LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA: Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección

Juan Carlos Montero Rubio
Instituto de Ciencias de la Salud
Consejería de Sanidad de Castilla-La Mancha
Laboratorio de Salud Pública:
Presentación de Experiencias
con Métodos Rápidos de
Detección

Presentación de experiencias con métodos rápidos de detección
Ecología:
• Abundante su presencia en biocapas – Sistemas
acuáticos antropogenicos.
• Relación con protozoos como comensal o parásito.
• Viven en su interior y se reproducen en muchas
ocasiones.
• Protectores de agresiones externas.
• Importante papel en la amplificación y propagación de
la Legionella (Rowbotham TJ 1980, Baranree JM
1986).
• Aparente relación con su capacidad patogénica
(Breiman RF 1990, Cirillo JD 1994, Byrne B & Swanson
MS 1998).
• La Legionella coloniza pero no se reproduce en la
biocapa (Donlan RM 2005, Murga R, 2001)
Rowbotham TJ 1980

RD 2210/95, 28 diciembre, incluye la legionelosis como EDO.
R.D. 865/03 por el que se establecen criterios higiénico
sanitarios para la prevención y control de la legionelosis.
• Instalaciones con mayor probabilidad de proliferación y
dispersión de Legionella:
• Instalaciones con menor probabilidad de proliferación y
dispersión de Legionella:
Almacenamiento. Siembra.
Concentración. Incubación.
Descontaminación. Confirmación
Análisis realizado según la norma ISO 11731, 1998. Water quality
- detection and enumeration of Legionella. UNE-ISO 11731, 2007.

Inconvenientes recuento en placa.
(ISO 11731, 1998).
• Crecimiento lento: resultados más allá de un semana.
• Enmascaramiento debido a la microbiota acompañante.
• Posibles células viables y no cultivables.
• Recuento de colonias de muy distinta procedencia. 1 Vacuola
(103 bacterias) -1 UFC (Berk SG, 1998)

Francisco Javier Castro
LRSP Comunidad de Madrid
Inhibición de Legionella por otros Microorganismos
Cotuk, A. et al., 2005;
Amin A. et al., 2013;
Giao M.S. et al., 2011
En ocasiones, la microbiota
acompañante puede inhibir el
crecimiento de Legionella. Ejemplo
especies del género Aeromonas o
Pseudomona.
La presencia de algunos
microorganismos en la muestra no
desciende la viabilidad de
Legionella pero sí su cultivabilidad.

Confirmación (ISO 11731)
Morfología característica.
“Las colonias de Legionella son
frecuentemente de color blanco, gris, azul
o púrpura, pero también pueden ser de
color marrón, rosa, verde-amarillento o
rojo intenso”
Punto 9.2.6. UNE-ISO 11731:2007
"Crecimiento excesivo de microorganismos que
dificulta la posible detección de Legionella en la
muestra analizada. "

PCR a tiempo real.
 Fundamento del método.
• Multiplica (amplifica) pequeñas cantidades de ADN cientos
de miles o millones de veces por la acción de la enzima ADN
polimerasa.
• La amplificación se realiza en un termociclador, aparato
capaz de calentar y enfriar rápidamente las muestras.
• La amplificación se mide al detectar la fluorescencia emitida
por un fluoróforo excitado.

qPCR
Reacción en cadena de la Polimerasa. ISO/TS 12869:2012 (Water quality –
Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by
concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction
(qPCR).
General testing conditions Expression of the results
Technical protocol for the
characterization and the
validation of the method
Procedure Test report Quality controls
Concentration
DNA extraction
DNA amplification
Quantitative detection

Inconvenientes PCR Tiempo Real.
• La legislación solo admite ISO (ISO 11731, 1998).
Distintas unidades.
Falta de exactitud del método de referencia
• No disponibilidad de la bacteria para estudios
posteriores.
• Imposibilidad de diferenciar células vivas y muertas.
• Posible presencia de inhibidores de la reacción.

 Estudios que en los últimos 10 años han
comparado resultados de qPCR y Cultivo: 28
 En todos los casos los resultados por qPCR es
mayor que en cultivo. Solo en un caso salen
resultados equivalentes.
 Sumando los resultados obtenidos en todos los
estudios:
• PCR: 2.856/3.967 (72%)
• Cultivo: 1.331/3.967 (34%)
Whiley H & Taylor M, 2014

Señala las ventajas de el análisis
mediante PCR:
- Resultados más rápidos.
- Mayor detección (brotes)
- Posibilidad de generar resultados
específicos de L. pneumophila
Parece razonable obtener unos valores
de referencia para PCR.
Estos se deben obtener a través del
análisis de la comparación de los
resultados de ambos métodos, en una
misma serie de muestras.
ANSES, 2009

Lee JV et al, 2011
Estudio Multicéntrico
7 laboratorios de 6 países.
Cada laboratorio al menos 6 sistemas por
ambos métodos, durante al menos 6
semanas
Objetivo:
Definir el umbral de acción de la PCR en
tiempo real para el seguimiento de la
legionela en los diferentes tipos de sistemas
de agua

232 muestras de torres de refrigeración.
Legionella pneumophila Δ=0,71 (log)
Legionella sp Δ=2,03 (log)
506 muestras da agua sanitaria caliente y fría
Legionella pneumophila Δ=0,62 (log)
Legionella sp Δ=1,05 (log)
RESULTADOS

•Presencia de microorganismos dañados, moribundos o muertos que no son
capaces de crecer en un medio artificial pero todavía contiene ADN y pueden
ser detectado por la PCR
•Perdida de microorganismos a lo largo del proceso de cultivo: concentración
filtración, resuspensión, tto. ácido y calor, medio selectivo con antibióticos.
•Inhibición por otros microorganismos presentes
•En poblaciones muy activas y en crecimiento: genoma dividido, pero no división
celular.
•Peores resultados para Legionella spp pues el método fue diseñado originalmente
para Legionella pneumophila
•PCR. Reacciones cruzadas con otros especies no aisladas o descritas. NF T90-461:
validada 36 cepas de Legionella spp de varias especies y 17 especies no Legionella
spp del mismo ecosistema
Motivos de No Equivalencia

 Enzimoinmunoensayo combinado con una retención magnética del
microorganismo diana.
 Cuantificación mediante método colorimétrico.
 Resultado en U.F.C

1) Captura sólo de Legionella. Especificidad
• Elimina la competencia en crecimiento en placa.
• Elimina la confusión con la morfología.
• La captura depende de lo dañada que esté la célula: células viables no
sean cultivables
2) Las células capturadas se marcan con una enzima que produce un
color. Procedimiento identificación sencillo.
CEIA (captura magnética e inmunoensayo)
Limitaciones:
• Bacteria no disponible para posteriores estudios.
• Se desconocen otras por el momento.

Comparar efectividad y eficiencia de los métodos rápidos de
detección y recuento de Legionella spp frente al método de la
norma ISO 11731, 1998. (Water quality - detection and
enumeration of Legionella. UNE-ISO 11731, 2007) para tener
elementos objetivos que permitan tomar decisiones respecto a su
implantación en un laboratorio de salud pública.
Objetivo

 Se realizó un experimento con 20 muestras de 250 mL cada
una, desglosadas de la siguiente manera:
 Un control negativo.
 Una muestra con 102 UFC de Legionella spp. (Bioréference,
Eurofins, France).
 Seis muestras con 103 UFC de Legionella spp. más un conjunto de
microbiota interferente conocida, divididas en dos bloques.
 3 muestras adicionadas con Mix 1: P. aeruginosa, E. faecalis y E. coli.
 3 muestras adicionadas con Mix 2: P. aeruginosa y Hongo.
 Seis concentrados de muestras ambientales procedentes de torres
de refrigeración positivas (MA1, MA2, MA3, MA4, MA5, MA6).
 Las seis muestras anteriores adicionadas con 103 UFC de
Legionella spp.
Metodología (Madrid)

Identificación SIM log UFC +/- Cultivo log UFC +/-
CN ND - ND -
L. spp (102) 3.37 + 3.52 +
L. spp (103) + MIX 1 2.45 + ND -
L. spp (103) + MIX 1 3.15 + ND -
L. spp (103) + MIX 1 3.51 + ND -
L. spp (103) + MIX 2 3.26 + 3.00 +
L. spp (103) + MIX 2 3.67 + 3.48 +
L. spp (103) + MIX 2 3.67 + NA +
MA1 0.37 - ND -
MA2 2.68 + ND -
MA3 2.57 + ND -
MA4 3.32 + 4.36 +
MA5 2.57 + ND -
MA6 1.98 + 3.04 +
L. spp (103) + MA1 2.86 + 2.54 +
L. spp (103) + MA2 2.94 + 3.60 +
L. spp (103) + MA3 3.08 + 3.00 +
L. spp (103) + MA4 2.57 + 3.30 +
L. spp (103) + MA5 3.01 + 3.58 +
L. spp (103) + MA6 3.21 + 3.40 +
Tabla 3.- Resultados del experimento Cultivo – SIM realizado en la Comunidad de Madrid.

Separación Inmunomagnética
Cultivo
Positivo Negativo Total
Positivo 13 1 14
Negativo 5 1 6
Total 18 2 20
Resultados (Madrid)
Tabla 4.- Tabla de contingencia relacionando positivos – negativos de cultivo en placa y SIM.

Cultivo
Acción Alerta Satisfactorio
Total
≥ 104
UFC l -1 ≥ 103
UFC l -1 < 103
UFC l -1
Acción ≥ 104
UFC l -1 0 1 0 1
Alerta ≥ 103
UFC l -1 0 6 3 9
Satisfactorio < 103
UFC l -1 0 4 6 10
Total 0 11 9 20
Resultados (Madrid)
Tabla 4.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de acción de cultivo en
placa y SIM.

Primer estudio:
14 muestras inoculadas con Legionella spp. (Bioréference,
Eurofins, France).
 Niveles de dopaje realizados:
 5 muestras 104
 5 muestras 103
 4 muestras 102
4 muestras naturales provenientes de torres de refrigeración.
Estas 18 muestras de 2 litros se procesaron por PCR y
Separación Inmunomagnética (1L + 1L).
Metodología (Castilla - La Mancha)

Metodología (Castilla - La Mancha)
Segundo estudio:
65 muestras naturales provenientes de diferentes equipos e
instalaciones para analizar la máxima variabilidad de los métodos.
Agua sanitaria (caliente y fría)
Torres de refrigeración
Nebulizadores
Balnearios
Estas muestras, también de 2 litros, se concentraron mediante filtración
en 20 mL, de los cuales se utilizaron:
10 mL para PCR
9 mL para Separación inmunomagnética
1 mL restante para cultivo en placa (sin tratamiento)

Resultados (Castilla - La Mancha)
Acción Alerta Satisfactorio Total
Legionella
spp
Sanitaria Torres
≥104
UFC/vol
≥103
UFC/vol
<103
UFC/vol
Acción
≥105
UG/vol
≥106
UG/vol
10 2 0 12
qPCR Alerta
≥104
UG/vol
≥105
UG/vol
0 2 1 3
Satisfactorio
< 104
UG/vol
< 105
UG/vol
1 5 62 68
Total 11 9 2 74/83 (89%)
Tabla 5.- Tabla de contingencia relacionando los resultados por niveles de actuación de
qPCR y SIM.

Legionella
spp
≥104
CFU l-1
≥103
CFU l-1
<103
CFU l-1
Acción ≥104
CFU l-1
0 0 0 0
Cultivo Alerta ≥103
CFU l-1
0 2 1 3
Satisfactori
o
<103
CFU l-1
1 2 59 62
Total 1 4 60 61/65 (94%)
cultivo en placa y SIM.

qPCR
Sanitaria ≥105
UG/vol ≥104
UG/vol < 104
UG/vol
Legionella
spp
Torres ≥106
GU l-1
≥105
GU l-1
< 105
GU l-1
Acción ≥104
CFU l-1
0 0 0 0
Cultivo Alerta ≥103
CFU l-1
0 0 3 3
Satisfactorio <103
CFU l-1
0 1 61 62
Total 0 1 64 61/65 (94%)
cultivo en placa y qPCR.

Conclusiones
 Los resultados de los métodos analizados presentan un porcentaje de
coincidencia frente a nivel de actuación cercano al 90%.
 Los métodos alternativos utilizados muestran ser tanto o más efectivos
para la detección de Legionella spp. en muestras de rutina que el método
de referencia.
• La elección de uno u otro se debe motivar en otro tipo de elementos tales como
coste, objetivos del análisis, disponibilidad de medios y personal o el tipo de
muestras gestionadas en el laboratorio.
 Frente a muestras muy sucias el método que peor respuesta presenta es el
cultivo en placa, debido principalmente a la presencia de microbiota
interferente.
 En el caso de qPCR, esta suciedad puede provocar inhibiciones en la
detección, debido a sustancias presentes en la muestra.
 SIM y qPCR presentan el inconveniente de no disponer finalmente de la
bacteria para estudios posteriores. Importante en brotes.

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