El documento describe diferentes tipos de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). La PAGE no denaturante mantiene la estructura nativa de las proteínas, por lo que su movilidad depende de su carga intrínseca y peso molecular. La PAGE denaturante usa detergentes para desnaturalizar las proteínas y hacer que su movilidad dependa principalmente del peso molecular, lo que permite determinarlo mediante electroforesis comparativa con proteínas estándar. El documento también incluye detalles sobre la preparación de geles, muestras y el

1. BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas
Sobre la Electrofóresis en PAGE
PAGE no denaturante: se prepara por entrecruzamiento de monómeros de
acrilamida con el monómero bi-funcional bisacrilamida, esto conduce a la
formación de una red tridimensional (gel) que sirve como medio de soporte
para la electrofóresis.
En los geles de poliacrilamida no denaturante no se usan detergentes, por
consiguiente las proteínas conservan su conformación nativa, es decir no son
desnaturalizadas, conservan su estructura secundaria y terciaria de tal manera
que su movilidad electrofonética depende de su carga intrínseca y de su peso
molecular.
Cuando se trata de enzima éstas retiene su actividad enzimática lo cual hace
de este tipo de electrofóresis una herramienta poderosa para el análisis de iso-
enzimas tanto de origen animal como vegetal. En este caso los geles son
colocados en una solución de tinción la cual contiene sustrato, cofactores y
colorante; dejándose reaccionar hasta que aparezcan las bandas; lo cual varía
entre 10-90 minutos.
PAGE denaturante: los geles de poliacrilamida se preparan por
entrecruzamiento del monómero acrilamida con el monómero bifuncional
bisacrilamida, esto conduce a la formación del gel (soporte de la corrida).
A. Shapiro (1967) demostró que los pesos moleculares de la mayoría de las
proteínas podían determinarse midiendo la movilidad en geles de
poliacrilamida que contienen el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS);
posteriormente esta técnica fue modificada por U.K. Laemmli (1970) llegando a
ser una técnica Standard para la determinación de los pesos moleculares de
cadenas polipeptídicas. A pH neutro, en SDS 1% y 0.1 M de beta-
mercaptoetanol, la mayoría de las proteínas con cadenas múltiples ligan SDS y
se disocian; los enlaces di-sulfuros se rompen debido al beta mercaptoetanol,
la estructura secundaria se pierde y los complejos constituidos por sub-
unidades proteicas asumen una configuración al azar.
Las proteínas tratadas de esta manera se comportan como si tuvieran una
forma uniforme y una proporción masa/carga idéntica. Esto se debe a que la
cantidad do SDS ligado por unidad de peso de proteína es constante (1.4 g de
SDS/g de proteína). La carga de la proteína está determinada por el SDS
ligado en lugar de la carga intrínseca de los aminoácidos. Ya que todas las
proteínas cubierta con SDS tienen la misma proporción de masa/carga uno
esperaría que la fuerza que mueve a cada molécula proteica fuera proporcional
al número de enlaces peptidicos por molécula, ésto es, la movilidad sería
proporcional al peso molecular. Sin embargo el gel es un tamiz molécular a
través del cual cada molécula debe pasar.
Cuanta más pequeña sea la molécula más fácilmente atravezará el gel, de esta
manera la movilidad aumenta cuando disminuye el peso molecular; Weber y
Osbom (1979) demostraron que si una serie de proteínas con peso molecular
conocido son sometidos a electrofóresis en gel, ellas se separa en una serie de
bandas, y que un gráfico de la distancia de migración (d) versus el log(M)-peso
molecular- da una línea recta. Asi, si una proteína de peso molecular
deseconocido se somete a electrofóresis con dos o más proteínas de pesos
moleculares conocidos, el peso molecular de la proteina desconocida puede
calcularse con una aproximación de 5-10% de error. El tamaño del error se
determina por la exactitud de la pendiente del gráfico, y ésta se puede mejorar
aumentando el número de proteínas standares.
Aminoácidos y Proteínas 21

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- Electrofóresis en Gel de Poliacrilarnida - SDS
Suero diluido (1/10) 0,5 mL
Standares
alfa-Lactoalbumina, leche de bovino
anhidrasa carbónica, eritrocito bovino
ovoalbumina
seroalbumina
(preparar, cada una por separado, 1 mg/0.5 mL de agua destilada)
Soluciones:
Sol. 1 Acril:bisacrilamida (30:08 P/V)
Acrilamida 58.4 g
Bisacrilamida 1.6 g
Agua dest., csp 200 mL
Disolver, filtrar y guardar en refrigeración a la oscuridad.
Sol. 2 SDS 10%
SDS 5 g
agua destilada, csp 50 mL
Sol. 3 Buffer Tris-HCl 3 M. pH 8.9
Trizma Base 36.5 g
Agua destilada 70 mL
HCl 5M ajustar a pH 8.9
agua dest., csp 100 mL
Sol. 4 Buffer gel de stacking: Tris-HCl 1 M pH 6.8
Trizma base 3 g
Agua destilada aprox. 15 mL
HCl 5M, ajustar a pH 6.8
Agua destilada, csp 25 mL
Sol. 5 TEMED. Solución comercial 13 M
Sol. 6 Persulfato de amonio (preparar al momento o aliquotear a -20o
C))
Persulfato de amonio 0.2 g
Agua destilada, csp 2 mL
La solución se denomina PERSA 10
Sol. 7 Colorante para Proteínas Totales
Coomassie Blue R-250 50 mg
Tricloroacético 7.5 g
Agua destilada, csp 200 mL
Metanol 50 mL
Ac. Acético glacial 17.5 mL
Sol. 8 Decolorante
Metanol 120 mL
Agua destilada 280 mL
Ac. Acético glacial 20 mL
Sol. 9 Buffer de Muestra
(Tris-HC1 0.125 M+SDS 4%+ Glicerol 20%+ beta-mercaptoetanol)
Tris-HCl 2.5 mL de la sol. 4.
SDS 10% 4.0 mL de la sol. 2.
Beta mercapetanol (≅13 M)1 mL
Aminoácidos y Proteínas 22

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Agua destilada, csp 10 ml.
Sol. 10 Buffer de Corrida (para llenar los reservorios)
Trizma base 250 mM 3 g
Glicina 757 mM 14.4 g
SDS 10% 10 mL
Ajustar a pH 8.3, agregar agua destilada, csp 1000 mls.
H. Determinación del Peso Molecular por Electrofóresis
a. Armar el slab conforme a las indicaciones del profesor. La cámara
electroforética y los vidrios deben estar completamente limpios.
b. Tomando en cuenta la Tabla preparar un gel de poliacrilamida al 10%,
pero sin agregar el PERSA 10. Mezclar bien y agregar recién los 150 µl
de PERSA 10, inmediatamente aplicar el gel en el slab. Dejar gelificar por
unos 20 minutos (Gel de resolución). Luego preparar el gel de stacking
(ver Tabla) éste es un gel que va encima del gel de resolución; sirve para
permitir que las moléculas se separen, un tanto, antes de entrar al gel de
resolución. Inmediatamente del vaciado el gel de stacking se procede a
instalar el peine que va a generar los pozos (slots) donde se aplicarán las
muestras.
TABLA PARA ARMAR GELES DE POLIACRILAMIDA
GEL DE STACKING GEL DE RESOLUCIÓN
Volumen total, mL 10 30 30 30 30 30
% de Acrilamida 4.5 7.5 10 12.5 15 20
Acrilamida/bisacril
Amida(30/0.8 P/V) 1.5 7.5 10 12.5 15 20
SDS 10%,mL 0.1 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Tris-HCl 3M, pH 8.9, mL 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
Tris-HCl lM, pH6.8, mL 1.25
Agua destilada, mL 7.1 l 8.3 15.8 13.3 10.8 5.8
TEMED, µl. 5 15 15 15 15 15
PERSA-10, µl. 50 150 150 150 150 150
c. Una vez que ha gelificado el gel de stacking, retirar los separadores de la
base é introducir el slab en una bandeja; luego proceder a llenar con el
buffer de corrida. Retirar el peine para dejar los slots libres.
d. Preparación de las muestras:
· Suero (diluido 1/10) humano. 1 mL.
· Fracción procedente de E.h., 1 mL.
Proteínas standards (Kits MW-ND-5.00 SIGMA):
Alfa-lactoalbumina, leche bovina 4,200 D.
Anhidrasa carbónica, eritroc. Bov 29,000 D.
Albúmina, huevo de pollo 45,000 D.
Albúmina, suero de bovino 66,000 D.
Disolver cada una por separado: mg/0.5 mL. Mezclar:
Muestra 1: 10 µL de suero + 10 µL buff. de muestra+ 2 µl indic. de corrida.
Muestra 2: 20 µL de la fracción E.h. + 20 µL de buffer de muestra + 5 µL de
indicador de corrida.
Aminoácidos y Proteínas 23

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Muestra 3: 10 µL de standard + 10 µL de buff. de muestra + 2 µL de
indicador de corrida.
De aquí se obtienen las muestras. Muestra 3, Muestra 4,...,etc 5.
Las muestras ya están listas.
e. Con una micro-pipeta de 100 µL, o con una jeringa Hamilton, aplicar
cada muestra en un slot; teniendo cuidado de no producir disrupciones.
En todo caso ver primero las aplicaciones que haga el profesor, (usar un
tip por cada muestra).
f. Muy despacio llevar el equipo a refrigeración.
g. Conectar los electrodos, el color negro (negativo) en el reservorio
superior, y el rojo (positivo) en el reservorio inferior con la fuente poder.
h. Prender la fuente poder, y regular a 2 mA por muestra; dejar correr las
muestras hasta que el colorante azul de indicador de corrida haya llegado
a 1 cm del extremo inferior.
i. Apagar la fuente poder. Sacar el gel de la placa, para lo cual hay que
retirar los sujetadores, luego los espaciadores y por último el vidrio
superior de la placa. Para sacar el vidrio utilizar una espátula de metal y
hacer una suave palanca. Antes de sacar el gel, bañarlo con agua
destilada y por escurrimiento pasarlo a una bandeja.
j. Colorear el gel con la solución colorante para proteínas totales (200
mL/gel/3 horas, el tiempo siempre depende del la calidad e intensidad del
colorante).
k. Lavar el gel con agua destilada y luego sumergirlo en la solución
decolorante para proteínas totales, 250 mL/gel; dejar en esta solución una
hora y luego cambiar por otra nueva; finalmente aparecerán las bandas
de color azul. (En el paso -1- no olvidar registrar el frente de la corrida).
l. Analizar los resultados; anotar la distancia recorrida por cada Standard, y
la correspondiente a la muestra E.h.; a fin de calcular la movilidad
electroforética de cada una. Plotear en papel semilog Peso Molecular vs
movilidad electroforética de cada Standard; luego conociendo la movilidad
electroforética de la albúmina separada en E.h. deducir su peso
molecular.
m. Tomar una fotografía es muy recomendado o guardar los geles
apropiadamente.
III.4 RESULTADOS
III.5 DISCUSION Y CONCLUSIONES
III.6 CUESTIONARIO
1. ¿Como es el Cromógeno en el caso de la reacción de la Ninhidrina con
Prolina?
2. Explique detalladamente los Procedimientos para Caracterizar una
Proteína.
3. Explique y Esquematice, ampliamente la cromatografía de Alta
Resolucion (HPLC) y brevemente, Cromatografía de Adsorción, Partición,
Afinidad é Hidrofóbica.
4. Señale los pKs de los grupos - R de los Aminoácidos presentes en las
proteínas.
Aminoácidos y Proteínas 24

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Manual de Prácticas
III.7 REFERENCIAS
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ANDREWS AT.. 1986. Electrophoresis: Theory, Techniques and
Biochemical and Clinical Applications. 2nd. ed. Oxford University Press.
Cromatografía y Electrofóresis. 1979. Curso de Post Grado. C.I.
Bioquímica y Nutrición - UNMSM. Lima.
CHIMOY E, PJ, LÓPEZ L, C, MONTEGHIRFO G, M.1989. Manual de
Prácticas de Bioquímica y Biología Molecular. CONCYTEC. Fac. Cs.
Biológicas. UNPRG. Lambayeque
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Radii. Anal. Bioch. 146, 191-98.
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