estafilocócica: utiliza un anticuerpo unido a partículas para realzar
la visibilidad de las reacciones antígeno-anticuerpo. Utiliza S.aureus. Es en
extremo específica, aunque puede ser menos sensible que la LA para detectar
pequeñas cantidades de antígeno.
 Hemaglutinación: pasiva o indirecta. Los antígenos microbianos se unen a
eritrocitos por medio de una sustancia que promueva la unión cruzada de los
antígenos.
 Inhibición de la hemaglutinación
 Aglutinación mediada por liposomas
Ensayos de neutralización se basan en la interracción de un antígeno biológicamente
activo con anticuerpos que pueden bloquear o inactivar la actividad biológica del
antígeno. Inmunoensayos marcados:
 Ensayos inmunofluorescentes: método rápido. Anticuerpos marcados son
llamados conjugados. Pueden ser marcados directos o indirectos.
 Inmunoensayos unidos a membrana : las características del flujo y el área de
superficie grande de la nitrocelulosa, el nailon y otras membranas, aumentan la
velocidad y sensibilidad de las reacciones de EIA.
 Inmunoensayos ópticos: se basa en la interracción de los complejos antígeno-
anticuerpo sobre superficies inertes.
 Prueba de fijavión del complemento: Han sido reemplazadas por pruebas más
rápidas y sensibles.
 Western Blot: permite la caracterización de múltiples anticuerpos con diferentes
idiotipos para un agente infeccioso al separar primero de forma electroforética los
antígenos microbianos o virales y transferirlos a una membran de nitrocelulosa.
 Dot blot: sigue los principios de WB pero las proteínas se purifican y aplican de
manera directa a localizaciones específicas sobre la superficie solida.

26
VB.Análisis
En este capítulo se hace incapie en la materia de inmunología, la cual es muy importante
en la formación de médicos. Si bien un médico no realiza estas pruebas, su estudio y
comprensión permitiran comprender la interracción del sistema inmune como la invasión
patógena, lo cual determina el avance de la enfermedad.
Los usos de estas pruebas van mucho más alla de considerarse simplemente diagnóstica,
pueden ayudar al médico a predicir la posible evolución de una infección, determinar el
estado inmune en contraste con la acción del patógeno; sus usos en la epidemiología son
vastos para determinar el grado de infección en poblaciones en estudio, lo cual es de claro
interes al estar frente a casos masivos de una enfermedad o infección en particular, como
es el caso actual con la pandemia a causa del Covid-19.
A parte de ello se nos recalca que en muchos casos puede darse la presencia de falsos
positivos o negativos, por lo que se debe estar atento al estado del paciente para
determinar que tipo de muestra se debe ordenar para confirmar el diagnóstico; una prueba
realizada antes de tiempo o demasiado tarde puede alterar las concentraciones de
anticuerpos o antígenos, alterando los resultados finales de los cuales depende el futuro
del tratamiento. La importancia que poseen en casos de mujeres embarazadas y en el
recién nacido, ayuda a la prevención de enfermedades que pueden transmitirse de forma
congénita.
Muchas de estas pruebas son muy específicas como lo ha determinado este capítulo, pero,
muchas de ellas llegan a ser muy sensibles y especialmente específicas en ciertas
enfermedades como lo es el VIH por ejemplo; gracias a esta particularidad se pueden
agilizar las pruebas de confirmación y diagnóstico de enfermedades que tienden a
debilitar el sistema inmune y poder dar el tratamiento o prevención poblacional adecuada.

27
VI. Mecanismos de acción antibacterial y mecanismos de resistencia
de las bacterias.
VI.Resumen
Los agentes antimicrobianos incluyen a los antibacterianos, antimicóticos, antisépticos,
antibióticos, preservantes, esterilizantes y desinfectantes; todos tienen la capacidad de de
eliminar o suprimir el crecimiento de los microorganismos. Son un componente esencial
de la práctica médica, que se utilizan para tratar, prevenir y controlar la diseminación de
los patógenos en el tejido y en fómites. En la medicina clínica se utilizan
aproximadamente 23 clases únicas y 18 subclases de antibacterianos útiles desde el punto
de vista clínico. Los agentes antimicrobianos se dirigen contra procesos celulares
anabólicos como la síntesis de la pared celular, la síntesis del folato, la replicación de
ADN, la transcripción de ARN y la traducción de ARNm. Estas son consideradas dianas
críticas.
 Inhibición de la biosíntesis de la pared celular bacteriana: el peptidoglicano es un
constituyente mucopolisacárido único de la pared celular bacteriana. La
localización y cantidad varia dependiendo del tipo de bacteria. La biosíntesis del
peptidoglicano tiene cuatro etapas mayores: síntesis de los precursores en el
citoplasma, transporte de los precursores unidos a lípidos a través de la membrana
citoplasmática, inserción de las unidades de glicano en la pared celular y el enlace
y maduración transpeptidación. Los Inhibidores actúan principalmente en las
estapas 3 y 4. Especialmente los B-lactámicos que incluyen a la penicilina.
 Inhibición de la síntesis del folato: la ruta del ácido fólico proporciona las
moléculas precursoras esenciales necesarias para la biosíntesis del ADN de las
bacterias. La ruta esta mediada por dos enzimas clave, la dihidropteroato sintetasa
y la dihidrofolato reductasa, que median la formación del tetrahidrofolato a partir
de dihidrofolato. El sulfametoxazol bloquea el paso que lleva a la formación de
7,8-dihidropteroato al inhibir de manera competitiva la fijación del análogo
estructural ácido aminobenzoico con la dihidropteroato sintetasa. El trimetoprim
bloquea el paso que lleva a la formación de THF al prevenir el reciclado de las
coenzimas del folato mediado por la dihidrofolato reductasa. Estas son moléculas
completamente sintéticas.
 Interferencia con la replicación de ADN: las enzimas necesarias para la
replicación del ADN incluyen las topoisomerasas I, II, III y IV. Las quinolonas
son fármacos antibacterianos que afectan la replicación del ADN al dirigirse hacia
la topoisomerasa II y IV, enzimas consideradas importantes en el control de la
topología, replicación y decatenación de, ADN al final del ciclo de replicación del
ADN bacteriano. La resistencia a las fluoroquinolonas se correlaciona con el uso
del agente en la población humana y se debe principalmente a mutaciones
cromosómicas.
 Interferencia con la transcripción del ADN: la transcripción es mediada por ARN
polimerasa. La rifampina, un derivado sintético de la rinfampina B, tiene como
diana principal la transcripción del ADN. Las rifamicinas combinadas con

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ciprofloxacina y clindamicina se reportan como útiles para el tratamiento de las
infecciones bacterianas que se han relacionado con la guerra biológica o el
bioterrorismo.
 Interferencia de la traducción del ARNm: la biosíntesis proteica requiere la unión
secuencial de las subunidades ribosomales 30S y 50S al ARNm. Puesto que la
síntesis proteica es central para la función celular, constituye una diana excelente
para el desarrollo de un producto terminado antibacteriano. Es una diana principal
para muchos fármacos que se dirigen hacia la subunidad 30S, mientras que otros
atacan la subunidad 50S. Entre los Inhibidores ribosomales, los aminoglucósidos
derivados naturalmente son la única clase con espectro bactericida amplio. Los
aminoglucósidos son moléculas catiónicas contentivas de carbohidratos y su carga
positiva proporciona la base para su interracción con una región específica del
ARN 16S en la subunidad 30S. La fijación de los aminoglucósidos al sitio de
unión A de la subunidad 30S impide el acoplamiento del aminoacil-tRNA, lo que
lleva a la traducción errónea y la producción subsecuente de proteínas aberrantes.
 Mecanismos de acción combinados: aun cuando los agentes antibacterianos
pueden tener varios mecanismos de acción, por lo general predomina uno de ellos.
Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos, las bacterias usan dos estrategias para
evitar ser eliminadas por los agentes antimicrobianos: la resistencia y la tolerancia. La
tolerancia es una propiedad de las bacterias latentes o persistente. Los mecanismos de
formación de bacterias persistentes incluyen una caída en la concentración de ATP y la
inactivación de las toxinas que detienen procesos celulares esenciales. Se ha mostrado
que bacterias persistentes tienen mutaciones en los genes promotores.
La resistencia se divide en mecanismos intrínsecos o en resistencia adquirida. Los
mecanismos intrínsecos son una característica innata del microorganismo y se transmite
a la progenie en forma vertical, se considera una característica natural y heredada de
forma consistente en un grupo, género o especie en particular. Los mecanismos
adquiridos de resistencia se deben a cambios en la composición genética usual de un
microorganismo que llevan a una alteración en la fisiología y estructua celular, puede ser
una característica asociada solo a ciertas cepas de una especie. Casi siempre son
ocasionadas por mutaciones genéticas, adquisición de genes de otras especies o por
combinación de eventos mutacionales.
Mecanismos intrínsecos de resistencia
 Biopelículas: son comunidades sésiles de microorganismos que están unidas de
manera irreversible a una superficie sólida y están incrustados en una matriz de
exopolisacáridos. Parecen carecer de factores de resistencia innatos y factores de
resistencia incluidos.
 Impermeabilidad: para que los antimicrobianos logren alterar la célula microbiana
deben lograr traspasar la pared celular. El flujo de entrada depende de la
naturaleza química del agente. Las porinas son un claro ejemplo de como funciona
la impermeabilidad en conjunto con los LPS.
 Eflujo: las bombas de eflujo funcionan como proteínas transportadoras para la
extrusión de sustancias tóxicas y agentes antimicrobianos desde el interior de la

29
célula al ambiente externo. Se presentan de forma natural y se encuentran tanto
en microorganismos susceptibles como en los resistentes. Se clasifican en 5
superfamilias; facilitador mayor, de resistencia/nodulación/y división celular,
MDR pequeña, casete de fijación de ATP.
 Inactivación enzimática:las bacterias pueden producir enzimas que destruyen a
los agentes antimicrobianos antes de que estos sean capaces de alcanzar sus
dianas. Como la B-lactamasas que hidrolizan antibióticos B-lactámicos.
Mecanismos de resistencia adquirida
 Eflujo: algunos genes de la bomba de eflujo se han trasladado a plásmidos, que
pueden adquirirse por intercambio genético horizontal.
 Modificación del sitio diana: puede reducir la afinidad de fijación del agente
antimicrobiano a la diana. Estos tienen lugar principalmente mediante mutaciones
cromosómicas, como se observa en los antimicrobianos quinolonas y
oxazolidinonas, así como mediante la alteración enzimática de los sitios diana de
los antibióticos macrólidos, glucopéptidos y B-lactámicos.
 Adquisición de nuevas dianas: los microorganismos también se adaptan y se
hacen resistentes al adquirir dianas celulares con afinidad reducida por el agente
antimicrobiano.
 Inactivación enzimática de los agentes antimicrobianos: es uno de los principales
mecanismos de resistencia identificados en las bacterias y constituye una
estrategia exitosa utilizada por muchos microorganismos. Se utilizan enzimas con
el fin de inactivar la acción del fármaco, como es el caso de las B-lactamasas.
Debido a la existencia de B-lactamasas que inhiben a los fármacos de más utilidad, se han
creado diverosos medios que inhiban la acción de esta enzima. Extienden de este modo
el rango de bacterias suceptibles a los B-lactámicos. Se aplican en conjunto con fármacos
B-lactámicos, como por ejemplo el ácido clavulánico en conjunto con amoxicilina y el
sulbactam en conjunto con ampicilina.

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VI.Análisis
Este capítulo es de gran interés médico. La etapa más importante en el desarrollo y estudio
clínico de una enfermedad, después del diagnóstico, es el tratamiento. Las enfermedades
causadas por bacterias son comunes en nuestra vida diaria, hemos escuchado de personas
que han muerto debido a la acción de un microbio, una lesión en la rodilla de un niño que
evoluciona a una gran complicación debido a la acción de una bacteria. Desde la
antigüedad han estado presentes y por ello es necesario que se posean tratamientos
efectivos, que eviten y controlen el crecimiento y acción de los microorganismos.
Aunque este fin, cada vez es más difícil; como todo ser vivo, las bacterias tienden a
evolucionar, a adaptarse con el fin de sobrevivir, algo natural en cualquier ser vivo. Por
ello, tienden a mutar y modificar sus componentes y métodos de acción con el fin de
evitar su destrucción a causa de fármacos. Cada día muchos de los antibióticos utilizados
para tratar infecciones bacterianas, son inutiles o no poseen el mismo efecto que antes era
notorio. La resistencia y tolerancia a antibióticos por parte de las bacterias, poco a poco
se convierte en un problema de salud pública, al que se le debe buscar una solución.
Para encontrar esta solución se debe estudiar los mecanismos que utilizan las bacterias en
contra de los fármacos y a su vez crear medios que eviten o engañen estas defensas. De
la misma forma que muchas bacterias buscan un punto débil en nuestro sistema inmune,
el médico debe buscar la debilidad de la bacteria y atacar esta debilidad hasta destruirla.
Por ello, se necesita de la investigación activa, principalmente en los estudiantes, con el
fin de encontrar soluciones en conjunto con la evolución de los microorganismos y de la
población. El estudiante solo puede llegar a colaborar en estos procesos, siendo conocedor
de los mecanismos, actualmente conocidos, que inhiben la acción de los antibióticos.

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VII. Aplicaciones del diagnóstico molecular
VII.Resumen
El diagnóstico molecular representa un avance significativo en el laboratorio de
microbiología clínica. Las pruebas diagnósticas moleculares proporcionan una detección
rápida de ciertos agentes infecciosos y son en particular utiles para los agentes que son
difíciles de cultivar o que toman mucho tiempo en crecer en medios de cultivo. Los
ensayos diagnósticos moleculares les proporcionan a los médicos respuestas rápidas para
las opciones de tratamiento y, de este modo, se ahorra un tiempo valioso cuando se trata
de una infección que amenaza la vida.
El acoplamiento de moléculas complementarias de una sola hebra es un componente clave
para muchas de las pruebas. Las dos moléculas de ácidos nucleicos de una sola hebra
utilizadas en las técnicas de hibridación reciben diferentes nombres. Una de estas se
conoce como diana. La hebra diana es la secuencia de ADN o ARN que será identificada
por el método de diagnóstico molecular aue se utilice. La molécula de diana de ácido
nucleico se inmoviliza en un medio de soporte sólido o se suspende en una solución. La
otra hebra involucrada en los métodos de hibridación es llamada sonda que es usualmente
un oligonucleótido de ADN o ARN de una sola hebra marcado con una molécula
reportera que puede detectarse de manera visual o mediante un instrumento; la sonda va
a señalar a la diana.
Diversas variables afectan el resultado de una reacción de hibridación, estas incluyen la
temperatura, la composición base de nucleótidos de la sonda, la longitud de la misma, su
concentración, el grado de complementariedad entre la diana y la sonda, la potencia iónica
y el pH.
La selección de la sonda adecuada para las reacciones de hibridación es de suma
importancia.
 Hibridación de soporte sólido: blotting, el ácido nucleico diana se transfiere a una
membrana compuesta por nitrocelulosa o nylon y se inmoviliza. Luego se hibrida
la sonda marcada con ácido nucleico inmovilizado y se utilizan pasos de lavado
para remover el exceso de sonda y aclarar la señal. Los resultados se observan por
sondas colimétricas o sondas quimioluminiscentes.
o Southern blot: electroforesis en gel de agarosa.
o Northern blot: se usa para detectar moléculas de ARNque casi
siempre son transcriptos.
 Hibridación in situ: el transcripto de ADN o de ARN puede detectarse de manera
directa en los tejidos con sondas marcadas. También llamada amplificación in
situ.
 Hibridación en solución: es la que se utiliza con mayor frecuencia en el
laboratorio. Por lo general se basan en quimioluminiscencia.

32
Procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tienen una mayor utilidad clínica.
Puede usarse para incrementar la cantidad del ácido nucleico del microorganismo diana
en una muestra en poco tiempo. La amplificación también se usa en algunos ensayos para
incrementar la magnitud de la señal luego de hibridar una sonda con el ácido nucleico de
un microorganismo. Muchas de estas pruebas combinan rapidez con una sensibilidad y
especificidad elevadas.
Aunque si bien estas requieren un costo económico muy alto, equipos especiales para su
realización, un espacio bien equipado para evitar contaminación y un equipo de personal
muy capacitado.
 Reacción en cadena de polimerasa: PCR. Puede amplificar una sola copia de ADN
diana en una cantidad exponencial de producto de ácido nucleico en el curso de
25 a 40 ciclos de reacción. Cada ciclo consta de tres pasos que son la
desnaturalización del ADN diana, anillo cebador a la secuencia diana, extensión
del cebador. Esta también posee varios componentes como la ADN polimerasa,
un amortiguador para la polimerasa, cebadores, los cuatro desoxinucleótidos
trifosfatos, además de una fuente de ADN molde. Se requiere de un termociclador.
Se han descrito varias variaciones de PCR como:
o RT-PCR (Reacción en cadena de polimerasa de transcripción
reversa): técnica más sensible disponible para detectar y cuantificar
el ARNm.
o PCR multiplex (Reacción en cadena de polimerasa multiplex): se
utiliza para detectar de manera simultánea dos o más dianas a partir
de un tubo de PCR.
o PCR anidada (Reacción en cadena de polimerasa anidada): es
sumamente sensible y específica que sirve como una forma de
control interno que garantiza la especificidad. Consiste en dos
ensayos consecutivos y diferentes. El primero es un PCR normal y
el segundo es una parej de cebadores es complementaria con una
región interna del amplicón derivado del primer ensayo de PCR.
Puesto que la PCR es demasiado sensible, pequeñas cantidades de ácido nucleico extraído
o amplicones remanentes de ensayos de PCR previos pueden contaminar los ensayos
futuros. Lo cual puede llevar a falsos resultados, ya sean positivos o negativos. Se
utilizado con mucho éxito a la uracilo-N-glicosilasa para reducir los remanentes de los
ensayos de PCR.
El análisis de los amplicones de la PCR puede lograrse mediante diferentes
procedimientos. La electroforesis en gel de agarosa toma 1 a 2 horas para separar los
productos de la PCR, genera desperdicios peligrosos y requiere de un sistema
imaneológico.

33
La PCR en tiempo real fue un adelanto muy importante para la detección de los productos
de la PCR. Los amplicones se detectan a medida que se acumulan durante la PCR en
tiempo real luego de cada ciclo. De este modo, se puede observar con rapidez un resultado
positivo, muchas veces mientras el ensayo todavía está corriendo. Esta técnica no utiliza
un gel agarosa, usualmente no acumula residuos peligrosos y el sistema de imágenes
forma parte de la instrumentación en tiempo real. Esta utiliza un colorante reportador
fluorescente, muchas veces en forma de sondas o balizas marcadas, denominadas
fluoróforos. La fluorescencia se mide mediante la monitorización directa del incremento
de esta o, indirectamente, mediante transferencia de energía de resonancia de
fluorescencia. Algunas plataformas de PCR en tiempo real pueden proporcionar un
análisis de la curva de fusión para determinar los resultados del ensayo o verificar la
pureza del producto de la PCR y determinar si están presentes cebadores-dímeros.
Otras reacciones de amplificación de ácidos nucleicos:
 Amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos: NASBA es un
procedimiento isotérmico, osea, todas las reacciones se dan en una misma
temperatura. No requiere de un termocilador. Utiliza tres enzimas: AMV
transcriptasa reversa, ribonucleasa H y T7 ARN polimerasa.
 Amplificación mediada por transcripción: TMA utiliza una transcripción reversa
con RNasa H y actividad T7 ARN polimerasa.
 Reacciones de amplificación de señal
Muchas veces se usan técnicas de tipificación de cepas para comparar las cepas locales y
determinar si un brote local es ocasionado por un solo tipo de muestra o por múltiples
tipos.
Métodos de tipificación no amplicados:
 Análisis del perfil de plásmidos
 Southern blotting
 Análisis del ADN cromosómico con enzima de restricción
 Electroforesis en gel de campo pulsado
 Electroforesis enzimática de múltiples locus
Métodos de tipificación amplificados
 Técnicas del ADN polimórfico amplificado aleatorio
 Reacción en cadena de polimerasa de elementos extragénicos palindrómicos
repetitivos
 Análisis de múltiples locus del número variable de repeticiones en tándem
 Tipificación de secuencia de múltiples locus

34
VII.Análisis
La tecnología cada día avanza, y con toda la teoría estudiada muchas veces se olvida el
papel que juega el desarrollo de nuevas tecnologías para la medicina y como depende en
gran manera de ella para una práctica adecuada de la medicina. La prueba de ello, esta en
las pruebas diagnósticas que cada día avanzan, dejando atrás herramientas y métodos que
antes eran muy utilizados; en su gran mayoría esto pasa gracias a la necesidad de observar
resultados de forma más rápidas, no existe espacio para margenes de error o retrasos.
Esto ha impulsado la busqueda de nuevas técnicas como lo es el PCR, para aumentar las
probalidades de obtener un diagnóstico adecuado y que deje libre de dudas al personal
médico acerca de lo que presenta el paciente y que necesita.
Aunque claro, todo posee desventajas en algún momento, y en este caso el punto débil de
la PCR es sus altos costos; ya sea de forma económica o en la presencia de un personal
correctamente preparado para la utilización de las herramientas requeridas para este tipo
de prubas. Por ello, se deben considerar la creación de nuevas técnicas para reducir costos
y dar la posibilidad a muchos otros centros de salud de poder adquirir un medio rápido y
fiable para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y que requieren una intervención
rápida.

35
VIII. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos
VIII.Resumen
Estas pruebas se realizan en bacterias y hongos aislados de especímenes clínicos para
determinar cuales pueden ser los agentes antimicrobianos efectivos en el tratamiento de
las infecciones ocasionadas por estos organismos. Solo deben evaluarse aquellos
organismos con probabilidad de contribuir a una infección pues la evaluación de
organismos que no están involucrados en una infección puede ser confusa para el médico
y puede llevar a una infección más seria con desarrollo de resistencia a antimicrobianos.
Factores que se deben tomar en cuenta para determinar si se requiere evaluación, además
de la susceptibilidad impredecible de un patógeno potencial se debe incluir:
 El sitio corporal donde se aisló la bacterio
 La presencia de otros organismos y la calidad de la muestra donde se logró el
crecimiento del organismo.
 El estado del huesped
No se realizan pruebas de susceptibilidad en bacterias que son predeciblemente
susceptibles a los agentes antimicrobianos utilizados de forma habitual para tratar
infecciones ocasionadas por estas bacterias. En la actualidad se usan más de 50 agentes
antimicrobianos para el tratamiento de las infecciones bacterianas y micóticas, entre los
cuales muchos tienen una eficacia clínica comparable. Cada laboratorio debe determinar
cuáles son los agentes apropiados para evaluación de rutina contra diversos organismos
en su contexto. Es importante que los fármacos evaluados por el laboratorio se equiparen
lo más posible con el formulario institucional. Desde la perspectiva del laboratorio, el
factor limitante para el número de fármacos evaluados casi siempre es el número que
puede probarse de manera práctica con un método específico. La población de pacientes
debe considerarse en la elección de los agentes antimicrobianos a ser evaluados.
Por lo general, un laboratorio definirá una batería de 10 a 15 agentes antimicrobianos para
la evaluación de rutina de Enterobacteriaceae, bacilos Gram begativos no exigentes,
estafilococos y enterococos. En ocasiones se lleva a cabo una batería separada para los
aislados urinarios que representan fármacos apropiados para el tratamiento de las
infecciones del tracto urinario. Los laboratorios que encuentran un número significativo
de bacterias resistentes a los antimicrobianos utilizados con mayor frecuencia pueden
incluir una batería suplementaria que contenga agentes antimicrobianos con actividad
aumentada.
Puesto que algunas veces se desconoce la identidad del aislado bacteriano cuando se lleva
a cabo la evaluación de la susceptibilidad, pueden probarse algunos fármacos que son
inapropiados para ese aislado. En esos casos, no debe reportarse de manera
indiscriminada un fármaco poruqe los resultados pueden ocasionar confusión. Los
protocolos de reporte deben desarrollarse luego de la discusión con los médicos de
enfermedades infecciosas, con los farmacéuticos y con aquellos con experiencia clínica
con las prácticas de terapia antimicrobiana de la institución. Un principio fundamental de
la terapia antimicrobiana es utilizar agentes menos tóxicos, con mayor relación costo-
efectividad y más efectivos desde el punto de vista clínico, así como abstenerse de utilizar

36
aquellos agentes costosos y de espectro más amplio, aunque muchas veces es difícil lograr
que el médico cumpla con ese objetivo.
Como pauta general se sugiere que, dentro de una clase antimicrobiana, se reporten
primero los agentes primarios del grupo A y solo se reporten los agentes secundarios del
grupo B si existe una de las siguientes condiciones:
 El aislado es resistente a los agentes primarios
 El paciente no puede tolerar los agentes primarios
 La infección no ha respondido a los agentes primarios
 Un agente secundario sería una mejor elección clínica para la infección
 El paciente tiene bacterias aisladas de otro sitio y un agente secundario puede ser
útil para el tratamiento de ambas infecciones.
También puede reportarse un agente secundario si el paciente tiene una infección
polimicrobiana y es más probable que un agente secundario sea efectivo contra todos los
patógenos presentes. De manera similar, puede reportarse un agente secundario si el
paciente tiene una infección diseminada y un agente secundario puede ser efectivo en
todos los sitios.
Los agentes con actividad de muy amplio espectro o de potencia aumentada o de grupo
C pueden evaluarse y reportarse por las razones enumeradas para los agentes secundarios.
Pueden considerarse para la evaluación de rutina si una institución particular encuentra
grandes números aislados resistentes a los agentes del grupo A y del grupo B.
 Preparación del inóculo: uno de los pasos más críticos en la evaluación de
susceptibilidad. Se preparan al añadir células de cuatro a cinco colonias aisladas
de morfologías de colonia similar que crecen en un medio de agar no inhitorio a
un caldo, lo que permite que crezcan hasta la fase logarítmica.
 Estándares de turbidez de McFarland: debe estanderizarce la concentración del
inóculo de bacterias a ser evaluadas pues, si se evalúan muy pocas bacterias, puede
haber resultados falsos de susceptibilidad, del mismo modo que los resultados
falsamente resistentes pueden deberse a la evaluación de demasiadas bacterias.
 Estandarización del inóculo: la suspensión es demasiado densa si es más difícil de
ver las lineas a través de la suspensión del inóculo que a través del estandar 0,5
de McFarland, en este caso el inóculo se diluirá con caldo o solución salina estéril
adicional. Si la suspensión de la prueba es demasiado clara, se añaden más
organismos o se vuelve a incubar la suspensión hasta que la turbidez alcance el
estándar de McFarland.
Métodos de dilución para la evaluación de la susceptibilidad se usan para determinar el
MIC, o la concentración más baja de un agente antimicrobiano requerida para inhibir el
crecimiento de la bacteria . Se añaden varias concentraciones de un agente antimicrobiano
al caldo o medio agar.
 Soluciones patrón de antimicrobianos
 Pruebas de macrodilución en caldo (dilución en tubo)
 Pruebas de microdilución en caldo
 Paneles para concentración inhibitoria mínima de punto de corte
 Pruebas de dilución en agar

37
Pruebas de difusión de disco (prueba de Kirby-Bauer) se basa en colocar con hisopo sobre
la superficie de una placa estandarizada de agar Muller-Hinton una suspensión
estandarizada de McFarland 0,5 de bacterias y se colocan sobre la superficie inoculada
discos de papel que contienen concentraciones específicas del agente antimicrobiano.
Luego de 16 a 18 horas de incubación se miden los diámetros de las zonas producidas por
la inhibición del crecimiento bacteriano por el antimicrobiano y el resultado se interpreta
como no susceptible, susceptible, intermedio o resistente a un fármaco particular de
acuerdo con los criterios preestablecidos. En un punto crítico, la cantidad del fármaco en
una localización específica en el medio es incapaz de inhibir el crecimiento del organismo
de prueba y se forma una zona de inhibición, las cuales están relacionadas con las MIC y
esta relación es la que se ha utilizado para determinar los puntos de corte para la
interpretación de la medición de la zona particular que indique si el aislado es no
susceptible, susceptible o resistente.
El caldo y el agar de Mueller-Hinton constituyen los medios estándar usados para las
pruebas rutinarias de susceptibilidad por dilución y por difusión de disco. Pero, estos
medio no soportan el crecimiento de todas las bacterias que requieren evaluación; en
consecuencia, los métodos de rutina deben modificarse para la evaluación de bacterias
exigentes que requieren nutrientes suplementarios, condiciones de incubación
modificadas o ambos. Algunos de estos organismos son:
 Streptococcus pneumoniae y Streptococcus spp.
 Haemophilus influenzae y Haemophilus parainfluenzae
 Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis
 Helicobacter pylori y Campylobacter spp.
Deben utilizarse procedimientos especiales para detectar la resistencia clínicamente
significativa en algunas bacterias no exigentes.
 Detección de la resistencia a la oxiciclina en los estafilococos
 Resistencia o susceptibilidad disminuida a la vancomicina en el Staphylococcus
aureus
 Resistencia inducible a la clindamicina en estafilococos
 Detección de resistencia de alto nivel a aminoglucósidos en los enterococos
 B-lactamasas de espectro extendido

38
VIII.Análisis
En la sección 6 de este dossier, se tocaron los mecanismos de resistencia que pueden usar
los microorganismos para evitar la acción de ciertos fármacos, dependiendo del modo de
acción de estos. Si bien podemos estudiar los mecanismos de resistencia y predecir o
deducir que fármacos veran afectado su funcionamiento debido a estos; no podemos
establecer por simple deducción los fármacos específicos que no poseeran efecto en los
microorganismos. Para ello necesitamos exponer a la bacteria a la acción del fármaco y
registrar su susceptibilidad a los efectos del mismo.
Muchas bacterias han creado medios en los que varios fármacos muy utilizados ya no
poseen afecto alguno, por lo tanto se necesita la creación de nuevos fármacos con un
espectro más amplio que puedan combatir a la bacteria. Pero la forma de comprobar la
acción de estos fármacos, es exponiendo a la bacteria y confirmar o negar su efecto.
Si bien es muy útil, puede llegar a crear resistencia adquirida en las bacterias por su
continua exposición a los antibióticos o antimicrobianos; situación que representa un alto
riesgo biológico tanto para el microbiólogo, médicos y pacientes. Para evitar esta
situación, se debe reducir el número de exposiciones que se realiza al microorganismo,
algo complicado gracias a que es el único medio fiable por el momento para confirmar su
acción. Así que por el momento solo se pueden aplicar las medidas de bioseguridad para
evitar la fuga de especímenes que puedan exparcirse y aumentar el número de cepas o
incluso especies resistentes a antimicrobianos, reduciendo las opciones de tratamiento. Es
importante resaltar, por esta razón la búsqueda de nuevos antimicrobianos para
adelantarse a los posibles mecanismos de resistencia más fuertes que puedan ser
desarrollados por los microorganismos.

39
Conclusión
En estos resúmenes y análisis, podemos ver la amplia gama de información que debe ser
estudiada para la correcta aplicación de las diversas de los diversos métodos de
laboratorio de microbiología para el estudio de microorganismos. Si bien cómo podemos
señalar en muchos análisis, éste tipo de prácticas no son directamente relacionadas con la
práctica médica, si son muy importantes para definir los diagnósticos y el procedimiento
o forma en la que se deba llevar el tratamiento y el curso de la enfermedad. Por ello es
necesario que el estudiante de medicina, pueda comprender y aplicar estos conocimientos
con el fin de agilizar los procesos de diagnóstico para dar como resultado un tratamiento
eficaz. Hoy en día con la tecnología, aplicada al campo de la medicina, A podido reducir
el tiempo en el que antes se estimaba que se observarían resultados de estas pruebas de
diagnóstico; lo cual es muy importante, debido al que reducir el tiempo de espera para un
diagnóstico de confirmación, podemos aplicar de forma rápida un tratamiento que sea
conocido que es el indicado para el caso, el tiempo en esta forma salvaría vidas, qué es el
objetivo de la medicina.

40
Bibliografía
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ed., Vol. 1). Elsevier.
Mahlen, S. D. (n.d.). Aplicaciones del diagnóstico molecular. In A. Kumar
(Ed.), Técnicas de laboratorio de microbiología (Vol. 1, pp. 219–244).
Marsik, F. J. (n.d.). Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. In P. Mister
(Ed.), Técnicas de laboratorio de microbiología (pp. 268–302).
Roberts, L. (n.d.). Recolección y procesamiento del espécimen. In Técnicas de
laboratorio de microbiología (pp. 106–118).
Mahon, C. R. (n.d.). Examen microscópico de materiales provenientes de sitios
infectados. In Técnicas de laboratorio de microbiología (pp. 121–130).
Mahon, C. R. (n.d.-b). Uso de la morfología de las colonias para la identificación
presuntiva de microorganismos. In G. Manuselis (Ed.), Técnicas de laboratorio
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247–265).

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