Clase 7 diagnostico directo de las micosis 2015

1. Dr William Vega E.

2. Recolección de las muestras en las mejores condiciones de
esterilidad
Debe ser tomada en cantidad suficiente dependiente del sitio
de la lesión (heridas, esputos, lavados bronquiales,
secreciones, escamas etc.) y calidad.
Conocer la hora de obtención,
Medios de transporte (sv /u , ótica),
Tiempo de transporte al laboratorio, etc.
Uso de medios de cultivos directos (ulcera corneales)

3. La microscopía directa es una herramienta antigua y útil del
micólogo clínico.
La microscópia directa orienta la técnica de cultivo: medios,
temperatura, tiempo de incubación, precauciones especiales
de bioseguridad
La microscópia directa, puede establecer una orientación
diagnóstica presuntiva, y en ocasiones definitiva.
Los hongos tardan en desarrollar las estructuras conidiógenas.
Una muestra clínica correctamente tomada es el medio más
simple y rápido de detectar una infección fúngica.
Su negatividad interpreta los aislamientos como
contaminantes.

4. La escasez de la muestra es, la única razón para no efectuar la
observación microscópica directa.
En pocos minutos informar al clínico y permite el inicio temprano
de una terapia antifúngica,
Es uno de los factores esenciales en el pronóstico de las micosis
en los inmunodeprimidos.
En algunos casos, el diagnóstico microscópico puede ser la única
evidencia de infección fúngica
Detecta patógenos enigmáticos no cultivables
Rhinosporidium seeberi,
Lacazia loboi,
Pneumocystis jirovecii.

5.  El examen microscópico directo proporciona un diagnóstico
definitivo si se observan elementos fúngicos patognomónicos:
 cápsula de Cryptococcus neoformans,
 células muriformes en cromoblastomicosis,
 levaduras pequeñas intracelulares de H. capsulatum,
 quistes típicos de Pneumocystis jiroveci,
 levaduras con brotes de base ancha de B. dermatitidis
 levaduras con gemación multipolar en rueda de timón de
Paracoccidiodes brasiliensis
 esférulas de Coccidiodes immitis
 hifas anchas no septadas de zygomicetos

6.  • Un examen directo negativo nunca descarta una
 infección fúngica.
 La sensibilidad de la técnica puede estar entre 10³-105
elementos fúngicos
por ml y puede depender del lugar anatómico, tipo de paciente, tinción y
experiencia del observador.
 • La presencia de falsos positivos: (gotas de grasa, restos celulares, etc.),
puede minimizarse con un segundo examen o con la experiencia del
observador.
 • Posee una relativamente baja sensibilidad diagnóstica.
 • En la mayoría de los casos, no es posible identificar la especie fúngica.
 • No permite la realización de estudios de sensibilidad a los antifúngicos.

7. TÉCNICAS DIAGNÓSTICASTÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

8. Observación microscópica directo (OMD)
Entre lamina y laminilla,
Solo la muestra
KOH al 20%,
Calcoflúor,
Tinta china,
Tinta Parker, etc.
Profesional capacitado

9.  En fresco
 KOH
 KOH + Tinta Parker negra
 KOH + blanco calcofluor
 Tinta china (Cryptococcus neoformans)

10.  Tinciones
 KOH + Tinta Parker negra, KOH + blanco calcofluor (uso
general)
 Giemsa o wrigth: micetoma, histoplasmosis,
coccidioidomicosis, neumocitosis, , otras micosis
cutáneas con exudado o pus
 Azul de Toluidina O: neumocistosis
 PAS: micetoma, coccidioidomicosis, onicomicosis
 Grocott: neumocistosis
 Fontana Masson: neumocistosis
 Inmunofluorescencia: neumocistosis

11.  a. Células, con o sin gemas, de varios tamaños y formas, posiblemente
sean Candida spp. u hongos dimórficos.
 b. Células de pared gruesa, generalmente con una gema de base amplia,
podrían corresponder a B. dermatitidis.
 c. Células de pared delgada con gemación múltiple rodeando a la célula
madre, sean P. brasiliensis.
 d. Células rodeadas de una cápsula grande, probablemente
 corresponden a C. neoformans.
 e. Células pequeñas, de gemación simple observadas
 en tinciones especiales, posiblemente son H. capsulatum.
 f. Células con pseudohifas: Candida spp., Geotrichum spp., o Trichosporon
spp. Las dos últimas pueden mostrar artrosporas.

12.  g. Células redondas de pared gruesa de varios tamaños, algunas de las
cuales (las más grandes) pueden contener esporas podrían tratarse de
 esférulas de: Coccidioides immitis.
 Sin embargo, Rhinosporidium seeberi también puede mostrar esférulas
grandes y endosporas.
 h. Células gemantes de paredes gruesas acompañadas
 o no de pseudohifas, pueden corresponder a Malassezia. Cuando la lesión
es característica de pitiriasis, este es el procedimiento correcto para realizar
el diagnóstico

13.  a. Hifas no septadas, de pared gruesa, algunas de las cuales pueden
mostrar ramificaciones en 90°: Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp.
 b. Hifas septadas, ramificadas, algunas en V, con o sin cabezas de
Aspergillus, posiblemente correspondan a Aspergillus spp.
 c. Hifas septadas, pigmentadas (marrones oscuras) con o sin cuerpos
esféricos, pueden pertenecer a hongos dematiáceos.
 d. Racimos de pared gruesa y oscura, con apariencia de gemas,
posiblemente pertenezcan a un agente de cromomicosis.
 e. Fragmentos de hifas con o sin levaduras probablemente correspondan a
dermatofitos o a Malassezia complex.

14. a b
c d
e

15.  Muestras de piel y anexos:
 A) Pelos
 1. Presencia de nódulos:
 a) Negros y duros: Micelio pigmentado con ascosporas fusiformes.
Piedra negra (Piedraia hortai).
 b) Blancos y blandos: Pseudomicelio artrosporado y células gemantes.
Piedra blanca (Trichosporon spp.).
 2. Ausencia de nódulos: Presencia de artroconidios según la disposición del
micelio y talla de esporas:
 a) Endotrix (Trichophyton spp.)
 b) Ectotrix (Microsporum spp. y Trichophyton spp.).

16.  B) Uñas:
 1. Pseudohifas y levaduras (Candida spp.)
 2. Hifas:
 a) Hialinas:
 • Bordes paralelos: Dermatofitos (Trichophyton spp., Microsporum
spp. y Epidermophyton spp.)
 • Bordes irregulares: No dermatofitos (Scopulariopsis spp.,
Aspergillus spp., Fusarium spp., etc.).
 b) Pigmentadas (Scytalidium spp)

17.  C) Escamas de piel
 1. Hifas cortas, curvas y acúmulos de levaduras (Malassezia spp.).
 2. Hifas hialinas: Dermatofitos.
 3. Hifas pigmentadas (Scytalidium, Exophiala werneckii).
 4. Pseudohifas y levaduras:
 a) Hialinas (Candida spp.).
 b) Pigmentadas (Exophiala werneckii).

18.  Muestras de exudados, biopsias, etc
 Hifas y pseudohifas sin levaduras
 Hifas y pseudohifas con levaduras
 Sólo estructuras redondeadas
 Células gemantes sin formar cadenas
 Células formando cadenas
 Células levaduriformes con septos en un plano
 Células levaduriformes con septos en dos planos
 Presencia de esférulas

19.  Muestras de exudados, biopsias, etc.
 1. Hifas y pseudohifas sin levaduras:
 a) Hifas con septos:
 • Hialohifomicosis: Filamentos hialinos : Aspergillus spp., Fusarium spp.,
Paecilomyces spp., Pseudoallescheria spp., etc.
 • Feohifomicosis: Micelio pigmentado : Cladosporium spp., Exophiala spp.,
Phialophora spp., etc.
 b) Hifas sin septos o muy infrecuentes:
 Zigomicetos: Absidia spp., Mucor spp., Rhizopus spp., etc.
 2. Hifas y pseudomicelio con levaduras:
 Candida spp., Trichosporon spp., Blastoschizomyces spp., etc.

20.  3. Sólo estructuras redondeadas:
 a) Células gemantes sin formar cadenas:
 • Diámetro de 2-5 μm: H. capsulatum var. capsulatum,
 • Diámetro > 5 μm:
 - Cuello estrecho entre célula madre e hija:
 Cryptococcus neoformans
 Paracoccidioides brasiliensis
 Histoplasma capsulatum var. duboisii
 - Cuello o base de gemación ancha:
 Blastomyces dermatitidis
 b) Células formando cadenas: Lacazia loboi

21.  c) Células levaduriformes con septos en un plano: Penicillium marneffei.
 d) Células levaduriformes con septos en dos planos: Con paredes
pigmentadas formando cuerpos escleróticos o
 células fumagoides (Fonsecaea spp., Cladosporium spp., Phialophora spp.,
etc.).
 e) Presencia de esférulas:
 • Con endosporas: Coccidioides immitis, Rhinosporidium seeberi. Prototheca spp.
 • Sin endosporas: Emmonsia parva.

23.  Permite clarificar todo tipo de muestras clínicas con abundantes células y
restos celulares y observar la morfología y la pigmentación fúngica.
 El efecto clarificador del KOH puede demorar desde 10 min hasta horas, en
el caso de las muestras de uñas, y puede reducirse calentando ligeramente
la preparación.
 Se suelen utilizar dos concentraciones, una más fuerte del 20-30% para
uñas, y del 10% para el resto de muestras.
 Los inconvenientes de las soluciones de KOH son:
 puede crear unos artefactos que pueden parecerse a los hongos
 el carácter corrosivo del KOH en el equipo y
 la facilidad de aparición, con el tiempo, de cristales que dificultan la
observación.

27.  La observación de filamentos con bordes paralelos y artroconidias es
altamente sugerente de una infección por dermatofitos.
 Permite iniciar un tratamiento precoz que deberá confirmarse tras conocer
los resultados del cultivo.
 La observacion de hifas tortuosas o conidios redondeados orienta hacia
mohos no dermatofitos.
 La observacion de levaduras y pseudohifas orienta a una etiología
candidiásica.
 La observacion conjuntamente de estructuras levaduriformes redondeadas
y micelios (“albóndigas con espaguetis”). Orientan al diagnóstico de
pitiriasis versicolor

29. KOH + blanco calcofluor

30.  Fluorescencia inespecífica o quimiofluorescencia, que marca de modo
general las estructuras fúngicas :
 naranja de acridina,
 rojo Congo y
 agentes blanqueantes),
 Flourescencia específica o inmunofluorescencia que permite la
identificación específica de ciertos hongos al conjugar un anticuerpo
específico (poli o monoclonal) con un fluorocromo (isocianato).

32.  Las más utilizadas son la Tinta China y la Nigrosina.
 Pone de manifiesto la cápsula de C. neoformans.
 La cápsula aparece como un halo claro y nítido en torno a una levadura
redonda contra un fondo negro.
 Puede aparecer problemas con esta tecnica cuando C. neoformans carecen
de cápsula y confundirse con numerosos artefactos:
 hematíes, burbujas de aire, leucocitos, partículas de talco y gotas de
grasa
 La cantidad de tinta no debe ser ni excesiva ni escasa, ya que, en ambos
casos, el riesgo de artefactos se incrementa.
 La técnica es muy rápida y sencilla,
 Sensibilidad es del 50% en los pacientes no-VIH y del 70-88% en los
pacientes VIH con meningitis criptocócica.

33. a b c
d e f

35. Es el método de tinción más usado en los Laboratorios de Microbiología.
No se utiliza habitualmente para la tinción de hongos.
La observación de fragmentos de hifas tabicadas Gram-negativas y
ocasionalmente ramificadas en ángulo agudo (45 º) es altamente sugestiva de
colonización del árbol respiratorio por un hongo filamentoso.
Esta técnica es poco sensible,
Se recomienda realizar una observación a menor aumento (x400) para
detectar dichos fragmentos.
Es poco específica ya que hongos filamentosos diferentes de Aspergillus
(Pseudoallescheria boydii , Fusarium spp. ,Penicillium marneffei) pueden
presentar un aspecto similar

36. Técnica que solo permite observar claramente las
levaduras del Género Candida ya que toman el
colorante Violeta fácilmente.
Otros hongos no se tiñen, por el contrario dejan un
espacio vacío que no permite diferenciar la
estructura fúngica.
Se utiliza para observar muy bien los
Actinomycetales
Siempre confirmar la identificación por cultivo en los
medios micológicos adecuados.

37.  En las candidiasis superficiales:
 levaduras,
 pseudohifas y
 filamentos.
 La infección invasora por C. albicans en preparaciones histológicas teñidas
con PAS o Plata metenamina:
 una mezcla de levaduras,
 pseudohifas e
 hifas en el tejido,
 Solo células levaduriformes sugiere C. glabrata.
 Aumenta la sensibilidad con la utilización de fluorocromos:
 Blanco de Calcoflúor,
 Blankophor P y
 Rojo Congo.

38. Histoplasma capsulatum intracelulares (macrófagos)

43. a. Levaduras encapsuladas de C.neoformans b,c,d. Levaduras
multibrotantes de P. brasiliensis.. Coloración de Grocott
a
b
c
d

52. Es sugestiva de aspergilosis en muestras respiratorias y en preparaciones
histológicas la observación de:
fragmentos de hifas paralelas,
tabicadas y ramificadas en ángulo agudo
Las muestras clínicas del tracto respiratorio más frecuentes son los
esputos
Mayor rentabilidad diagnóstica son las obtenidas mediante
fibrobroncoscopia, como el LBA

54.  El examen microscópico se utiliza para detectar las formas tróficas y quistes
de P. jirovecii habitualmente en muestras respiratorias.
 Es importante tener en cuenta que el esputo debe ser inducido.
 Incluso en el esputo inducido, muchas veces no se consigue apreciar este
microorganismo,
 Debe realizarse un lavado broncoalveolar (LBA) si se sospecha una
neumonía por P. jiroveci