LA CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN CAPAO DE PIMIENTA PARA RESPUESTA DE DEFENSA DE LA HOJA EN SENESCENCIA INDUCIDA POR SAL.

1. Construyendo la excelencia
Programa Ingeniería Agronómica
Extensión Facatativá

2. Docente:
Jennifer Gutiérrez
Estudiantes :
Lina Martinez
Biología molecular
Quinto semestre
Universidad De Cundinamarca
Facatativá
2015

3. LA CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN CAPAO
DE PIMIENTA PARA RESPUESTA DE DEFENSA DE LA
HOJA EN SENESCENCIA INDUCIDA POR SAL.
Recibido: 22 de abril 2015
Aceptado: 06 de octubre 2015
Publicado: 24 de octubre 2015
PUBLICADO POR: Huai-Juan
Xiao, Ke-Ke Liu, Da-Wei
Li, Mohamed Hamed Arisha, Wei-
Guo Chai and Zhen-Hui Gong
PAGINA: BMC Biotecnología
2015, 15: 100 doi: 10.1186 /
s12896-015-0213-1
LINK: http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/100

4. ABREVIATURAS
ABA: ácido abscísico
pb: par de bases (s)
DRE: elementos sensibles Dehydration-
EST: Expresado secuencia de etiqueta
FCC: clorofila fluorescente catabolito
MDA: malondialdehído
MeJA: metil jasmonato
MW: Peso Molecular
NaCl: cloruro de sodio
ORF: marco abierto de lectura
PAO: feofórbido una oxigenasa
Pi: punto isoeléctrico
QRT-PCR: PCR cuantitativa en tiempo real
CARRERA: La rápida amplificación de cDNA extremos
SA: El ácido salicílico
TRV: virus del cascabel del tabaco
UTR: región sin traducir
VIGS: inducida por Virus-silenciamiento génico
WT: Tipo Wild-

5. RESUMEN
Feofórbido una oxigenasa (PAO) es una enzima importante en el
catabolismo de la clorofila y está involucrado en la senescencia foliar.
Estudios previos han demostrado la función de PAO durante la muerte
celular. Se utilizaron técnicas de clonación y RACE basados ​​en homología
para obtener el ADNc de longitud completa del gen Capao. La expresión
del gen se determinó mediante PCR cuantitativa en tiempo real. La función
del gen CAPAO se estudio mediante silenciamiento génico inducido por
virus y las técnicas transgénicas con plantas de tabaco (Nicotiana
tabacum).
Un gen CAPAO se aisló de pimiento (Capsicum annuum L.). El ADNc de
longitud completa CAPAO se compone de 1.838 pb, que contiene un marco
de lectura abierto de 1614 pb, y codifica una proteína de 537 amino ácidos
CAPAO expresión, según lo determinado por PCR cuantitativa en tiempo
real, fue mayor en las hojas de las raíces, tallos y flores.
La expresión de gen CAPAO fue inducida en la senescencia natural y
diversas tensiones. El gen Capao puede estar relacionado con las
respuestas de defensa a diversas tensiones y jugar un papel importante en
la hoja en senescencia por sal senescencia.

6. INTRODUCCIÓN
 Hoja senescencia es la etapa final del desarrollo de las hojas, en última
instancia conduce a la muerte de la hoja entera. Aunque también puede
ser estimulada por diversos factores ambientales, incluyendo hormonas
vegetales, la sequía, la salinidad, la temperatura extrema, la oscuridad,
las heridas y las infecciones patógenas.
 La senescencia de las hojas con el tiempo puede afectar el rendimiento
de las plantas en condiciones ambientales adversas. Por lo tanto, el
estudio de la senescencia foliar no sólo fortalecerá la comprensión de un
proceso biológico básico, también puede proporcionar métodos para
retrasar el envejecimiento planta con el fin de mejorar las características
agrícolas de cultivos de hortalizas.
 Pimiento (Capsicum annuum L.) es un cultivo vegetal importante que es
extensa cultivada en todo el mundo. En los últimos años, la senescencia
prematura de plantas de pimiento causadas por diversas tensiones
ambientales se ha convertido en un fenómeno universal y se considera
un importante campo de investigación.

7. Este estudio se realizó para clonar este gen (CAPAO) de la
planta de pimienta y analizar sus características moleculares.
METODOLOGÍA
Los patrones de expresión de
genes CAPAO en tejidos
específicos y en respuesta a
diversas tensiones se analizaron
por PCR cuantitativa en tiempo
real.
El silenciamiento génico inducido
por virus (VIGS) y las tecnologías
transgénicas se utilizaron para
estudiar la función de genes
Capao.

8. La pérdida del color verde, inducida por la
degradación de la clorofila, es el síntoma más
visible de la senescencia foliar.
El tabaco (Nicotiana tabacum) es una de las plantas modelo
más importantes para la investigación transgénica. En
estudios anteriores, muchos nuevos genes de otras plantas
se han transferido en tabaco para futuras investigaciones en
sus funciones .
Feofórbido una oxigenasa (PAO) se ha considerado como
una enzima crucial en la degradación de la clorofila. El gen
PAO se obtuvo inicialmente a partir de maíz (designado
ZmLls1) y luego demostraron que la expresión de PAO es
inducida por senescencia natural y las tensiones
ambientales en las plantas.

9. Los resultados sugieren que Capao puede
desempeñar un papel importante durante la
senescencia foliar y la degradación de la
clorofila.
RESULTADOS
Clonación y Análisis de la secuencia de Capao
El ADNc de longitud completa designado Capao se obtuvo
utilizando las técnicas de clonación in silico y RACE. La
transcripción consiste en 1838 nucleótidos, que incluye una región
5 'no traducida (UTR) de 32 pb, un ORF de 1614 pb y un 3'-UTR
de 192 pb.
CAPAO se predijo para codificar una proteína de 537 amino ácidos
con un peso molecular teórico (PM) de 60,8 kDa y un punto
isoeléctrico calculado (pI) de 6,89. El análisis estructural reveló que
CAPAO pertenece a una superfamilia de hierro-azufre.

10. Un árbol filogenético, construido usando software MEGA5.05, se utilizó para
investigar la relación evolutiva de la secuencia de aminoácidos con las
proteínas CAPAO PAO de otras plantas. Se formaron dos grupos utilizando
los 14 PAO secuencias de proteínas de C. annuum L., N. tabacum, S.
lycopersicum, R. communis, V. vinifera, B. napus, A. thaliana, Medicago
truncatula, Aegilops tauschi, Pisum sativum y Brassica rapa var. parachinensis
. Capao agrupado en el primer grupo, que incluía SlLLS1, NtPAO, BoPAO,
BrPAO y AtPAO. Capao estaba más estrechamente relacionado con SlLLS1,
NtPAO que las proteínas PAO de otras plantas.

11. Expresión específica de tejido de Capao
Con el fin de investigar los niveles de expresión del gen Capao en diferentes
tejidos, el ARN total fue extraído de las raíces, tallos, hojas y flores, y en
tiempo real PCR cuantitativa (QRT-PCR) se realizó. Se detectaron las
transcripciones CAPAO en todos estos tejidos y se encontró que es mayor en
las hojas que en otros tejidos. Para diferentes etapas de desarrollo de las
hojas, se detectó un bajo nivel de Capao en las hojas jóvenes y totalmente
maduros, pero la expresión Capao se incrementó en hojas senescentes.

12. La inducción de moléculas de señalización, estreses abióticos y bióticos
Con el fin de estudiar su función en las plantas de pimiento, se analizó primero el
patrón de expresión de Capao. Cultivar las plantas de semillero B12 en la etapa de
seis hojas se trataron con diversas tensiones, incluyendo fitohormonas, sal,
osmosis y Phytophthora (infección) y se analizaron mediante RT-PCR.
Las plantas de pimiento fueron
expuestas a 400 mM de cloruro de
sodio (NaCl) y manitol 400 mM, y
luego la abundancia de las
transcripciones CAPAO se analizó
por RT-PCR cuantitativa.
El nivel de expresión CAPAO en las
plantas tratadas con NaCl 400 mM
comenzó a aumentar gradualmente
en 4 h y alcanzó su punto máximo
(11,9 veces) a las 24 h, en
comparación con el control (0 h
Con el tratamiento osmótico, CAPAO se
indujo rápidamente en plantas de
pimiento, con un aumento de 3,4 veces
en la expresión en 2 h y una elevación
10,7 veces más fuerte en 12 h.
La transcripción nivel
más alto se detectó a
las 24 h (18,7 veces).

13. Estos resultados indican que el aumento de la abundancia del transcrito
del gen CAPAO puede ser parte de la respuesta al estrés abiótico,
incluyendo alta salinidad y estrés osmótico.

14. Ensayo de VIGS de Capao de genes en plantas de pimiento
Silenciando eficiencia del gen Capao
Los resultados mostraron que CAPAO participa en la vía de degradación de la
clorofila y está implicado en la respuesta a varios tipos de estrés en plantas de
pimiento. Para examinar más a fondo la función de Capao de pimienta, se utilizo un
virus sonajero tabaco (TRV) basado VIGS. Las plantas de pimiento inoculadas con
Agrobacterium durante 6-7 semanas se utilizaron para los siguientes tratamientos.
Un vector vacío se aplicó a plantas
(TRV2: 00) como control negativo.
TRV2: plantas CaPDS, fue silenciada en
el gen de la fitoeno desaturasa
endógena (PDS) para causar
photobleaching, se utilizaron como
controles positivos para probar la
eficiencia VIGS.
Tres semanas después de la inoculación
de Agrobacterium, se encontró que la
mayoría de las plantas mostraron
claramente síntomas de la infección viral.
Estos resultados indicaron que
VIGS se aplicó con éxito en este
experimento. Como se muestra
en la Fig. 5a, no se observó
diferencia morfológica entre las
plantas silenciadas-Capao (TRV2:
Capao) y las plantas de control
tratadas vector vacío (TRV2: 00)
45 d después de la inoculación

15. Al mismo tiempo, los niveles de transcripción Capao en plantas vacías de control
de vectores (TRV2: 00) y plantas silenciadas-Capao (TRV2: Capao) fueron
examinados por RT-PCR cuantitativa para detectar la eficacia de Capao
silenciamiento génico por VIGS.
Los resultados mostraron que el nivel
transcripcional CAPAO se redujo
notablemente en las plantas
silenciadas-CAPAO comparación con
el control del vector vacío, lo que
demostró que el silenciamiento
génico fue exitosa.

16. El fenotipo de las plantas transgénicas de tabaco después del tratamiento estrés
salino
Antes del tratamiento de estrés salino, no hubo diferencias fenotípicas entre
CAPAO plantas transgénicas y WT. En la etapa temprana del tratamiento de estrés
sal (solución de NaCl 150 mM), ambas hojas de plantas transgénicas y WT
marchitas con el grado de marchitamiento más grave en las plantas WT.
Junto con el momento del tratamiento,
la parte inferior de las hojas se volvió
amarilla.
Después del tratamiento de sal para 7 d,
las hojas de las plantas transgénicas se
volvió amarilla y el borde de las hojas
inferiores mostraron síntomas necróticos
después del tratamiento estrés salino,
mientras que las hojas jóvenes superiores
eran verdes.

17. Sin embargo, las hojas de las plantas WT parecían
encogerse, las hojas más bajas quedaban de color amarillo,
y las hojas superiores de color verde.

18. CONCLUSIONES
•En general, se concluye que CAPAO juega un papel importante
en la senescencia y la degradación de la clorofila, así como las
respuestas de defensa a diversas tensiones.
•Capao fue inducida en la senescencia natural y diversas
tensiones.
•Silencio de Capao dio lugar a un fenotipo de estancia verde en
plantas de pimiento, y la sobreexpresión de Capao aceleró el
proceso de la hoja inducida por sal senescencia.
•En el futuro, las plantas transgénicas sobre la sobreexpresión o
desmontables de genes Capao en pimiento se utilizarían para el
estudio de la función de detalle de Capao.