Sesión microbiológica: Streptococo pyogenes y Streptococo agalactiae

Sesión microbiológica
S. pyogenes
S. agalactiae
JUAN JOSÉ FONSECA MATA
RESIDENTE INFECTOLOGÍA
28 DE JUNIO DE 2017

Taxonomía
Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Lactobacillales
Familia: Streptococcaceae
Género: Stretococcus
Especie: S. pyogenes

Morfología
Estreptococo del grupo A
Células esférica/ovoidea
De 0.6 a 1.0 μm
Gram positivos
Inmóviles
No formadores de esporas
Catalasa negativos
Anaerobios facultativos
Crecimiento
en cultivos
enriquecidos
(sangre/suero)
• Colonias blanco/gris
• 1 a 2 mm de diámetro
• Rodeadas de zonas de
β - hemolisis
Cultivo agar
sangre

Factores de virulencia
S. pyogenes

La adherencia a células
humanas es un proceso de
dos etapas
Primera etapa
Involucra una interacción,
relativamente débil mediada
por ácido lipoteicoico que
permite superar la repulsión
electrostática
Segunda etapa
Unión, específica, irreversible
dependiente de proteínas
específicas de cada tejido o
mediadas por receptores
específicos
Ferretti JJ, Stevens DL, Fischetti VA, editors; Streptococcus pyogenes : Basic Biology to Clinical Manifestations; 2017
Factores de adherencia

Acido
lipoteicoico
(LTA)
Componente hidrofóbico de la superficie de los
organismos gram positivos
Contribuye a la adhesión y la formación de
biofilm
Primera interacción en la adhesión bacteriana
Proteína M Molecula α-helicoidal, que en su porción N-
terminal es la mas distal a la bacteria, y la C-
terminal se encuentra anclada a la pared celular
Principal factor de virulencia , permite la
resistencia a la fagocitois
Pili
Descrito en S. pyogenes
Pili, resistente a la tripsina, codificada por 4 genes,
localizados en la región genética FCT*
Polimero covalente, compuesto de una proteína
estructural y 1 o 2 proteínas de anclaje (AP1 y AP2
Involucrado en la fromación de biofilm y la adhesión
de S. pyogenes a la faringe, keratinocito, células
epiteliaes pulmonares y fe faringe

Proteínas ligadoras
de fibronectina
Al haber disrupción
de tejido, se expone
la matriz extracelular,
sirviendo de sitio de
unión para S.
pyogenes
Existe 11 proteínas
ligadoras de
fibronectina, el
arreglo de las
proteínas dependen
del serotipo
Proteína F1 (SfbI)
•Dos dominios de unión en el
extremo C –terminal F1/SfbI
•Cada región interactúa con una
diferente porción de la
fibronectina
•La unión a la porción 30 kDa,
activa el espaciador adjunto para
facilitar la unión al fragmento de
45 kDa que desencadena la
invasión a la célula eucariota

Proteínas F2, PFBP y FbaB
F2: es similar en
la función a la
proteína F1
Estructuralmente
diferente
PFBP: homologa a
F2, diferente por
mutación de
desplazamiento de
marco de lectura
que resulta en la
pérdida de 105 aa en
el extremo N-
terminal
FbaB: adhesina
acompañante a PFBP
Participa en la
adhesión en
particular de las
cepas M3 y M18. en
M3 media la
adhesión a células
endoteliales pero no
epiteliales
SOF / SfbII y SfbX
SOF doble
funcionalidad
El extremo N-
terminal tiene
actividad
enzimática
que resulta en
la
opacificación
del suero del
huésped
El extremo C-
terminal une a
fibronectina
Distal al gen
de SOF, esta el
gen de SfbX,
se transcribe
de manera
conjunta
SOF / SfbII: Factor de opacidad sérica
SfbX: Proteína X ligadora de fibronectina de S. pyogenes

Fbp54
Adhesina que se
expresa en el
ambiente
humano, en
ciertas células,
como el epitelio
oral, pero no otros
Recetor
hemoprotein
estreptocócico
(Shr)
Adhesina de
superficie,
serotipo
específico
Proteínas
similares a
colágena
Numerosas,
contienen
secuencias largas
G-Xaa-Yaa,
similares al
colágeno de
mamíferos
Capsula de
áido
hialuronico
Resiste la
fagocitosis
mediada por
comoplemento
Proteínas ligadoras de laminina
Laminina es
componente de la
matriz
extracelular
S. pyogenes se
une a laminina
mediada por
SpeB, una
proteasa de
cisteína

Trends Microbiol. 2010 Jun;18(6):275-82

• Le confiere la habilidad de resistir fagocitosis de
polimorfonucleares en ausencia de antecuerpos
específicos
• La inmunidad contra estos patógenos reside en
la presencia de anticuerpos contra la región N-
terminal de la proteína M.
• Existen mas de 200 variantes de proteína M, y
un mismo sujeto puede estar infectado por mas
de una variedad
Proteína M

Estructura
• Modelo de las proteínas de superficie
• Unen vía la región C-terminal de la pared bacteriana
• Estructura multidominio
• Formado por una región helicoidal central (A,B,C,D)
• Y una región de anclaje celular (C- terminal)
Proteína M

Proteína M

Secuencia común para varias proteínas en
bacterias Gram positivas
No es idéntica en su estructura
Las características bioquímicas se conservan
Proteína M

Proteína M

Ofrece protección a través de la diversidad
Nuevos serotipos evitan la actividad de
anticuerpos generados por infecciones previas
Provee protección activa contra fagocitosis al
unirse a la fracción no inmunológica Fc de IgG
Puede resistir la opsonisación al
unir reguladores inhibitorios del
sistema complemento y
fibrinógeno, que
específicamente inhiben la
unción de C3b, bloqueando las
vías clásica y alternativa de
complemento
Virulence 2:5, 402-412; September/October 2011
Proteína M

M5, M6, M12, M24, son “reumatogénicas” pueden provocar la reacción cruzada con proteínas del huésped
(miosina, tropomiosina, laminina, queratina)
M5, pueden actuar como superantígenos, induciendo la proliferación masiva de células T y la liberación de
citocinas (fiebre escarlatina y STSS)
M1 induce la producción de IL- 6, IL- 1β, TNFα, en monocitos mediado por receptores tipo Toll
Fibrinogeno unido a M1, es reconocido por el neutrófilos vía β2 integrina, resultado en activación y liberación de
mediadores de fuga vascular.
Variedades de proteína M pueden activar la vía intrínseca de la coagulación en la superficie bacteriana al unir
kininogeno y generar bradicinina *
Proteína M

Factores de
virulencia
Factores secretados
No todo es proteína M

Nat Rev Microbiol. 2011 Sep 16;9(10):724-36

Estreptoquinasa
• Proteina monocatenaria de 414 aminoácidos, dividido
en tres dominios α, β,γ
• Secretada por los grupos A, C y G
• Actividad similar a los activadores de plaminogeno
• Activa a plasminogeno  plasmina de manera no
enzimática
• Unión de la estreptoquinasa con la plasmina induce
cambios conformacionales que resulta en la
formación de un sitio activo en el complejo
estreptoquinasa-plasminogeno;
• Donde sucede la activación plasminogeno
plasmina
Estreptoquinasa
• La generación de plasmina en el sitio de
infección puede resultar en la activación de las
metaloproteinasas de matriz del huésped
• Fibrinólisis y degradación de la matriz
extracelular y membrana basal
• Permite al estreptococo migrar desde el sitio
primario de infección a sitios adyacentes
• Ska induce inflamación por activación de
complemento
• Degrada a otro factor de virulencia la proteinasa
de cisteína SpeB
Ska: Estreptoquinasa

Factores de
virulencia
Estreptoquinasa
Ska: Estreptoquinasa

SpeB,
toxina
eritrogenica
pirogénica
estreptocóc
ica B
Codificada
por el gen
speB
No es una
exotoxina
Se produce
como un
zimógeno
inactivo de
40 kDa,
•origina una
enzima de 28
kDa
Enzima
proteolítica
Capacidad
de
degradació
n de
múltiples
proteínas
del
huésped
Facilita y
aumenta la
capacidad
bacteriana
de
propagació
n al
degradar
las
estructuras
tisulares.
Degrada
IgG, IgA,
IgM, IgD e
IgE, solo in
vitro
Asociada a
la
glomerilone
fritis post-
estreptocóc
ica en la
mayoría de
los casos
SpeB: Toxina eritrogenica pirogénica estreptocócica B
Proteinasa de cisteína

SpyCEP
Capaces de
degradar/inactiv
ar quimiocinas
de neutrófilos
CXCL – 8/ IL – 8, que se utiliza
en el reclutamiento de
polimorfonucleares
Existe como
enzima y asociada
a la pared
bacteriana
Se produce
como un
zimógeno de 170
kDa, que sufre
un proceso
autolítico
C5a, análogo de
SpyCEP, inactiva
el factor C5a del
complemento
SpyCEP: Proteinasa de envoltura
Proteinasa de envoltura

Citotoxina perforadora.
Dependiente de colesterol, sensible al oxigeno
Molécula de 69 kDa, sujeta a escisión N-terminal de la
proteinasa de cisteina
La formación de poros sucede en varias etapas
•Unión de monómeros a membranas ricas en colesterol
•Oligomerización, que resulta en la formación de poros
La formación de poros resulta en la disrupción de la
integridad de la membrana celular del huésped
Induce cambios en calcio intracelular
La actividad de SLO promueve la inflamación mucosa a
través de la destrucción tisular
Induce agregación plaquetaria y de neutrófilos
La expresión de SLO es necesaria para la inducción de
caspasa – 1 y la liberación de IL – 1β
SLO activa los polimorfonucleares
SLO induce respuesta inmune (anticuerpos
antiestreptolisina)
Hemolisinas: Estreptolisina O
SLO: Estreptolisina O
SLS: Estreptolisina S

Perteneciente a la familia de microcinas thiazol/oxazol-
modificadas
Producida por varios patógenos que muestran actividad
hemolítica
Estable en la presencia de oxigeno
Forma poros hidrofilicos en varias células del sistema inmune y
poros en organelos subcelulares
Actúa a través de la acumulación de proteínas en la membrana,
que lleva a la formación de poros que resultan en lisis osmótica
SLS proteína de 2.7 kDa, sintetizada en ribosoma , sintetizada
desde un operon de 9 genes (sagA – sagI). La modificación post-
transcripcional resulta en la formación de un péptido que solo
el citolitico en presencia de moléculas “transportadora”
Por su pequeño tamaño no es inmunogénica
Contribuye a la patogénesis por citotoxicidad, activación de la
respuesta inflamatoria e inhibición de fagocitosis
Función probable de SLS es facilitar la invasión del patógeno a
través de la degradación de las uniones intercelulares de las
células epiteliales
SLO: Estreptolisina O
SLS: Estreptolisina S
Hemolisinas: Estreptolisina S

DNAsasHasta 4 DNAsas,
extracelulares
SdaD2, que
rpotegen a S.
pyogenes de los
neutrófilos al
degradar las NET
SdaI, participa en
la invasión de S.
pyogenes en
algunas cepas
Función de
evasión
inmunológica
SpdI1, degrada
DNA mono y
bicatenario, así
como RNA

Proteína M soluble
Molécula de
superficie,
Puede ser liberada a
través de la actividad
de proteasas,
(bacterianas o del
huésped)
Puede contribuir a la
activación de la
cascada de
coagulación
Las plaquetas pueden
ser activadas por la
proteína M soluble,
para formar complejos
con neutrófilos y
monocitos

Otros productos extracelulares pueden facilitar la liquiefacción de pus y la
diseminación de los estreptococos a través delos tejidos
•Degrada el ácido hialurónico del tejido conectivo subyacenteHialunoridasa
•Proteasa potente
•Superfamilia de exotoxinas asociadas con el síndrome tóxico , facitis necrosante,
•Incluyen a SpeA y SpeC, conocidas como toxinas escarlatinas
Exotoxina pirogénica
estreptococcica B (SpeB)
•Degrada la quimiotaxina C5a en el sitio de unión de los PMNPeptidasa C5a

Taxonomía
Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Lactobacillales
Familia: Streptococcaceae
Género: Stretococcus
Especie: S. agalactiae
Versalovic J; et al; Manual of Clinical Microbiology; 2011; 10th Edition

Morfología
Estreptococo del grupo B de Lancefield
β-hemolisis
Diplococos gram positivos facultativos que crecen
en una gran variedad de medios de cultivo
En agar sangre
• Colonias de 3 – 4 mm de diametro
• Tono blanco/grisaseo
• Planas
• Mucoides
• Rodeadas por una zona estrecha de β-hemolisis

Morfología
Resistencia a bacitracina y a
trimetorpim/sulfametoxazol
Hidrolisis de hipurato de
solido positivo
Producción de factor CAMP
(Chrisite, Atkinson, Munch,
Peterson)
Combinación del test de
CAMP con la susceptibilidad a
bacitracina y la prueba de bilis
esculina, brinda una
diferenciación adecuada de S.
agalactiae de otros tipos de
estreptococos B-hemolíticos
Identificación bioquímica

Morfología
Serotipificación
• Se diferencian por los polisacáridos capsulares y las proteínas de la superficie celular
• Históricamente se describieron dos antígenos carbohidratos
• Grupo β-específico (sustancia C), común para todas las cepas
• Sustancia S, que permite su clasificación en tipo I, II, II
• Tipos I, se pueden subtificar en Ia o Ib
• Otra antígeno de superficie es la proteína C, con los componenes α y β
• La proteína αC es el prototipo de la familia de proteínas que incluye a Rib y Alp1 –
Alp4
• La proteína βC se une a IgA y se encuentra en las cepas Ib
Future Microbiol. 2009 March ; 4(2): 201–221

Debe de adherirse a las
superficies para después
penetrar a sitios
normalmente estériles
como el torrente
sanguíneo
GBS tiene antígenos de
superficie que son
componentes de alto
peso molecular, con
unión covalente
similares a pili
Contribuyen a
adherencia e invasión
celular
El operon del pili
codifica para 3 proteínas
que contienen una
secuencia conservada
de aminoácidos, LPXTG,
asociada a proteínas de
unión celular

Cruza la barrera
via paracelular
La translocación de
barreras epiteliales
como ruta
predominante
para la
diseminación
Puede invadir el
epitelio
respiratorio y el
endotelio de la
microvasculatura
cerebral
Invasión

5 cepas virulentas
principales (Ia, Ib, II, III
y V)
Comparten 80% del
material genético
En la secuenciación del
genoma se describen
de 17 – 20 “sistema de
dos componentes”
Sin embargo existen
una numerosa variedad
de sistemas
reguladores y
transcripcionales
codificados en el
genoma de GBS
Regulación de factores de virulencia

Factores de
virulencia

Toxinas
perforantes
Promueven la entrada del
patógeno a la cella huésped
y favorece su supervivencia
intracelular y diseminación
Al menos dos toxinas β-hemolisina/citolicina (β-
H/C)
Factor CAMP (Christie-
Atkins-Munch-Petersen)

β-H/C (cylE)
• Toxina pluripotente de membrana, crucial para varios procesos de la infección por GBS
• Promueve la invasión de las barreras de la célula huésped
• Deprime la función cardiaca y propicia falla hepática
• Induce la respuesta inflamatoria
• Genes asociados cylA, cylB, cylJ, cylK, involucrados en la modificación post-transcripcional
de β-H/C
• Se asocia con la producción de un pigmento naranja que le da resistencia a las ROS y NOS
• β-H/C y su pigmento asociado se regula por sistemas de transcripción tipo TCS y activa la
transcripción de CAMP
β-H/C (cylE): β-hemolisina/citolicina
Toxinas perforantes

CAMP
Proteína secretada
Importante en la patogénesis de la infección por
GBS
Se une a proteínas unidas a glicofosfotidilinositol en
la célula receptora que sugiere que esta unión es
necesaria para la lisis celular
Complementaria a β-H/C, solo se “nota” su actividad cuando la
actividad de β-H/C esta disminuida
GBS modula la actividad de sus exotoxinas
formadoras de poros usando kinasas sensoras CovS
y Stk1
Toxinas perforantes

Polisacárido capsular rico en ácido sialico (CPS)
GBS esta
encapsulado por un
polisacárido capsular
, 10 serotipos
• Ia, Ib, II – IX
Depende del
mimetismo
molecular
CPS previene el
deposito de C3 y la
fagocitosis por el
sistema inmune
innato
GBS puede regular la
expresión de CSP en
respuesta del
ambiente del
huésped
• En cultivos celulares
CPS interfiere con la
adhesión y la
penetración de GBS
CovR/S regula la
expresión de cps
Factores que promueven la evasión inmune

Superoxido
dismutasa (SodA)
Hay resistencia a
ROS, adicional al
pigmento (β-H/C)
secreta una
superoxido
dismutasa + Mn2+
como cofactor
Convierte aniones
superoxido O2- a
oxigeno molecular
O2+ y agua,
Posteriormente
metabolizado por
las catalasas y
peroxidasas
La regulación de
soda es mediada
por RovS de
manera positiva
Factores que promueven la evasión inmune

C5a peptidasa (ScpB)
• Proteasa de serina que facilita la evasión
inmune
• Se codifica por el gen scpB
• Puede inactivar a complemente al
escindir la molécula C5a, esencial para el
reclutamiento de neutrófilos
• Puede promover la unión de GSB a las
células epiteliales y a la matriz
extracelular
Proteinasa de Serina (CspA)
• Puede escindir los componentes
de la matriz extracelular que
facilita la evasión inmune
• Degrada a fibrinógeno a fibrina
frustrando la respuesta inmune
y previene el reconocimiento y
fagocitosis

Cambios en la carga de superficie
• La forma mas común, al disminuir la carga de la superficie celular
• AMPs tiene carga positiva, la celula bacteriana tiene carga
negativa, la primera interacción es electrostática
• Las bacterias gram positivas incorporan D-alanina al acido
lipotecoico, esto disminuye la carga negativa , inhibiendo el
contacto con la membrana bacteriana
• Regulado por el operon dltRSA-BCD

La interacción
involucra la unión
inicial de GBS a
las proteínas de
matriz
extracelular
Que facilita la
interacción
subsecuente con
las integrinas
superficiales y la
entrada a la
célula huésped
Proteínas
ligadoras de
fibrinógeno
Dos proteínas,
FbsA y FbsB
FbsA es una
proteína de
superficie de
algunos serotipos
FbsB se encuentra
en todos los serotios
FbsA media la
adherencia y FbsB
promueve la
entrada celular
Regulada
negativamente por
el sistema Cov/S

Métodos diagnósticos (GAS)
Cultivo
Crece en agar sangre
Detecta la β-hemolisis
Medios selectivos
◦ Contienen feniletil alcohol
◦ Agar Columbia
◦ Agar con colistin y acido nalidixico
Las condiciones optimas de incubación
◦ Temperatura de 35 – 37 °
◦ 5% de CO2

Morfología
◦ B- hemolisis en agar sangre
◦ Apariencia típica después de las 24 horas de
incubación a 35 – 37°
◦ Colonias en forma de domo, superficie humeda
con márgenes delimitados
◦ Color blanco/gris
◦ Diámetro > 0.5 mm
◦ Rodeados de β-hemolisis
Prueba de catalasa positiva confirma la
presencia de estreptococos

Determinación de antígeno de Lancefield
◦ S. pyogenes pertenece al grupo A
◦ Otras especies de estreptococos pueden presentar antígeno de superficie A
Prueba de PYR
◦ Prueba colorimétrica para distinguir S. pyogenes de otros estreptococos B-hemolíticos con morfología
similar
◦ Detecta la enzima pyrrolidonyl aminopeptidasa, que hidroliza L-pyrrolinolil-B-naftilamida (PYR) a β-
naftilamida
◦ Produce un color rojo en la tira de reacción

Susceptibilidad a bacitracina
◦ Alta sensibilidad a bacitracina
◦ Identifica de otras cepas B-hemolíticas con
antígeno de superficie A, que pueden ser PYR
positivos
◦ S. iniae y S. porcinus
Detección directa de antígenos de S.
pyogenes
◦ Detección de antígeno de superficie A
◦ Sensibilidad del 58 – 96%
◦ Especificidad alta
Detección de NAAT
◦ Identificación de secuencias de rRNA
◦ Sensibilidad de 89 – 95% especificidad 98 – 99%
Rev Soc Bol Ped 2012; 51 (1): 12-4: Streptococcal pharyngitis, rapid test, strept test

Pruebas serológicas
◦ Anticuerpos antiestreptolisina O
◦ Aumenta una semana después de la infección y
alcanza pico de 3 – 6 semanas de la infección
◦ Detección de ASO es por neutralización de
antígenos
Anticuerpos contra DNAsa β
Títulos aumentan a las dos semanas y alcanzan
pico a las 8 semanas
◦ Los títulos se mantienen elevadas por mas
tiempo que los ASO

Métodos diagnósticos (GBS)
Identificación de colonias
Morfología
◦ B- hemolisis en agar sangre
◦ Apariencia típica después de las 24 horas de
incubación a 35 – 37°
◦ Colonias en forma de domo, superficie humeda
con márgenes delimitados
◦ Color blanco/gris
◦ Diametro > 0.5 mm
◦ Rodeados de B-hemolisis

Prueba de CAMP
◦ Lisis eritrocitaria sinérgica por la B-hemolisis de
S. aureus y la producción de la proteína
extracelular CFB de S. agalactiae
◦ Gen de CFB se expresa en > 98% de los S.
agalactiae
◦ Otras bacterias CAMP positiva
◦ S. iniae, S. porcinus S. pseudoporcinus
◦ L. monocytogenes, corinebacterium

Detección de antígenos urinarios
◦ Suficientemente sensibles para detectar la
colonización de S. agalactiae
◦ No recomendados por la CDC
Detección de antígenos en LCR
◦ Sensibilidad < 30%
◦ No da mayor sensibilidad que la tinción Gram
NAAT
◦ Detección de gen cfb por RT-PCR
◦ Sensibilidad de 94%, especificidad de 95.9%
◦ Aprobado por la FDA en hisopados vaginales y
rectales

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