Exotoxinas

1. Exotoxinas
Dra. Silvia Giono C.
Departamento de Microbiología
ENCB_IPN
sgiono@yahoo.com

2. A. A tumefaciens y cag A H. pylori,
B. Toxina Pertussis

3. PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA
TEMAS COMUNES DE PATOGENICIDAD
FINLAY YFALKOW,1989,1997
Las exotoxinas son proteínas
Se pueden obtener toxoides
Toxinas A-B
Actividad enzimática ADP-ribosilación
porción B se une al receptor
porción A enzima activa
Toxinas proteolíticas
Metaloendoproteasas con Zn: Botulínica. Tetánica
Toxinas formadoras de poros Citotoxinas
Familia RTX, HL-Y Citolisinas que se activan SH

6. • bAREs Heterodimérica se une a GTP-proteínas
• CT de Vibrio cholerae y LT de E. coli comparten
80%de homología en AA
• Vacuna DTP se sustituye por Vacuna acelular
PT+HA filamentosa (FDA1991)
• Nueva vacunas acelulares con ingeniería genética
peligro de reversión a la forma toxigénica, se busca
buena inmunogenicidad
AB5

7. • PT ADP ribosila la subunidad alfa de la proteína
Gάβγ trimérica y un residuo de cisteina, localizado en
la región terminal carboxilo, así se desacopla la
señal de transducción durante la síntesis de
proteínas.
• PT cataliza la hidrólisis del NAD-ADP-ribosa
nicotinamida
• El dominio A contiene esta actividad en S1
• Si se trata con quimiotripsina la holotoxina, el
péptido sigue unido a B, no así con tripsina
Posee ácido glutámico en sus
secuencia, si se elimina no hace BAre

8. Modelo de toxina de pertussis PT

9. ATP altera la conformación de PT DTT
la inactiva

10. S1 se activa en el citosol por ATP y un agente reductor,
permanece unida a la subunidad B o se libera para dar Bare en la
proteína G.
El aparato de Golgi sirve en el tráfico de S1ya sea por vesículas o
por difusión.

12. Toxina pertusis
• Formada por 5 subunidades
(S1 a S5)
• Toxina tipo A-B
• Inserción a membrana
• Proteína de 41 kDa
• Acumulación de AMPc
• Aglutina eritrocitos de pollo y
ganso

13. Hemaglutinina filamentosa (FHA)
1 22
RG
D
LVADGGPIVVEAGELVSHA
LGYQA
K
ETKEVDG
Hemaglutinació
n
Dominiode
reconocimiento
de
carbohidratos
Mimetismocon
alFactorX
Galactosa sobre
cilios o macrofagos
Integrina CR3
sobre
macrofagos Mimetismocon
alFactorX

14. Toxina pertusis
in vivo
Clin Microbiol Rev, 1995 8(1):34-47
S2S4 S4
S5
S3 S1
receptor
B. pertussis
S2S4 S4
S5
S3
S1
S1 S
1
41k Da
5 ADP-
RIBOSILACION
41k Da
AMPc

15. REGULACION DE LA VIRULENCIA
• Operón similar a vir
de Escherichia coli
– bvgA, bvgB y bvgC

16. La adherencia está basada en la gran afinidad
natural restringida a los cilios
Daño a los cilios ocurre solamente cuando la
bacteria esta adherida, lo que sugiere que la
adherencia participa directamente en la toxicidad
celular local
Participación:
Toxina pertussis
Hemaglutinina
Fimbrias
Adherencia

17. Bordetella pertussis
Adherida a cilios del
epitelio respiratorio

18. Inhalación de Bordetella
pertussis en gotitas en
aerosol
Adherencia a las células ciliadas en
nasofaringe
Multiplicación y dispersión
dentro de las células ciliadas y
bronquiales
Parálisis de los cilios y perdida de
células ciliada causadas por la
citotoxina traqueal ( TCT)
Patogénesis
Pediatr Infect
Dis J, 1997;
16:S78-S84
Liberación de la toxina
pertusica (PT) a sitios
locales y distantes
Posible progresión a
neumonía (involucramiento
de alveolos

19. • FLUOROQUINOLONAS SON
POTENTES,ERRADICARON EL
BIOFILM16x MIC,LOS
• BIOFILM BACTERIAS
SOBREVIVEN CON IMIPENEM Y
CEFTAZIDIMA 2560 ug/ML,
• MACROLIDOS 100%
PENETRACIÓN
FLUOROQUINOLONAS >75%,
AMINOGLUCÓSIDOS, BAJA
• PENETRACIÓN ,AMIKACINA
59%, GENTAMICINA 73%.
• HAY DIFERENCIAS RESPECTO
A POBLACION PLACTÓNICA VS
SÉSIL

21. Exotoxina S es una citotoxina tipo III, que modula
señales sobre la célula eucariótica. El N-terminal tiene
actividad GTP-asa (GAP) para Rho-GTP-asas.
Se localiza en la región perinuclear, se procesa y libera un
fragmento soluble con ambas actividades.
El COOH-terminal tiene actividad de ADP-ribosiltransferasa
Expresa factores de virulencia como citotoxinas tipo III que
son: ExoS, ExoT, Exo U y Exo Y.
A diferencia de otras exotoxinas, las que funcionan con
sistemas de secreción III, se inyectan y actúan dentro de las
células eucaróticas.

22. Modelo de la estructura y factores de virulencia de P.aeruginosa.

23. Vibrio cholerae
• Serotipos: O1 y no
O1 solo cepa
Bengala O139
• Biotipos: Clásico y
El Tor.
Fagos VPI CTX Φ

24. Factores de Virulencia:
• Pili TCP
• Toxina colérica
• CTX pertenece familia AB
• Produce ADP ribosilación
• Activa adenilato ciclasa con aumento de AMPc
• Toxina ZOT
• ACE
• Hemolisina

25. QUORUM SENSING Definición:
• Fenómeno en el que las bacterias pueden
comunicarse con miembros de su propia
especie y de otras para coordinar su
comportamiento en respuesta a su
densidad celular.

27. ¿Cómo funciona?
• Compuestos de señalización. Moléculas
pequeñas (acil homoserin lactonas ó
feromonas)
• Reconocimiento del sistema de
señalización interno.
• Activación de genes

29. Bacterias nadan CON su flagelo polar, se pegan a superficie (roca)
FORMA MICROCOLONIA, PRODUCE EXOPOLISACÁRIDO Y
ESTRUCTURA EL BIOFILM, EN STRESS ALGUNAS SE DESPRENDEN Y
BUSCAN OTRO SITIO FAVORABLE >polisacárido>biofilm<flagelo
Watnik P,and R Kolter. 2000. Biofilm,City of Microbes.J.Bacteriol. 182(10): 265-269

30. R
S

31. Watnik P,and R Kolter. 2000. Biofilm,City of Microbes.J.Bacteriol. 182(10): 265-269

32. Condiciones ambientales que activan a
ToxS:
• Temperatura.
• Osmolaridad
• Composición del medio
• pH
• Tensión de oxígeno.

35. Determinantes
de virulencia
Bacteria Bacteriófago Factores de
virulencia o
enfermedad
con la que se
relacionan
SopE S. typhimurium SopE Relacionada
con sistemas
de secreción
TipoIII
SodC S. typhimurium Gibsy-2 Relacionado
con la muerte
de macrófagos
Toxina colérica V. cholerae CTX Cólera
TCP y receptor
para CTX
V. cholerae VPI Pili TCP

36. Toxina diftérica Corynebacterium
diphteriae
“Fago 
converting”
Difteria
Toxina Shiga I y
II
E. coli
Enterotoxigénica
“Shiga like
toxin
converting
phages”
Colitis
hemorrágica y
diarrea
Resistencia al
suero
E. coli lambda LPS
Enterotoxina A
y estafilocinasa
Staphylococcus
aureus
13 Intoxicación
alimentaria
Exotoxinas A y
C pirógenas
Streptococcus
del Grupo A
T12 y 3GL16 Aumento en la
temperatura

38. PROPIEDADES DE LA TÓXINA
DIFTERICA
Algunas propiedades de la Tóxina Diftérica y Proteínas Relacionadas
Proteína
Peso Molecular
Aproximado
Toxicidad
(MLD/mg)
Actividad
enzimatica
(%)*
Unión
Número de
Residuos de
Cisteina
Toxina 60, 000 25-30 100 + 4
Toxoide 60, 000 0 0 - 4
Fragmento A 21, 150 0 100 - 1
Fragmento B 39, 000 0 0 + 3
CRM 45 45, 000 0 100 - 2
CMR 176 60, 000 ca. 0.1 8-10 + 4
CMR 197 60, 000 0 0 + 4
A45 B197± 60, 000 25-30 100 + 4
CRM = Serológicamente Material de Reacciones Cruzada
* Actividad de ADP-Ribosilante después del corte y reducción
relativo al fragmento A como 100%
+ Habilidad para competir con la toxina por los receptores de
membrana
± MoLécula híbrida tóxica formada que permite una mezcla de
CRM 45 y CMR
197 reducido y cortado

40. ACTIVACIÓN DE LA TÓXINA DIFTERICA
Tripsina
Thiol
+
Arg Ser
TÓXINA
PM. 60, 000
B
PM. 39, 000
A
PM. 21, 150
NAD+ + EF2  ADP-Ribosil-EF2 +NADH+ + H+

41. ACTIVACIÓN DE LA TOXINA DIFTERICA
• Inhibe la síntesis de proteínas en células de mamífero en la
fase de alargamiento
• La ADP-Ribosilación se une a un derivado con histidina
llamada diftamina que esta en EF2
• El receptor es HB-EGF, rompimiento proteolítico
• El fago es I/W lisogénico y el g que es reprimido por fur
• fur regula captación de fierro por sideróforos y este a su vez
regula la producción de toxinas y el represor es DtxR en forma
de dímero
• Fe (10mg) se une al DNA y no permite la unión de la RNA
polimerasa
• Fe no se une al DNA y se transcribe el gen

42. PROPIEDADES DE LA TÓXINA
DIFTERICA
Algunas propiedades de la Tóxina Diftérica y Proteínas Relacionadas
Proteína
Peso Molecular
Aproximado
Toxicidad
(MLD/mg)
Actividad
enzimatica
(%)*
Unión
Número de
Residuos de
Cisteina
Toxina 60, 000 25-30 100 + 4
Toxoide 60, 000 0 0 - 4
Fragmento A 21, 150 0 100 - 1
Fragmento B 39, 000 0 0 + 3
CRM 45 45, 000 0 100 - 2
CMR 176 60, 000 ca. 0.1 8-10 + 4
CMR 197 60, 000 0 0 + 4
A45
B197±
60, 000 25-30 100 + 4
CRM = Serológicamente Material de Reacciones Cruzada
* Actividad de ADP-Ribosilante después del corte y reducción
relativo al fragmento A como 100%
+ Habilidad para competir con la toxina por los receptores de

43. Toxina diftérica in vivo
receptor
C. diphtheriae
receptor receptor
NAD+
+ EF-2 ADP-RIBOSIL-EF-2
INHIBE LA
SINTESIS DE
PROTEINAS
B

44. Se han tratado cultivos con hierro y se observa una marcada disminución en la
producción de la toxina, se cree que lascorinebacterias
contienen un represor del gene que requiere hierro
como correpresor .
Regulación de la virulencia

45. Prueba de“ In vivo”
Positiva
Negativa

46. Prueba de Elek “In vitro”

47. ENTRADA
Complicaciones
Sistémicas
Miocarditis
Neuropatías
Difteria
Faringitis, hipoxia
Pseudomembrana
Diseminación
Salida
PATOGENESIS

48. • Superantígenos SA, son moléculas bifuncionales de
exotoxinas que estimulan sistema inmune el receptor esta
en la célula T, se une al TCR y otro se une al MHC clase II.
• Se une a células B, monocitos y células dendríticas que
tienen receptores.
• SA no necesitan de procesamiento de CPA, interaccionan
directamente con T y comparten secuencias con la región
variable de la cadena vβ del TCR en la región v β. El
repertorio se atribuye a diferencias en la línea germinal v β y
va con rearreglos variados.
• En humanos hay en v β mas de 25 familias de acuerdo con
su secuencias que pueden interactuar con T.

55. TETANOS
• El tétano esta causado por una potente neurotoxina
termolábil (tetanoespasmina) producida por la fase de
crecimiento estacionario y liberada con la lisis celular.
• C. tetani produce una hemolisina lábil frente al oxígeno
(tétanolisina), relacionada desde el punto de vista
serológico con otras hemolisinas de los clostridios y con
la estreptolisina “O”.
• Se desconoce el significado clínico de esta enzima,
dado que es inhibida por el oxígeno y el colesterol
sérico.

56. Tétanos
• Necesita colonización ( Heridas o Recién
Nacido Cordón umbilical)
• Tétanos actúa a nivel SN central
• Parálisis espástica ( Trismus, opistotonus)
• Bloquea la liberación de GABA( g -
aminobutírico)

57. PROFILAXIS PARA TETANOS EN
EL MANEJO DE HERIDAS
NUMERO DE DOSIS DE
TÓXOIDE TETANICO
Sanos o heridas
menores
Cualquier otro
de herida grave
Td* TIG+ Td* TIG+
Desconocido o menor de
3 dosis
Si No Si Si
3 ó más dosis No¥ No No Noœ
* Toxoides diftérico y tétanico para adultos; en el caso de niños usar preparaciones pediátricas en
niños menores de 7 años
+ Inmunoglobulina tetánica
‡ Si solo tres dosis de tóxodide tétanico fluido han sido recibidos, se puede suministrar una cuarta con
toxoide tetanico absorbido
¥ Si se suministra, sí la ultima dosis fue hace más de 10 años
œ Sí se suministra, sí la ultima dosis fue hace más de 5 años

58. Categorias clínicas
• A) Botulismo clásico
• B) Botulismo de heridas (raro)
• C) Botulismo infantil (frecuente )
• D) “Clasificación indeterminada” en adultos
que sufren de enfermedad gastrointestinal
crónica; es similar al infantil, y ocurre en
casos de intestinos anormales,
(botulismo inadvertido)

59. Cuadro clínico
• Neurológicos
• Hipotonía, parálisis facial ( VII par), ptosis,
diplopia, disminución de ROT, parálisis de
músculos respiratorios.
• Gastrointestinales
• Constipación, náuseas, vómito, dificultad
para la succión y deglución.
• Alteración en el estado mental: letargo
• Síndrome de muerte súbita infantil ( 4-5%)

60. Clasificación
Botulismo humano es causado por los tipos A, B, y E y, raramente,
por el tipo F,
mientras que los animales se infectan más por los tipos C y D.
• Cuatro grupos fisiológicos
I : Formadores de toxina A,,B,F
(proteolíticos)
II : Formadores de toxina B,E,F (no
proteolíticos)
III: Formadores de toxina C o D
IV: Formadores de toxina G

61. • La acción de la BoNT se inicia con la unión de
BoNT a una molécula aceptora en la superficie
celular
• Los puentes de disulfuro en BoNT
• Muestra gran homología a TeNT en las
estructuras primarias completas de BoNT/A, B,
C1, D, E, F, G..
• Hay Cuatro cisteínas que están conservadas
en BoNT/A y TeNT.
TOXINA BOTULINICA

62. TOXINA BOTULINICA
Mecanismo de acción
• Unión a vesículas sinápticas de los
nervios colinérgicos impidiendo la
liberación de acetil colina en la sinapsis
de los nervios periféricos incluyendo
uniones neuromusculares
• Parálisis flácida descendente

63. • Las BoNTs A, B; o E se unen a la sinapsina I y a la beta-
aducina
• Los gangliósidos son receptores al que se une la BoNT.
gangliósido GT1b;unión a gangliósidos, cerebrósidos y
ácidos grasos libres
• BoNT marcada con 125I se localizó la molécula aceptora
en la unión neuromuscular de la terminales nerviosas
motoras.
• La sinaptotagmina en asociación con los gangliósidos
GT1b o Gt1a pueden ser un receptor natural para la
BoNT en las terminales nerviosas.
Mecanismo de acción
Receptores

64. ACTIVIDAD INTRACELULAR
• Las BoNTs bloquean la liberación del neurotransmisor por
la acción proteolítica de la cadena L,
• Después de la endocitosis,
• Es específica para las tres proteínas clave asociadas al
sinaptosoma ( SNAP ): sinaptobrevina o VAMP ( proteína
vesicular asociada a membrana ), SNAP-25 y sintaxina I.

65. • La cadena L es una zinc-endopeptidasa esencial
para la actividad tiene un átomo de zinc por
molécula en todas la BoNTs excepto en la
BoNT/C que tiene 2.
• El anclaje de las vesículas sinápticas a la
membrana plasmática presináptica, es necesario
para la liberación del neurotransmisor, sigue a un
paso de fusión que es disparado por calcio.
• Bloquea la liberación del neurotransmisor porque
interfiere con la fusión de la vesícula.
Mecanismo de acción

66. TÓXINA BOTULÍNICA
• Las neurotoxinas del C.botulinum son
sintetizadas de una toxina progenitora como una
sola cadena polipeptídica que tiene un peso
molecular de aprox. 150 kDa.
• Después de la secreción, es activada por un
procesamiento proteolítico da corte en un solo
enlace peptídico. es endógena, BoNTs A, C, D y
de B y F ) algunos dependen de una proteasa
exógena (tripsina) tipos de B y F y la tipo E

67. TÓXINA BOTULÍNICA
• Las toxinas 19S y 16S tienen
componentes no-hemaglutinógenos, no-
tóxicos ( NTNH ) y un marco de lectura
abierto entre el gen de la neurotoxina y el
de la hemaglutinina.
• Las dos subunidades que resultan del
corte de la toxina progenitora tienen pesos
moleculares de aprox. 100 kDa ( pesada o
H ) y de aprox. 50 kDa ( ligera o L )

68. TÓXINA BOTULÍNICA
• BoNTs y Tetánica TeNT bloquean la liberación
de neurotransmisores
• Los síntomas clínicos causados por BoNTs son
diferentes de los causados por TeNT, Ya que
BoNT es una toxina alimentaria y TeNT no.
• Usan diferentes rutas para transportar la cadena
L a su sitio de acción o a la producción de
complejos de proteínas

69. • Un mg es fatal para el hombre en 3 a 10 días..
• La mortalidad es del 35 al 65%.
• La BoNT dosis menores, mal respiratorio hasta
6 u 8 meses. En base molar.
• Es 300 veces más letal que la toxina diftérica,
• 3 x 104 más tóxica que la ricina,
• 3 x 106 más tóxica que la alfa-bungarotoxina,
• 1 x 109 más tóxica que el curare y
• 1 x 1011 más tóxica que el NaCN.
Las neurotoxinas del C.botulinum son
las sustancias más tóxicas conocidas

70. Diagnostico y Tratamiento
• Demostración de toxina
botulínica
• Suero
• Heces
• Contenido gástrico
PRUEBA DE RATON
• Soporte ventilatorio
mecánico
• Antitoxina trivalente (A,
B,E) suero equino
• Antitoxina estándar
• Debridación de heridas
quirúrgicas
• Calentar alimentos por
más de 20 min a 80°C
• Penicilina sódica
cristalina a dosis altas
• Alternativa: metronidazol

73. Staphylococcus aureus y sus
toxinas
Antígenos celulares
• Cápsula
– Confieren mayor virulencia en animales
– Confieren protección contra anticuerpos
• Polisacárido A
– Son antígenos de carbohidratos específicos de especie
– Su determinante antigénico es un residuo de glucosamina
• Proteína A
– Aglutinógeno
– Se libera extracelularmente
– Forma precipitados con la región Fc de los antícuerpos
– Coaglutinación

74. Staphylococcus aureus y sus
toxinas
ENZIMAS EXTRACELULARES
• Coagulasa
Distingue S. aureus y otros SCN
• Reacciona con la prototrombina que convierte de fibrinógeno a fibrina
• Estafilocinasa y Urocinasa
– Disuelven coágulos
– Convierten el plasminógeno en plásmina
• Nucleasas
– Tiene actividad de endonucleasa y exonucleasa que degrada DNA
y RNA
• Hialuronidasa
• Lipasas

75. Staphylococcus aureus y sus
tóxinas
• Hemolisinas
– Son 4 tipos diferentes: a, , g y d
a-Hemolisina
• Es la principal hemolisina producida por S. aureus
en humanos,
• Lisa eritrocitos de conejo pero no humanos
• Las plaquetas y los cultivos de células son
susceptibles
• Provoca deficiencia de iones

76. Staphylococcus aureus y sus
tóxinas
-Hemolisina
• Lisa eritrocitos humanos
• Proviene de animales infectados
• Posee el fenómeno de “Hot-Cold” de hemólisis
• Es una esfingomielasa C de peso molecular de 30,000
• Se activa con Magnesio Mg+2
• Posee actividad citotóxica
g-Hemolisina
• Son dos proteínas que actúan simultáneamente
• Los Eritrocitos de humano son sensibles a la acción
• Su acción se ve inhibida por colesterol y otros lípidos

77. Factores de Virulencia
Stefanie S et al

78. Elementos Genéticos Moviles (MGEs)
identificados en Staphylococcus aureus
• Bacteriófagos que codifican para toxinas.
– Lítica: Lisis bacteriana completa.
– Templada: relación de largo plazo con
células.
– Crónica: La progenie no mata célula
huésped.
Ejemplos:
 Enterotoxina estafilocócica A (SEA)
 Leucomalacia periventricular (luk-PV)
 Proteína inhibidora de la quimiotaxis (CHIP)

79. Elementos Genéticos Moviles (MGEs)
identificados en Staphylococcus aureus
• Islas de Patogenicidad y composición
(SaPIs).
– Fracción de DNA que se transfiere de
manera horizontal y codifican para
enterotoxinas tipo TSST.
• Ejemplos: TSST
Superantígenos (SEB, SEC)
Genes de resistencia a ácidos.

80. Elementos Genéticos Moviles (MGEs)
identificados en Staphylococcus aureus
• Plásmidos y transposones
– Contienen antibióticos, metales pesados,
toxinas, arginina.
• Ejemplos:
psK639
pSK41

81. Elementos Genéticos Móviles (MGEs)
identificados en Staphylococcus aureus
• Cassete Cromosomal Staphylococcus
(SCC mec).
– Son fragmentos largos de DNA que se insertan
en el gen orfX en S. aureus se ve involucrados
en la resistencia a beta-lactámicos.
• Ejemplos:
 Ssmec tipos I-XI
• SCC no mec
– SCC resistencia mercurio
resistencia en cloruro mercúrico.

82. Elementos Genéticos Moviles (MGEs)
identificados en Staphylococcus aureus
• Islas genómicas
Estas pueden ser de tres familias. vSAα,
vSAβ, vSAγ.
 Modulinas responsables de la
solubilización en fenol.
 Enterotoxinas
 Bacteriocinas.