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1. CARNES Y PRODUCTOS DERIVADOS – REQUISITOS MICROBIOLÓGICOS
Norma boliviana
Esta norma establece las especificaciones microbiológicas para carnes frescas de
bovino, ovino, caprino, camélido, porcino, equinos, bubalinos, aves y otros, y sus
productos derivados.
Los criterios microbiológicos en esta norma están establecidos sobre
determinaciones de microorganismos indicadores de contaminación y la
determinación de patógenos (Salmonella, Escherichia coli H7 O157, Clostridium
perfringens).
Referencias
Las normas bolivianas contienen disposiciones que al ser citadas en el texto,
constituyen requisitos de la norma. Como toda norma está sujeta a revisión, se
recomienda, a aquellas que realicen acuerdos en base a ellas, que analicen la
conveniencia de usar las ediciones más recientes de las normas bolivianas citadas.
NB 320001: Técnicas de muestreo de alimentos para análisis microbiológico
(tercera revisión).
NB 32003: ensayos microbiológicos- recuento total de bacterias mesófilas viables
(segunda revisión).
NB 32004: Ensayos microbiológicos – staphylococcus aureus (primera revisión)
(anula y reemplaza a la norma NB656: 1995).
NB 32016: recuento de aerobios mesofilos en alimentos- película seca rehidratante
– método de recuento de aerobios mesófilos y coliformes en placa petrifilm.
NB 32020: ensayos microbiológicos- recuento de coliformes y Escherichia coli en
alimentos- película seca rehidratante (método petrifilm).
NB 310013: carnes y derivados – carne de aves-requisitos microbiológicos (primera
revisión) (anula y reemplaza a la norma 905:2000).
NB 310014: carne – definiciones.
NB/ISO 6579: Microbiologia de los alimentos para consumo humano y alimentación
animal - método horizontal para la detección de salmonella spp (correspondiente a
la norma ISO 6579:2002) (anula y reemplaza a la norma NB 320:2003).

2. REQUISITOS MOCROBIOLOGICOS
Los requisitos microbiológicos están dados en las siguientes tablas.
Tabla1- Carne roja fresca, refrigerada y/o congelada
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Aerobios
mesófilos
(ufc/g)
5 3 1x105 1x106 NB 32003 o
NB 32016
(AOAC
990.12) (**)
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Escherichia coli
(ufc/g)
5 2 1x102 1x103 NB 32020
(AOAC
991.14) (**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 2 1x103 1x104 NB 32004 (**)
Tabla 2- Carnes crudas molidas
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Aerobios
mesófilos
(ufc/g)
5 3 1x106 1x107 NB 32003 o
NB 32016
(AOAC
990.12) (**)
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Escherichia coli
(ufc/g)
5 2 1x102 1x103 NB 32020
(AOAC
991.14) (**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 2 1x103 1x104 NB 32004
(**)
Tabla 3- Carnes crudas picadas y recortes (Trmming)

3. requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Aerobios
mesófilos
(ufc/g)
5 3 1x105 1x106 NB 32003 o
NB 32016
(AOAC
990.12) (**)
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Escherichia coli
(ufc/g)
5 2 1x102 1x103 NB 32020
(AOAC
991.14) (**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 2 1x103 1x104 NB 32004
(**)
Tabla 4- Carne mecánicamente separada
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Aerobios
mesófilos
(ufc/g)
5 3 1x106 1x107 NB 32003 o
NB 32016
(AOAC
990.12) (**)
Salmonella sp
(en 25g)
5 1 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Escherichia coli
(ufc/g)
5 3 1x103 1x104 NB 32020
(AOAC
991.14) (**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 2 1x103 1x104 NB 32004
(**)

4. Tabla 5- Productos cárnicos crudos, que requieren cocción para su consumo
(hamburguesas, milanesas, chorizos, albóndigas, silpanchos, nugget, etc.)
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Escherichia coli
(ufc/g)
5 2 1x102 1x103 NB 32020
(AOAC
991.14) (**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 2 1x103 1x104 NB 32004
(**)
Tabla 6- Productos cárnicos cocidos embutidos (jamón, mortadela,
salchicha, queso de cerdo, paté, chorizo ahumado, etc.)
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Aerobios
mesófilos
(ufc/g)
5 2 1x105 1x105 NB 32003 o
NB 32016
(AOAC
990.12) (**)
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Escherichia coli
(ufc/g)
5 1 1x10 1x102 NB 32020
(AOAC
991.14) (**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 1 1x10 1x102 NB 32004
(**)

5. Tabla 7- Productos cárnicos fermentados (salame, chorizos, salchichones,
pepperoni, etc.)
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 2 1x102 1x103 NB 32004
(**)
Tabla 8- Productos cárnicos madurados (jamón, bondiola, chorizos, etc.)
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 2 1x102 1x103 NB 32004
(**)
Tabla 9- Productos cárnicos cocidos no embutidos (costilla, nudo, panceta,
pernil, colitas ahumadas, lomito, chuleta de cerdo, etc.)
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Aerobios
mesófilos
(ufc/g)
5 2 1x105 1x105 NB 32003 o
NB 32016
(AOAC
990.12) (**)
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO 6579
(**)
Escherichia coli
(ufc/g)
5 1 1x10 1x102 NB 32020
(AOAC
991.14) (**)

6. Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 1 1x10 1x102 NB 32004
(**)
Tabla 10- Productos cárnicos precocidos (nugget, milanesa, chorizo, etc.)
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Aerobios
mesófilos
(ufc/g)
5 3 1x105 1x106 NB 32003
o NB
32016
(AOAC
990.12)
(**)
Salmonella sp
(en 25g)
5 0 ausencia ausencia NB/ISO
6579 (**)
Escherichia coli
(ufc/g)
5 2 1x102 1x103 NB 32020
(AOAC
991.14)
(**)
Staphylococcus
aureus (ufc/g)
5 2 1x102 1x103 NB 32004
(**)
Tabla 11- Productos cárnicos enlatados (salchichas, paté, picadillo,
viandada, etc.)
requisito n c m M Método de
ensayo
sugerido
Aerobios
mesófilas
(ufc/g)
5 0 0 0 NB 32003
o NB
32016
(AOAC
990.12)
(**)
(*) Previa incubación del producto sin abrir a 35o C durante 10 días.
(**) U otro método validado o con reconocimiento internacional.

7. Donde:
n= número de unidades de muestras a ser examinadas.
c= número máximo de unidades de muestra que puede contener un número de
microorganismos comprendidos entre “m” y “M” para que el alimento sea aceptable
de la rechazable y en un plan de dos clases, separa la calidad aceptable de la
marginalmente aceptable.
m= limite microbiológico que, en un plan de tres clases, separa la calidad aceptable
de la marginalmente aceptable.
M= limite microbiológico, que en un plan de tres clases separa la calidad
marginalmente aceptable de la rechazable.
Aerobios mesófilos
Son todas aquellas bacterias aerobias o anaerobias facultativas, mesófilas o
psicrófilas capaces de crecer en agar nutritivo. Se investigan por el método de
recuento en placa con siembra en profundidad, que se basa en contar el número de
colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo solido (Agar para recuento
en placa o PCA), donde se ha sembrado un volumen conocido de la solución madre
o sus disoluciones (1ml), incubadas a 37 oC durante 24 horas.
Se deben contar todas las colonias desarrolladas en cada placa.
Salmonella
Crece con facilidad en agar sangre formando colonias de 2 a 3 milímetros. En
laboratorios de microbiología clínica se aísla con medios selectivos —Selenito,
Hektoen, SS o XLD— para inhibir el crecimiento de otras bacterias patógenas y de
la flora intestinal saprófita. Tienen los siguientes antígenos:
 Somático O, del lipopolisacárido en la pared celular, termoestable y es la
base de la clasificación en subgrupos.
 Flagelar H, de la proteína flagelina, termolábil, es la base de la clasificación
de especies.
 Envoltura Vi, termolábil, responsable de la virulencia de varias especies
patogénicas.
Agar Salmonella – Shigella: Se utiliza para aislar bacterias lactosa negativa como
Salmonella y Shigella. Especiesde la familia Enterobacteriaceae lactosa – positivas,
como Escherichia coli, presentan colonias rosadas en este tipo de medio.

8. Agar Tergitol 7: Este medio permite diferenciar especies fermentadoras de la lactosa
de las especies no fermentadoras. En este medio Escherichia coli presenta colonias
amarillas.
Agar MacConkey: Al igual que el anterior separa las bacterias fermentadoras de la
lactosa. Escherichia coli produce colonias rosadas.
Agar Eosina – Azul de Metileno (EMB) de Levine: Permite la diferenciación de
especies fermentadoras de la lactosa. Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli
presentan colonias que varían del púrpura a verde metálico.
Escherichia coli
Pruebas Bioquímicas son la forma más convincente del diagnóstico de las
enfermedades infecciosas, mediante este proceso se determinan el género y las
especies bacterianas de interés. Cada tipo bacteriano tiene un cuadro de reacciones
específicas donde se comprueba el resultado de las reacciones y son la base de la
identificación de los diferentes agentes bacterianos. En general para la identificación
de enterobacterias se sugiere realizar las siguientes pruebas:
 Agar TSI: Es un medio de cultivo diferencial basado en la capacidad de los
bacilos gram negativos de fermentar carbohidratos, de producir H2S y
producir gas.
 Se observa en el tubo el pico y el fondo ácido, hay 1% de positividad
para la producción de H2S en cepas de E. coli.
 Prueba de orto-nitrofenil-β-galactopiranósido (ONPG): Esta prueba
detecta la producción de la enzima β-galactosidasa y permite diferenciar
organismos de lenta utilización de la lactosa de aquellos que no la utilizan.
La enzima β-galactosidasa es codificada por el gen lacZ del operón lactosa,
el cual es inducido en presencia de lactosa y ausencia de glucosa. Por lo
tanto, se requiere que las bacterias hayan sido crecidas en un medio con
lactosa como el Agar TSI o el Agar MacConkey.
 E. coli es positiva para esta prueba
 Prueba de movilidad: Esta prueba determina la movilidad de los bacilos
fermentadores.
 95% de positividad para cepas de E. coli.
 Prueba de gelatinasa: Determina la producción de la enzima gelatinasa, la
cual produce la hidrólisis de la gelatina.
 E. coli es negativa para esta prueba

9.  Prueba de rojo de metilo (RM): Identifica especies de bacterias que
producen ácidos a partir de glucosa.
 99% de positividad para cepas de E. coli.
 Prueba de Voges – Proskauer (VP): En esta prueba se detecta la
producción de acetil-metilcarbinol (acetoína), el cual se convierte a diacetilo
en presencia de KOH y O2 atmosférico. El diacetilo es convertido
posteriormente en un complejo rojo en presencia de α-naftol y creatinina. La
producción de acetoína es una vía alternativa del metabolismo del ácido
pirúvico, donde se producen cantidades pequeñas de ácidos mixtos que
pueden ser insuficientes para dar una prueba RM positiva. Por este motivo,
la mayoría de las especies de la familia Enterobacteriaceae son VP positivo
y RM negativo y viceversa.
 esta prueba es negativa para cepas de E. coli.
 Prueba de fenilalanina desaminasa: La determinación de la enzima
fenilalanina desaminasa es útil para diferenciar inicialmente a las especies
de: Proteus, Morganella y Providencia de otros bacilos gram negativos.
 0% de positividad para cepas de E. coli.
 Producciónde descarboxilasas y dehidrolasas de aminoácidos: Muchas
especies bacterianas poseen enzimas que tienen la capacidad de
descarboxilar o de hidrolizar aminoácidos específicos entre ellos la arginina,
lisina, ornitina en pruebas específicas, liberando animas de reacción alcalina
y CO2.
 17% de positividad para Arginina.
 90% de positividad para Lisina.
 65% de positividad para Ornitina.
 Prueba de Ureasa: Los microorganismos que hidrolizan la urea a través de
la enzima ureasa, liberan amoníaco lo cual produce un cambio de color rojo
en el medio. El agar urea de Christensen permite la detección de menores
cantidades de amoníaco para aquellos microorganismos que producen
menores cantidades de ureasa se evalúan con este método.
 1% de positividad para esta prueba en E. coli.
 Producción de Indol: El indol es uno de los productos de la degradación del
aminoácido triptofano. Para su detección la bacteria es cultivada en caldo
triptona y posteriormente se utiliza el reactivo de Ehrlich, el cual es más
sensible que el reactivo de Kovacs cuando se estudian bacilos no
fermentadores o anaerobios cuya producción de indol es mínima.

10.  98% de positividad para esta prueba en E. coli.
 Utilización de citrato: Esta prueba determina la capacidad de un
microorganismo de utilizar el citrato de sodio como única fuente de carbono
para el metabolismo y crecimiento.
 1% de positividad para cepas de E. coli.
 Utilización de malonato: Esta prueba determina la capacidad de algunas
bacterias de utilizar el malonato como fuente de carbono y energía.
 95% de positividad para cepas de E. coli.
 Prueba de reducción de nitratos: Determina la capacidad de reducir el
nitrato a nitrito o gas. Es útil en la identificación de la familia
Enterobacteriaceae y en la diferenciación de especies de muchos otros
grupos de microorganismos.
 E. coli es negativa para esta prueba
 Prueba de fermentación de carbohidratos: Se recomienda el uso del caldo
de base púrpura de bromocresol conteniendo un determinado sustrato a una
concentración del 1% para la determinación de la fermentación de
carbohidratos y alcoholes para especies de la familia Enterobacteriaceae.
 D-Sorbitol 94% de positividad.
 Lactosa 95% de positividad.
 Sacarosa 50% de positividad.
 D-Manitol 98% de positividad.
 D-Adonitol 5% de positividad.
 L-Arabinosa 99% de positividad.
 Maltosa 96% de positividad.

11. Staphylococcus aureus
Cultivo
Cultivo de estafilococos en agar-sal-manitol (o chapmanes) que muestra colonias
de S.aureus (sección amarilla/dorada).
Los estafilococos crecen rápidamente en casi todos los medios bacteriológicos bajo
condiciones aerobias o microaerofílicas. Las muestras clínicas principalmente se
cultivan en medios de agar enriquecidos con sangre de carnero. Cuando se trata de
una muestra contaminada, debe ser inoculada primero en agar Columbia
adicionado con clistín y ácido nalidíxico o alcohol fenil-etílico
Tiempo de cultivo en Sal-manitol
24 h Recomendado para los cultivos de muestras no contaminadas
24-
48 h
Usado en cultivos mixtos/contaminados. Recomendado para conseguir
colonias de tamaño adecuado para microscopía y pruebas.
72 h Puede ser necesaria para aumentar la sensibilidad de las pruebas.
Los Medios diferenciales para S.aureus son el medio manitol-salino o Chapman y
el medio Baird-Parker. Entre los medios diferenciales comerciales se encuentran
CHROMagar Staph aureus (Sensibilidad epidemiológica: 96,8%, 20 horas de
incubación), tiñe las colonias de color malva y S. aureus ID agar (Sensibilidad
epidemiológica: 91,1%, 20 horas de incubación), que tiñe las colonias de color
verde. Estos medios comerciales verifican la presencia de α-glucosidasa dirante el
desarrollo (las colonias de S.aureus coaglulasa negativos crecen en color azul,
blanco o beige). Su temperatura óptima de crecimiento va de 35 a 40 °C y el pH
óptimo oscila entre 7,0 y 7,5 aunque soportan pH mucho más extremos. Soportan
tasas elevadas de cloruro sódico, hasta un 15%.
Ácido-Glicerol-Eritromicina

12. Esta prueba utiliza un medio que contenga glicerol (1%), eritromicina (0,4 mcg/ml)
y púrpura de bromocresol como indicador. Los cultivos se incuban durante 3 días y
se clasifica como positiva si el medio se vuelve ácido. Los estafilococos producen
ácido, los micrococos, no.
Pruebas de suceptibilidad
Antibiograma para S. aureus.
Estas pruebas determinan el crecimiento de una bacteria bajo la presencia de
ciertos inhibidores. Puede realizarse de varias maneras, una de las más difundidas,
la inclusión de discos en los cultivos. Estos discos liberan el antibiótico solo a una
distancia corta por lo que se notará la falta de crecimiento bacteriano en la periferia
del disco en caso de ser susceptible a tal antibiótico.
Staphylococcus aureus es sensible a furazolidona (disco 100 mcg) y resistente
a bacitracina (0,04 unidades de bacitracina. Los estreptococos β-hemolíticos del
grupo A son susceptibles)
Pruebas bioquímicas
Entre las pruebas bioquímicas encontramos:
Coagulasa
La prueba de la coagulasa es sencilla y tiene una especificidad muy alta. La prueba
se puede realizar con un cultivo o en tubo y consiste en la búsqueda del factor de
aglutinación. Se lleva a cabo con la administración de S. aureus a plasma de conejo
con EDTA, al cabo de unas horas podrá verse la formación de un coagulo (prueba
positiva). Puede usarse la aglutinación en látex y la Hemaglutinación pasiva como
medio alternativo para detectar el factor de agregación.
Desoxirribonucleasa (DNasa)

13. Como se mencionó, S. aureus produce DNasa termoestable que es detectable en
el medio de prueba del mismo nombre. Su uso es principalmente como confirmación
diagnóstica.
Catalasa
Los estafilococos y los micrococos se diferencian de los estreptococos y los
enterococos por esta prueba. Esta prueba detecta la presencia de enzimas-
citocromo oxidasa. La prueba se realiza agregando una gota de peróxido de
hidrógeno (3% vol) sobre la muestra en un portaobjetos de vidrio. Es positiva si se
observa un burbujeo intenso. Entre la causa más frecuente de falsos positivos se
encuentra el realizarla en un medio que contenga sangre (los eritrocitos pueden
causar burbujeo) y la presencia de pseudocatalasa en algunas cepas
estafilocócicas.
Sensibilidad a la lisostafina
Esta prueba mide la facilidad con la que los microorganismos estafilocócicos se lisan
en presencia de lisostafina. Lisostafina es una endopeptidasa que rompe los
puentes de entrecruzamiento de glicina en el peptidoglucano.
Entre las bacterias de lisis rápida y marcada encontramos: S. aureus, S.
simulans, S.cohnii y S. xylosus; y las de lisis lenta o insensibles: S. hominis, S.
saprophyticus y S. haemoliticus.
Oxidasa
Esta prueba es rápida, se usan discos de papel filtro con tetrametil-p-fenilendiamina
como reactivo y DMSO para hacer permeables a las bacterias al reactivo. La prueba
se basa en que evidenciar la reacción de óxido-reducción y se torna violeta a los 30
segundos cuando es positiva. Staphylococcus aureus, y la mayoría de las especies
del mismo género son oxidasa-negativos.
Enzimoinmunoanálisis
Estas pruebas buscan la presencia de proteínas específicas de S. aureus, la
mayoría de ellas busca a la proteína A y la β-N-acetilglucosaminidasa. La
sensibilidad y especificidadde este estudio, en cultivos no contaminados es cercana
al 100%.