traducción de articulo

1. RT-LAMP para el diagnóstico rápido del coronavirus SARS-CoV-2
Wei E. Huang, Boon Lim, Chia-Chen Hsu, Dan Xiong, Wei Wu, Yejiong Yu, Huidong Jia, Yun
Wang, Yida Zeng, Mengmeng Ji, Hong Chang, Xiuming Zhang, Hui Wang, Zhanfeng Cui
Publicado por primera vez: 25 de abril de 2020
https://doi.org/10.1111/1751-7915.13586
Citas: 127
Información sobre la financiación:
Oxford Suzhou Centre for Advanced Research (OSCAR), University of Oxford.
Resumen
La pandemia de coronavirus SARS-CoV-2 en el mundo ha provocado una gran población
infectada que sufre de COVID-19. Para frenar la propagación del virus, la OMS exigió
urgentemente una ampliación de las pruebas de detección; así, un método de diagnóstico
rápido y simple es necesario. Se aplicó una amplificación isotérmica inversa mediada por
bucle de transcripción (RT-LAMP) para lograr la detección de SARS-CoV-2 en 30 min.
Diseñamos cuatro conjuntos de cebadores LAMP (6 cebadores en cada conjunto), dirigidos
al ARN viral del SARS-CoV-2 en las regiones de orf1ab, el gen S y el gen N. Un cambio
colorimétrico fue utilizado para divulgar los resultados, que permite que el resultado de la
amplificación viral del ARN sea leído a simple vista sin la necesidad del instrumento costoso
o dedicado. La sensibilidad puede ser de 80 copias de ARN viral por ml en una muestra.
Validamos el método RT-LAMP en un hospital de China, empleando 16 muestras clínicas
con 8 positivos y 8 negativos. Los resultados de las pruebas son consistentes con el RT-qPCR
convencional. Además, también mostramos que el proceso de un solo paso sin extracción
de ARN es factible para lograr la amplificación de ARN directamente desde una muestra.
Este método RT-LAMP rápido, sencillo y sensible allana el camino para un gran cribado en
el dominio público y en los hospitales, en particular en los hospitales regionales y los centros
médicos de las zonas rurales.
Introducción
Existe una necesidad urgente de diagnóstico rápido de pacientes infectados por EL SARS-
CoV-2 con COVID-19 incluso antes de que pueda producirse una respuesta inmune y para
los portadores asintomáticos. Esto es fundamental para tomar decisiones sobre medidas de
salud pública, como las restricciones de movimiento y la duración de la cuarentena. La
prueba del ácido nucleico, es decir detectar el ARN viral, es un método factible y práctico.
Actualmente, el método más común para el diagnóstico de ácidos nucleicos se basa en rt-
pcr en tiempo real (Drosten et al., 2002; Mackay et al., 2002; Espy et al., 2006). Por ejemplo,
BGI en China(https://www.bgi.com/kit)y los CDC estadounidenses

2. (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019ncov/about/testing.html) proporcionan reactivos,
cebadores y sondas para apoyar el diagnóstico de RT-PCR para el SARS-CoV-2. Aunque la
RT-PCR en tiempo real es sensible y confiable, consume mucho tiempo (~ 2 h) y requiere un
dispositivo o instrumento de detección específico, lo que limita su amplia aplicación a la
enorme demanda actual de la pandemia mundial de COVID-19.
Para hacer frente a este desafío, un kit de prueba rápido y fácil de operar sería muy
deseable. Con dicha prueba, los pacientes infectados por el virus podrían ser identificados
en una etapa temprana y puestos en cuarentena para evitar la propagación de la infección,
mientras que los individuos no infectados podrían continuar con su vida como de
costumbre. Idealmente, el kit de prueba es móvil sin la necesidad de ningún instrumento
complicado y el resultado de la prueba se puede leer a simple vista. Por lo tanto, se puede
utilizar en aeropuertos, estaciones de ferrocarril y hospitales, en particular hospitales
regionales y centros médicos en las zonas rurales.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una tecnología rápida de
amplificación del ADN (Notomi et al., 2000; Tomita et al., 2008), que se ha aplicado a la
detección de patógenos como virus, bacterias y malaria (Thai et al., 2004; Boehme et
al., 2007; Mori y Notomi, 2009; Law et al., 2015; Reboud et al., 2019). La reacción LAMP
generalmente tiene lugar a una temperatura constante, y el ADN objetivo se puede
amplificar en 30 min (Tomita et al., 2008). El método LAMP emplea 4 o 6 cebadores para
unirse a seis regiones de un ADN diana, y la especificidad es extremadamente alta
(Notomi et al., 2000; Tomita et al., 2008). Dado que el método LAMP solo necesita una
temperatura constante (generalmente 65 °C), el dispositivo puede ser simple. Inicialmente,
el LAMP utiliza 4 cebadores (Notomi et al., 2000; Tomita et al., 2008),más tarde se
encuentra que la adición de dos cebadores de bucle puede acortar la mitad del tiempo
requerido para la reacción LAMP original (Nagamine et al., 2002). La disponibilidad de
WarmStart RTx Reverse Transcriptase (New England Biolabs, Reino Unido) permite
combinar tanto la transcripción inversa como LAMP en una sola reacción. Dado que el SARS-
CoV-2 es un virus de ARN con una longitud de aproximadamente 30 kb (Wang et al., 2020),
la reacción única de transcripción inversa (RT) y LAMP juntos pueden acortar
significativamente el tiempo de reacción sin la etapa de purificación del ADN de RT, por lo
que se puede lograr una detección rápida de SARS-CoV-2.
En este trabajo, desarrollamos un kit de diagnóstico de COVID-19 para la detección rápida
de SARS-CoV-2, utilizando transcripción inversa de un solo paso y amplificación isotérmica
mediada por bucle (RT-LAMP). Toda la reacción puede ser tan corta como 20 min a una
constante de 65 °C. El límite de detección es de 80 copias de ARN viral por ml de muestra.
Una simple indicación de cambio de color se puede visualizar a simple vista para confirmar
el resultado de la amplificación del ARN viral. Los kits fueron validados por 16 muestras
clínicas de COVID-19. Esta nueva técnica también puede proporcionar un enfoque rápido y
factible para la detección de diversos virus.

3. Resultados
Especificidad de los cebadores O117, S17, N1 y N15 para amplificar el ADN sintetizado del
SARS-CoV-2. Se diseñaron cuatro conjuntos de cebadores LAMP O117, S17, N1 y N15, que
se dirigen a la codificación de ARN Orf1ab, la glicoproteína spike y dos regiones en la
proteína nucleocápmenteide del SARS-CoV-2 respectivamente (Fig. S1). Cada conjunto
tiene 6 cebadores (Tabla 1). El SARS-CoV-2 es un virus ARN monocatenario con una longitud
de unos 30 kb. Orf1ab tiene aproximadamente 21kb de largo, codificando la poliproteína
replicasa (Woo et al., 2010). Los cebadores O117 fueron diseñados para cubrir la región
inversa de 5'-extremo del ARN viral en Orf1ab (Fig. S1). Los cebadores S17 se dirigen al gen
S, que codifica la glicoproteína spike, una clave para que este virus SARS-CoV-2 se una a la
proteína ACE2 humana e invada las células humanas (Menachery et al., 2015; Cui et
al., 2019; Walls et al., 2020). El gen N de la proteína nucleocáppsida se encuentra en el
extremo 3ʹ del ARN viral, conservado para el coronavirus similar al SARS (Cui et al., 2019).
Durante los procesos de muestreo y extracción de ARN, el ARN viral podría ser atacado por
la ARNasa, degradándose de 5ʹ- a 3ʹ-, por lo que diseñamos N1 y N15 para asegurar la
detección de 3ʹ-extremo del ARN viral del SARS-CoV-2, aunque esté parcialmente
degradado. Los fragmentos de ARN del SARS-CoV-2 dirigidos de estos cuatro conjuntos de
cebadores (Fig. S1 y Tabla 1)son de aproximadamente 240-260 pb, lo suficientemente
largos como para ser dirigidos por 6 cebadores y lo suficientemente cortos como para lograr
una amplificación rápida.
Tabla 1. Cebadores para la detección del SARS-CoV-2.

4. En todos los experimentos de LAMP y RT-
LAMP, los experimentos se llevaron a cabo con
más de tres réplicas biológicas y los resultados
fueron consistentes.
Para verificar su especificidad, primero
probamos estos cebadores utilizando ADN
diana sintético del SARS-CoV-2. Los cebadores
N1 y N15 fueron capaces de amplificar
fragmentos de ADN del gen N, pero no adn
genómico humano (Fig. 1A y B). Al agregar el tinte fluorescente proporcionado por NEB
(New England Biolabs, Reino Unido), los resultados positivos se pueden visualizar
directamente desde los tubos de PCR bajo exposición UV. La intensidad fluorescente en los
tubos de amplificación positiva fue mayor que la de los tubos de amplificación negativa,
aunque el fondo de fluorescencia también estuvo presente en los tubos negativos (Fig. 1A
y B). Las lecturas fluorescentes son constantes a los resultados por el gel de la electroforesis.
Sin embargo, el fondo de la señal fluorescente podría causar una lectura ambigua y requiere
un instrumento fluorescente sensible para analizar el resultado. Así que lo cambiamos a
lectura colorimétrica más adelante en este estudio.
Figura 1. amp resultados de cuatro conjuntos diferentes de cebadores dirigidos al ADN del
gen N, S y Orf1ab del SARS-CoV-2.

5. A. Rendimiento del conjunto de cebadores N-1 utilizando la secuencia de ADN del gen N.
(1) Cebadores N-15 + ADN del gen N (200k copias)*; (2) Cebadores N15 + ADN del gen N
(200 copias); (3) Cebadores N15 + ADN del gen N (200k copias) + Genoma humano; (4)
Cebadores N15 + ADN del gen N (200 copias) + Genoma humano; (5) Cebadores N15 +
Genoma humano; (6) Cebadores de β-actina humana + Genoma humano; (7) Cebadores de
β-actina humana + ADN del gen N (200k copias); L, Escalera. Los resultados de LAMP usando
tinte fluorescente se visualizaron bajo exposición UV, que es consistente con el resultado
de la electroforesis en gel.
B. Rendimiento del conjunto de cebadores N-15 utilizando la secuencia de ADN del gen N.
(1) cebadores N-15 + ADN del gen N (200k copias); (2) Cebadores N15 + ADN del gen N (200
copias); (3) Cebadores N15 + ADN del gen N (200k copias) + Genoma humano; (4) Cebadores
N15 + ADN del gen N (200 copias) + Genoma humano; (5) Cebadores N15 + Genoma
humano; (6) Cebadores de β-actina humana + Genoma humano; (7) Cebadores de β-actina
humana + ADN del gen N (200k copias); L, Escalera. Los resultados de LAMP usando tinte
fluorescente se visualizaron bajo exposición UV, que es consistente con el resultado de la
electroforesis en gel.
C. Rendimiento del juego de cebadores O-117 utilizando la secuencia de ADN del gen
Orf1ab. (1) Cebadores O-117 + ADN del gen Orf1ab (200k copias); (2) cebadores O-117 +
ADN del gen Orf1ab (200 copias); (3) cebadores O-117 + ADN del gen Orf1ab (20 copias);
(4) cebadores O-117 + ADN del gen Orf1ab (2 copias); (5) Cebadores O-117 + ADN del gen
Orf1ab (200 copias) + Genoma Humano; (6) Cebadores O-117 + Genoma Humano; (7)
Cebadores O-117 + agua (8) Cebadores de β-actina humana + ADN genómico humano; (L)
Escalera.
D. Rendimiento del conjunto de cebadores S-17 utilizando la secuencia de ADN del gen S.
(1) cebadores S-17 + ADN del gen S (200k copias); (2) cebadores S-17 + ADN del gen S (200
copias); (3) cebadores S-17 + ADN del gen S (20 copias); (4) cebadores S-17 + ADN del gen S
(2 copias); (5) Cebadores S-17 + ADN del gen S (200 copias) + Genoma Humano; (6)
Cebadores S-17 + Genoma Humano; (7) Cebadores S-17 + agua (8) Cebadores de β-actina
humana + ADN genómico humano; (L) Escalera. *200k (200,000) 200, 20 and 2 represent
the total copy number of DNA sequence in the reaction mix.
Del mismo modo, los cebadores O117 y S17 también pueden amplificar específicamente los
fragmentos de ADN sintetizados del gen Orf1ab y el gen S, respectivamente, pero no
pudieron amplificar el ADN genómico humano (Fig. 1C y D). La adición de ADN genómico
humano al ADN viral en la mezcla de reacción no interfirió con el rendimiento de
amplificación (carril 4 en la Fig. 1A y B,carril 5 en la Fig. 1C y D),que es esencial para el uso
de RT-LAMP para detectar ARN viral en una muestra humana. El tiempo de reacción de
LAMP para todos los experimentos fue de 30 min. Se obtuvieron productos de amplificación
positiva incluso para 2 copias de la plantilla de fragmentos de ADN viral sintético en 30 min
cuando se utilizaban los cebadores S17 (carril 4 en la Fig. 1D),demostrando que la reacción
LAMP fue rápida y sensible.

6. RT-LAMP y sensibilidad para amplificar el ARN sintetizado del SARS-CoV-2
Para evaluar el potencial de RT-LAMP en la detección del virus ARN del SARS-CoV-2, a
continuación se probó el rendimiento de estos cebadores con fragmentos de ARN
sintetizados del gen N, el gen S y el gen Orf1ab obtenidos a partir de la transcripción in
vitro (Apéndice S1). Muestra que la transcripción inversa y LAMP se pueden integrar en una
sola reacción RT-LAMP para amplificar específicamente los fragmentos de ARN viral (Fig. 2).
Figura 2. Sensibilidad y eficiencia de RT-LAMP utilizando cebadores N1 y N15 (A, B, C). La
secuencia del ARN del gene de N fue derivada de la transcripción in vitro y utilizada como
la blanco. La mezcla de la reacción era muestreo en (a) 15 minutos, (b) 20 minutos y (C) 30
minutos (1) los cebadores N1 + el ARN del gene de N (200); (2) Cebadores N1 + ARN del gen
N (20); (3) Cebadores N1 + ARN del gen N (2); (4) Cebadores N15 + ARN del gen N (200); (5)
Cebadores N15 + ARN del gen N (20); (6) Cebadores N15 + ARN del gen N (2); (L) Escalera.

7. Sensibilidad y eficiencia de RT-LAMP utilizando cebadores O-117 (D, E, F) y S-17 (G, H, I). El
ARN de orf1ab y S17 se derivó de la transcripción in vitro y se utilizó como dianas. La mezcla
de la reacción era muestreo en (D, G) 15 minutos, (E, H) 20 minutos y (F, I) 30 min. (1)
cebadores virales + blanco del ARN (200 k); (2) Cebadores Virales + ARN diana (200); (3)
Cebadores Virales + ARN diana (20); (4) Cebadores Virales + ARN diana (2); (5) Cebadores
virales + DIANA DE ARN (200) + genoma humano; (6) Cebadores Virales + genoma humano;
(7) Cebadores Virales + Agua; (8) Cebadores humanos + genoma humano
Evaluamos la sensibilidad de RT-LAMP diluyendo el número de copias de arn diana de 200
a 2 copias por reacción (en total 25 μl de solución de reacción) y examinamos la eficiencia
mediante el muestreo de la mezcla de reacción a los 15, 20 y 30 min después de que
comenzara la reacción. Muestra que 2 copias de ARN objetivo se pueden amplificar a nivel
detectable utilizando cebadores N1 dentro de 20 min, mientras que requiere 30 min
utilizando cebadores N15 (Fig. 2A–C). La sensibilidad y la eficiencia de RT-LAMP también se
probaron en cebadores S17 y O117. Como se muestra en la Figura 2,se pueden detectar 2
copias de ARN del gen S utilizando cebadores S17 en 30 min, mientras que el límite de
detección utilizando cebadores O117 es de 20 copias de ARN del gen Orf1ab en 30 min. Los
resultados sugieren que RT-LAMP es lo suficientemente sensible como para detectar ARN
viral dentro de una reacción de 30 minutos y la sensibilidad puede ser de 2 copias en la
reacción de 25 μl (80 copias de ARN viral por ml) mediante el empleo de cebadores N1 y
S17. También se observa que cuanto mayores sean las copias de ARN, menor será el tiempo
necesario para obtener los productos (Fig. 2). Cuando el número de copias de ARN es de
200 por reacción, el resultado de la amplificación se puede observar tan corto como 15 min
(Fig. 2).
El cambio de color de la mezcla de reacción LAMP proporciona resultados semicuantitados
Dado que la notificación de resultados mediante tinte fluorescente requiere un instrumento
específico (Fig. 1),también intentamos leer los resultados a simple vista. Dado que la
amplificación de ácidos nucleicos libera pirofosfato e iones de hidrógeno, lo que disminuye
el pH de la solución de reacción, se puede utilizar un indicador de pH sensible para mostrar
el resultado positivo o negativo de RT-LAMP (Tanner et al., 2015; Poole et al., 2017). Por lo
tanto, el resultado de RT-LAMP se puede visualizar mediante un indicador de pH como el
rojo fenol, que muestra el color rosa 8.2-8.6 y se vuelve amarillo cuando el pH desciende.
Utilizando el WarmStart™ Colorimetric LAMP 2× Master Mix (ADN y ARN) de New England
Biolabs, se pudo observar un cambio de color visible de rosa a amarillo si se ha producido
la amplificación de la secuencia objetivo (Fig. 3). Mostramos que el ensayo colorimétrico
RT-LAMP puede detectar de forma fiable N genes del ARN viral del SARS-CoV-2, y el cambio
de color podría indicar el número de secuencia diana semicuantitativamente (Fig. 3).

8. Figura 3. Ensayo colorimétrico RT-LAMP utilizando cebadores N15.
A. Color de las mezclas de reacción antes de RT-LAMP.
B. Color de las mezclas de reacción después de RT-LAMP.
C. Electroforesis en gel de mezclas de reacción. La intensidad de los productos RT-LAMP en
el gel coincide con el color de las mezclas de reacción y proporciona resultados semicuantita
cuantitativos. (1) Cebadores N15 + ARN del gen N (200k); (2) Cebadores N15 + ARN del gen
N (200); (3) Cebadores N15 + ARN del gen N (20); (4) Cebadores N15 + ARN del gen N (2);
(5) Cebadores N15 + genoma humano; (6) Cebadores humanos + genoma humano; (7)
Cebadores humanos arn humano entero; (8) Colorimetric MasterMix solamente.
Lectura colorimétrica y fluorescente en una reacción RT-LAMP
La lectura colorimétrica depende del cambio de pH durante RT-LAMP. Sin embargo, en la
aplicación clínica, muchos factores podrían interferir en el cambio de pH. Por ejemplo, las
condiciones de la muestra del paciente pueden ser diferentes, introduciendo factores
inciertos al cambio de pH en la reacción RT-LAMP. Además, el ARN viral del SARS-CoV-2
podría ser eluido por varios tampones, lo que podría ser compatible con la reacción RT-
LAMP, pero podría afectar significativamente a la lectura colorimétrica (Fig. S2). Para
superar la incertidumbre y garantizar la fiabilidad de los resultados del diagnóstico, también

9. diseñamos otro conjunto de cebadores FIP, cuyo extremo 5ʹ se conjugaba con FAM
fluorescente (6-Carboxyfluorescein; Cuadro 1). La Figura 4 muestra que la aplicación de
cebadores 5ʹ-FAM-FIP fue capaz de mostrar lecturas colorimétricas y fluorescentes, y ambos
resultados fueron consistentes.
Figura 4. Los productos de RT-LAMP se pueden leer tanto por cambio de color como por
señal fluorescente, que son consistentes.
A. Visualización colorimétrica de los productos RT-LAMP.
B. Imagen fluorescente bajo la lámpara UV de los productos RT-LAMP. #1, #2 y #3 muestras
contenían por separado imprimaciones de N15, O117 y β-actina.

10. La prueba clínica valida el rendimiento de RT-LAMP
Para validar el rendimiento de RT-LAMP en el diagnóstico de COVID-19, un kit de prueba
que consta de tres tubos (#1: cebadores O117, #2: cebadores N15 #3: cebadores de β-actina
humana; Ver Materiales y Métodos) fue enviado al hospital popular de Shenzhen Luohu
para su validación clínica. RT-qPCR y RT-LAMP analizaron las 16 muestras clínicas (8
positivas y 8 negativas) en paralelo, que fueron tomadas por hisopo de los pacientes de
forma estándar. Las muestras fueron probadas inicialmente por RT-qPCR convencional;
luego, se utilizó RT-LAMP para probar las mismas muestras. Utilizando RT-LAMP, los tubos
#1 y #2 de cada kit de prueba se volvieron amarillos, lo que indica la presencia de ARN viral
objetivo en las 8 muestras positivas, mientras que los #1 de tubo y #2 permanecieron
rosados para las 8 muestras negativas (Figura 5). Esto demuestra que el ensayo RT-LAMP
tiene una buena concordancia con los resultados convencionales de RT-PCR en el
diagnóstico de muestras de COVID-19 (Fig. 5 y Fig. S3). La #3 de todos los kits de prueba se
mantuvo rosada en muestras positivas y negativas, lo que indica que los cebadores de β-
actina humana no son capaces de detectar las transcripciones de genes deactina β dentro
de las muestras de pacientes. Comparando los resultados entre RT-qPCR y RT-LAMP, se
muestra que el RT-LAMP fue capaz de detectar ARN viral con CT = 36 por RT-qPCR (Tabla 2),
lo que sugiere que RT-LAMP con lectura visualmente de cambio de color es muy sensible.

11. Figura 5. Validación de RT-LAMP utilizando 16 muestras clínicas de COVID-19 del hospital
popular de Shenzhen Luohu. Las muestras se analizaron primero con RT-PCR convencional
(Tabla 2),y ocho muestras positivas fueron etiquetadas como 'P', y ocho muestras negativas
fueron etiquetadas como 'N'. Los componentes de cada kit de prueba se enumeran en
Procedimientos experimentales. Tres tubos en cada ensayo RT-LAMP se #1, #2, #3 en orden
de izquierda a derecha. Los #1 y #2 contienen por separado cebadores O117 y N15 dirigidos
al gen Orf1ab y al gen N del SARS-CoV-2. Los #3 de tubo contienen cebadores de β-actina
humana. Para el tubo #1 y 2, todas las muestras positivas se volvieron amarillas, mientras
que todas las muestras negativas permanecieron rosadas después de una reacción de 30
minutos. Los resultados del método RT-LAMP son consistentes con los resultados de la RT-
PCR convencional (Tabla 2 y Fig. S1).

12. Tabla 2. Comparación de los resultados convencionales de RT-qPCR y LAMP para muestras
clínicas.
Ct, umbral del ciclo; E, gen E para la proteína envolvente; IC, gen de la ARNasa como control
interno; Gen N, N para la proteína nucleocápsida; ORF1ab, gen orf1ab.
Proceso de un solo paso de detección de ácidos nucleicos utilizando RT-LAMP
Las muestras de células se pueden procesar en un solo paso para obtener la amplificación
de ácidos nucleicos. El calentamiento de las células a la misma temperatura de RT-LAMP 65
°C debe lyse las células o virus y liberar ARN. En este estudio, probamos el proceso de un
solo paso usando las células madres pluripotentes inducidas episomales humanas (iPSCs),
que fueron suspendidas en 0,85% salino. La Figura 6 muestra que los ácidos nucleicos del
gen de la β-actina en las células iPSC se pueden amplificar directamente utilizando RT-LAMP
en un plazo de 40 min. Después de 30 min, sólo el ARN humano purificado puede ser

13. amplificado, mostrando el cambio de color (Fig. 6A). Sin embargo, después de 40 minutos,
el tubo con células humanas cambió el color, mientras que el tubo sin células humanas y el
control del agua en blanco permaneció sin cambios de color rosa (Fig. 6B). El proceso de un
solo paso es lo suficientemente sensible como para detectar 10 células humanas por
reacción de 25 μl. Este proceso de un solo paso tomó 10 minutos más que RT-LAMP a ARN,
porque toma alrededor de 5-10 minutos de tiempo para lisear las células y liberar ácidos
nucleicos. El resultado sugiere que debería ser posible utilizar un solo paso para lograr la
detección de ácidos nucleicos específicos en las células. Se necesitan pruebas adicionales
para validar su viabilidad práctica en muestras de hisopos clínicos que contienen SARS-CoV-
2.
Figura 6. Proceso de un solo paso para obtener los productos de la amplificación de ácidos
nucleicos. Un microlitro de células iPSC en solución salina estéril al 0,85% se añadió
directamente a los reactivos LAMP en cada tubo y se incubó durante 30 min (A) y 40 min
(B). Todo el proceso fue de 40 min. (1) 0 células + cebadores de β-actina humana. (2) 10
células + cebadores de β-actina humana. (3) 50 células + cebadores de β-actina humana. (4)
100 células + cebadores de β-actina humana. (5) Arn humano extraído + cebadores de β-
actina humana. (6) H2O + Cebadores de β-actina humana.

14. Discusión
Aquí, describimos un método rápido y fácil de operar para diagnosticar COVID-19.
Aplicamos RT-LAMP para lograr una prueba rápida de SARS-CoV-2, utilizando diferentes
cebadores (O117, S17, N1 y N15) para atacar el gen Orf1ab, el gen S y el gen N. Mostramos
que una reacción de 30 min podía detectar hasta 2 copias de ARN diana por reacción de 25
μl (80 copias por ml; Figs. 1 y 2). Sin embargo, esta sensibilidad extrema también es un arma
de doble filo: la contaminación por arrastre era común en las reacciones LAMP, que
generalmente causan resultados falsos positivos (Hsieh et al., 2014; Ma et al., 2017).
También observamos la contaminación del arrastre después de que las reacciones de RT-
LAMP fueran realizadas varias veces en el laboratorio. Sospechamos que el aerosol formado
a partir de los productos RT-LAMP fueron capaces de propagarse por todas partes en el
laboratorio, contaminando batas de laboratorio, pipetas, reactivos, materiales y equipos
utilizados para la siguiente reacción, por lo tanto, para uso clínico todos los componentes
requeridos en la reacción RT-LAMP deben prepararse en un espacio de laboratorio
separado con buenas prácticas de biología molecular.
La visualización colorimétrica del resultado de la prueba es fácil sin la necesidad de un
instrumento costoso o complicado. Sin embargo, el cambio de color de la reacción RT-LAMP
se basa en el indicador de pH rojo fenol (Tanner et al., 2015; Poole et al., 2017). Los
tampones de elución de los diversos kits de extracción de ARN afectarán significativamente
el resultado. Por lo tanto, en todos nuestros experimentos, incluidas las pruebas clínicas,
las muestras de ARN se eluieron en agua libre de DNasa /ARNasa para garantizar que el
tampón de elución de ARN tenga un impacto mínimo de la indicación de pH en las
reacciones RT-LAMP. Las pruebas clínicas de ARN viral funcionan bien para coincidir con los
resultados de RT-qPCR. Para el tubo #3, todas las muestras fueron negativas, lo que sugiere
que el ARN de la transcripción del gen deβ-actina humana no se amplificó en las muestras
(Fig. 5). El diseño de cuatro cebadores paraβ-actina humana (Poon et al., 2005)podría
requerir un tiempo de reacción más largo que 30 min en el ensayo RT-LAMP. En el futuro,
se debería aplicar el mejor control humano. Por ejemplo, los cebadores para el gen humano
de la ARNasa se pueden utilizar como control positivo.
El objetivo final es desarrollar un dispositivo cerrado que integre la extracción de ARN, la
purificación, la transcripción inversa (RT) y la amplificación isotérmica mediada por bucle
(LAMP) para detectar el virus SARS-CoV-2 directamente a partir de una muestra de hisopo
de garganta. Es bien sabido que la PCR de colonias se puede hacer directamente utilizando
células (Huang et al., 2005). El calentamiento de las células puede causar lisis celular y
liberación de ácido nucleico, que se puede utilizar como plantilla para la amplificación de
ácidos nucleicos. Probamos RT-LAMP de un solo paso para la amplificación de ácidos
nucleicos y funcionó bien (Fig. 6). La ventaja es que la misma temperatura de 65 °C para RT-
LAMP fue capaz de lisear las células y la lisis celular en agua pura (o con baja sal) no afectó
a la reacción de RT-LAMP. Este trabajo preliminar sugiere que es posible combinar la

15. extracción de ARN, RT y LAMP en un solo paso, lo que simplificará significativamente el
proceso de detección y acortará el tiempo de detección. Los criterios actuales de la prueba
en China son 300 copias ml−1; los resultados preliminares de RT-LAMP en una sola etapa
deben cumplir este requisito.
Demostrar la viabilidad de RT-LAMP en el diagnóstico de COVID-19 es el primer paso hacia
el desarrollo de un kit de diagnóstico más accesible. Las pruebas son cruciales no solo para
hacer llegar el tratamiento a los necesitados, sino también para frenar la propagación de
enfermedades dentro de una región. A medida que nos enfrentamos a una escasez mundial
de kits de pruebas en medio de esta pandemia mundial, nuestro trabajo será vital para
abordar esta necesidad en la práctica clínica, así como para extendernos hacia un sistema
de diagnóstico basado en el hogar o personal.
Con este trabajo de prueba de concepto, es posible desarrollar un kit de prueba simple, de
bajo costo y de un solo paso que se puede utilizar para detectar el virus SARS-CoV-2 en el
punto de atención (POCT). Existe la necesidad de una prueba rápida in situ para la infección
que se puede operar fácilmente con una formación mínima y sin el riesgo de infectarse. Los
métodos existentes para detectar el SARS-CoV-2 se basan en la detección del propio ARN
del virus utilizando tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR) en tiempo
real de transcripción inversa, o en IgM e IgG específicos de la sangre de los pacientes
generada varios días después de la infección. Actualmente, estas pruebas requerirían un
laboratorio con máquinas específicas operadas por científicos y técnicos calificados que
tardan al menos 2 h en realizarse. El objetivo final será el desarrollo de un dispositivo de
prueba cerrado rápido (30-45 min) con operación en un solo paso para la detección del virus
SARS-CoV-2. Se detectan múltiples sitios en el ARN viral para garantizar la especificidad y la
sensibilidad, y se integra un control interno para evitar falsos positivos y falsos negativos.
Este estudio allanará el camino para avanzar en la detección y el diagnóstico rápidos y a
gran escala, donde los pacientes que presentan síntomas sospechosos pueden ser probados
en las primeras etapas.
Procedimientos experimentales
Líneas celulares y muestras clínicas
Human Episomal iPSC Line fue comprada a Thermo Fisher (Reino Unido) y utilizada como
fuente de ADN genómico humano y ARN.
El hospital popular de Shenzhen Luohu está autorizado por los CDC chinos para la detección
de muestras clínicas para el virus SARS-CoV-2. Todas las muestras clínicas fueron
muestreadas por hisopo clínico de garganta, almacenadas y transportadas por medios de
transporte de virus (VTM). Los pasos de desactivación del virus se realizaron siguiendo las
directrices estándar para la detección de ácido nucleico del SARS-CoV-2 en muestras
clínicas. La investigación sobre la técnica de diagnóstico rápido para COVID-19 utilizando

16. muestras clínicas ha sido aprobada por el comité ético del hospital Shenzhen Luohu
People's.
Diseño de cebadores y síntesis de ADN/ARN para RT-LAMP
Se diseñaron cuatro conjuntos de cebadores LAMP dirigidos a los genes Orf1ab, S y N del
SARS-CoV-2 publicados en NCBI (GenBank NC_045512.2). Los cebadores se diseñaron
utilizando el software de diseño de cebadores LAMP,
PrimerExplorer(http://primerexplorer.jp/e/; Tomita et al., 2008). seis cebadores,
incluyendo el cebador delantero F3, el cebador hacia atrás B3, el cebador interior hacia
adelante FIP, el cebador interno hacia atrás BIP, el cebador de bucle delantero LF y el
cebador de bucle hacia atrás LB fueron diseñados para acelerar la reacción LAMP
(Nagamine et al., 2002). La Tabla 1 muestra todas las secuencias de cebadores utilizadas en
este trabajo. En algunos experimentos, 5ʹ-end de cebadores FIP fueron etiquetados por
FAM. Para llevar a cabo un simulacro de experimento, también diseñamos cuatro
fragmentos de ADN, cada uno de los cual contiene un promotor T7 para la transcripción in
vitro (Apéndice S1). Todos los cebadores y fragmentos de ADN diseñados, así como un
plásmido control de nCoV_N_Positive 2019, se pidieron a Integrated DNA Technologies
(IDT, Reino Unido).
Purificación de ADN y ARN
Los fragmentos de ADN de los genes diana N, S y Orf1ab fueron sintetizados por IDT y
reconstituidos a 50 ng μl−1 según las instrucciones del fabricante. El número de copias de
cada gen diana se determinó a partir de su peso molecular y se diluyó en 200 000, 200, 20
y 2 copias μl−1 para experimentos posteriores.
T7_N, T7_S y adn T7_O sintetizado por IDT se reconstituyeron a 50 ng μl−1 según las
instrucciones del fabricante. Estas secuencias de ADN se sometieron a transcripción in vitro
utilizando HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Reino Unido).
Los productos de transcripción se purificaron utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Reino
Unido), y la concentración y la calidad del ARN se midieron utilizando Nanodrop. El número
de copias de cada ARN diana se determinó a partir de su peso molecular y se diluyó en 200
000, 200, 20 y 2 copias μl−1 para experimentos posteriores.
El genoma entero humano se purificó a partir de células iPSC humanas utilizando Fast DNA™
SPIN Kit de MP Biomedicals seguido de DNA Cleanup Kit (New England Biolabs, Reino
Unido). El arn entero humano se purificó de iPSCs humanos usando RNeasy Mini Kit (Qiagen,
Reino Unido).

17. LAMP y RT-LAMP para el SARS-CoV-2
Todo el equipo, el gabinete de flujo laminar y el banco de trabajo se rociaron con
RNaseZap™ antes del trabajo experimental. Se utilizaron puntas de pipeta filtradas para
evitar la contaminación cruzada. Todos los experimentos de LAMP y RT-LAMP se ejecutaron
durante al menos tres réplicas.
Una mezcla de cebadores 10X (FIP, 16 μM; BIP, 16 μM; F3, 2 μM; B3, 2 μM; LF, 4 μM; LB, 4
μM) se realizó antes de las reacciones. Las reacciones LAMP y RT-LAMP se llevaron a cabo
utilizando WarmStart™ LAMP 2× Master Mix (ADN / ARN) o WarmStart™ Colorimetric LAMP
2× Master Mix (ADN y ARN) de New England Biolabs (NEB).
Una mezcla de reacción de 25 μl (2× MasterMix, 12,5 μl; mezcla de cebador de 10×, 2,5 μl;
Diana ADN/ARN, 1 μl; DNasa &agua de grado molecular libre de ARNasa, 9 μl) se mezcló
homogéneamente y se centrifugó durante 1 s. LAMP o RT-LAMP se realizó en un
termociclador a 65 °C durante 30 min. El cambio de color se puede observar directamente
a simple vista, y la electroforesis del gel fue realizada para confirmar el resultado.
LAMP y RT-LAMP para células humanas
Todo el equipo, el gabinete de flujo laminar y el banco de trabajo se rociaron con
RNaseZap™ antes del trabajo experimental. Se utilizaron puntas de pipeta filtradas para
evitar la contaminación cruzada.
Los iPSCs episomales humanos obtenidos de Thermo Fisher Scientific (Reino Unido) se
disociaron con 0,5 mM EDTA (pH 8,0; Thermo Fisher Scientific) en PBS estéril. Las células
fueron entonces contadas, resuspended y diluidas en 100, 50, y 10 células μl−1 en solución
estéril de NaCl al 0,85% (Sigma-Aldrich).
Una mezcla de cebador de 10× β-actina (FIP, 16 μM; BIP, 16 μM; F3, 2 μM; B3, 2 μM) se
realizó antes de las reacciones, y LAMP y RT-LAMP se llevaron a cabo utilizando WarmStart™
Colorimetric LAMP 2× Master Mix (DNA &RNA) de New England Biolabs (NEB). Para la
amplificación en un solo paso de ácidos nucleicos, las células en 200 μl 0,85% de NaCl se
calentaron primero a 65°C durante 10 min y una mezcla de reacción de 25 μl (2× MasterMix,
12,5 μl; 10× mezcla de cebador, 2,5 μl; la muestra de células hervidas, 1 μl; Se preparó
DNasa &agua de grado molecular libre de ARNasa, 9 μl). Por otro lado, para la célula en
experimentos LAMP, las células se añadieron directamente a los reactivos de reacción
LAMP, donde una mezcla de reacción de 25 μl (2× MasterMix, 12,5 μl; 10× mezcla de
cebador, 2,5 μl; solución de NaCl al 0,85% con o sin iPSCs, 1 μl; Se preparó DNasa &agua de
grado molecular libre de ARNasa, 9 μl). LAMP/RT-LAMP se realizó en un termociclador a
65°C durante 30 o 40 min. El cambio de color fue observado directamente a simple vista.
Extracción de ARN de muestras clínicas
Las muestras respiratorias (hisopos de garganta) recogidas de los pacientes se colocaron
inmediatamente en tubos estériles que contenían 3 ml de VTM (Health Gene Technologies,

18. Ningbo, China). En total, se recogieron 16 muestras clínicas de pacientes. Las muestras de
hisopos se desactivaron calentando a 56 °C durante 30 min en un laboratorio médico de
nivel de bioseguridad 2 (BSL 2) del Hospital Popular shenzhen Luohu en China. El ARN se
extrajo de muestras de hisopos utilizando el kit de extracción de ARN (Health Biomed,
China) en una plataforma Smart LabAssist-32 (Taiwan Advanced Nanotech Inc, Taoyuan,
China). Para evitar la interferencia del almacenador intermediario de TE a la reacción de RT-
LAMP, el ARN fue eluted por el agua RNase-libre y DNase aquí.
RT-qPCR convencional para el SARS-CoV-2
Se utilizó un kit comercial de RT-PCR 2019-nCoV (Shanghai ZJ Bio-Tech, China) para
determinar si las muestras son positivas o negativas para el virus SARS-CoV-2. en un sistema
de PCR en tiempo real ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, EE. UU.) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Una mezcla de reacción de 25 μl contenía 5 μl de ARN
como plantilla, 19 μl de 2019-nCOV RT -PCR Buffer, 1 μl de mezcla de enzimas RT-qPCR. La
condición de ciclo térmico fue de 10 min a 45°C para la transcripción inversa, 3 min a 95°C
para la activación inicial por PCR y 45 ciclos de 15 s a 95°C y 30 s a 58°C.
RT-LAMP para muestras de ARN clínico
Los ensayos RT-LAMP en muestras clínicas se realizaron en kits de prueba premezclados.
Cada kit de ensayo consta de tres tubos #1, #2 y #3, que contienen cebadores de O-117, N-
15 yβ-actina humana respectivamente (Tabla 1). Los tres tubos se llenaron primero con 5 μl
de agua libre de ARNasa (Sigma-Aldrich), 12,5 μl de WarmStart Colorimetric Lamp 2× Master
Mix (New England Biolabs, Reino Unido) y 2,5 μl de mezcla de imprimación 10x. Los kits de
prueba se prepararon por primera vez en OSCAR y se entregaron al hospital popular de
Shenzhen Luohu en una caja de hielo. Para la detección del virus SARS-CoV-2, se añadieron
5 μl de ARN extraído de cada muestra de paciente en #1 de tubo, #2 y #3 respectivamente.
El kit de prueba se incubó a 65°C durante 30 min.
Agradecimientos
Z.F.C y W.E.H agradecen el apoyo financiero del Oxford Suzhou Centre for Advanced
Research (OSCAR), Universidad de Oxford.
Conflicto de intereses
Ninguno declarado.