2º bachillerato

1. TINCIÓN
GRAM

2. FUNDAMENTO

3. Fundamento
Es un tipo de tinción diferencial empleado
en microbiología para la visualización de
bacterias.
Debe su nombre al bacteriólogo danés
Christian Gram, que desarrolló la técnica
en 1884.
Las bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas tiñen de forma distinta debido a
las diferencias constitutivas en la estructura
de sus paredes celulares

4. Fundamento
La pared de la célula Gram+ es
gruesa y consiste en varias capas
interconectadas de Peptidoglicano
así como algo de ácido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la
pared de la célula Gram+ es
Peptidoglicano.

5. Fundamento
La pared de la célula Gram-
contiene una capa mucho más
delgada, únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por
una membrana exterior compuesta
de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas.
Sólo 10% - 20% de la pared de la

6. Fundamento.
El cristal violeta es un colorante que
penetra la pared celular de bacterias, tanto
Gram + como Gram -
Posteriormente se agrega el lugol que es
mordiente y se forma un complejo con el
cristal violeta.
Durante el proceso de decoloración con
alcohol-acetona, la gruesa pared celular de
los Gram+ impide la salida del colorante
manteniendo la coloración violeta

7. Pared de bacterias.

8. MATERIALES

9. Materiales
Asa de siembra.
Portaobjetos y cubreobjetos.
Muestras de bacterias (yogur, sarro dental
etc. Sirven las usadas en la práctica del
cultivo)
Cristalizador.
Agitadores de vidrio u otro tipo de soporte.

10. Materiales
Frasco lavador.
Colorantes.
Violeta de genciana o cristal de violeta.
Safranina o fucsia básica.
Alcohol o mezcla alcohol-acetona.
Lugol.
Microscopio.
Aceite de inmersión.

11. Objetivo de inmersión
Es un objetivo del microscopio de 100
aumentos que se pone casi en contacto con
la muestra, sumerjido en una gota de aceite
que hemos puesto sobre el cubreobjetos.

12. MECANISMO

13. Mecanismo
Se ralizarán varios frotis en distintos
portaobjetos con diferentes muestras de los
cultivos que preparamos en la práctica
anterior.
Todo lo descrito a continuación, se hará
para las distintas muestras.

14. Fijación de frotis
Esterilizar al mechero un asa de siembra y esperar
a que enfríe un poco.
Tomar con el asa un poco de la muestra.
Extender la muestra con el asa sobre una gota de
agua en un portaobjetos realizando una espiral en
el centro.
Esperar a que seque al aire libre o ayudarse del
mechero teniendo en cuenta que el calor no debe
ser directo.
Se pasará el portaobjetos sobre la llama con
movimientos de vaivén.
Nunca se calentará tanto que no se pueda poner

15. Tinción y enjuague
Una vez seco, se echan sobre el frotis 3 o 4
gotas de violeta de genciana o cristal de violeta
y se deja actuar durante un minuto (algo más
si la temperatura es muy inferior a 23 grados)
Deberá reposar sobre un recipiente sujeto por
rejilla o agitadores de vidrio.
Transcurrido el tiempo, se debe lavar la
lámina al grifo o con frasco lavador.
El agua debe caer desde arriba suavemente en
chorro fino, nunca directamente sobre la
muestra.

16. Tinción y enjuague
Reposo durante un minuto Lavado con vaso lavador

17. Mordiente y
decoloración
Ahora se aplica como mordiente lugol
durante 1 minuto.
El mordiente es cualquier sustancia que
forme con el colorante un compuesto
insoluble y determine su fijación a las
bacterias.
Se usa Lugol que es yodo (I2) en equilibrio
con KI (yoduro potásico) El I2 entra en las
células y forma un complejo insoluble con el
azul de genciana o el cristal de violeta.

18. Mordiente y
decoloraciónSi ahora se observaran al microscopio, con
aceite de inmersión, se verán todas las
células azules, tanto las Gram+ como las
Gram-.
Pasado el minuto, se decolora el frotis con
alcohol o una mezcla de alcohol-acetona,
con cuidado, dejándolo escurrir sobre la
muestra hasta que el líquido escurra
transparente, sin color azul.

19. Decoloración
Algunos organismos (los Gram+) no se
decoloran, mientras que otros (los Gram-)
lo hacen.
En bacterias Gram-, la mezcla de
alcohol/acetona (que es un disolvente
lipídico) disuelve la membrana exterior de
la pared de la célula (y también puede
dañar la membrana citoplasmática a la que
se une el fino Peptidoglicano).
La delgada capa de Peptidoglicano es

20. Decoloración
Las células Gram+, a causa de sus paredes
celulares más espesas (tienen más
Peptidoglicano y menos lípido), son
impermeables al disolvente ya que éste
deshidrata la pared celular y cierra los
poros, disminuyendo así el espacio entre las
moléculas y provocando que el de complejo
cristal violeta-yodo quede atrapado dentro
de la pared celular.
Después de la decoloración las células

21. Lavado y tinción de
contraste
Ahora vamos a hacer una tinción de
contraste con un colorante rojo
(safranina o fucsina) para poder
observar todas las bacterias a la vez.
Recordemos que las Gram – nos han
quedado incoloras y no las podemos
ver.

22. Lavado y tinción de
contraste
Se lava con agua para quitar los restos de
alcohol.
Se deja secar el porta al aire libre.
Ahora se procede a la tinción de contraste
utilizando, por ejemplo safranina o fucsina
básica y se deja actuar durante un minuto.
Pasado el minuto, se enjuaga el porta con
agua con el mismo método que la vez
anterior.
Se deja escurrir el agua y se seca al aire.

23. Observación.
Se coge la muestra y se pone encima un
cubreobjetos.
Se le echa por encima una gota de aceite
de inmersión.
Se observa con el microscopio de 100
aumentos, con cuidado de que no lo
acerquemos demasiado al cubre y lo
rompamos.
Veremos que las bacterias Gram+

24. Gram+

25. Cocos Gram+ y bacilos
Gram-

26. Gram-

27. El cristal violeta
penetra en todas
las células
bacterianas a
través de la pared
bacteriana.
El Lugol actúa de
mordiente, haciendo que
el cristal violeta se fije
con mayor intensidad a
la pared de la célula
bacteriana. El I2 entra en
las células y forma un
complejo insoluble en
solución acuosa con el
cristal violeta.
Alcohol-acetona, sirve
para realizar la
decoloración, ya que en
la misma es soluble el
complejo I2/cristal
violeta. Los organismos
Gram positivos no se
decoloran, mientras que
los Gram negativos sí lo
hacen.
Para poner de
manifiesto las células
Gram negativas se
utiliza una coloración
de contraste.
Habitualmente es un
colorante de color
rojo, como la
Safranina o la Fucsina.
Explicación

28. Factores que considerar
en la tinción de Gram
No se debe sobrepasar los tiempos de tinción
y decoloración.
Los cultivos viejos hacen que las bacterias
Gram+ se tiñan parcial o totalmente de color
rosa.
Hay que tomar en cuenta que el agua usada
en el frotis se encuentre en el rango de Ph 7-
7.8 ya que:
Los Gram+ pueden hacerse Gram- al aumentar
la acidez.