La electroforesis separa y analiza moléculas como proteínas y ácidos nucleicos en función de su movilidad cuando se aplica un campo eléctrico, dependiendo de su carga eléctrica. Existen dos tipos principales: la electroforesis libre, donde las moléculas se mueven en disolución con poca resolución, y la electroforesis de zona, donde un soporte retiene las moléculas ofreciendo un alto poder de resolución. La electroforesis de proteínas se realiza comúnmente en geles de acrilamida

1. Electroforesis

2. INTRODUCCIÓN
Separar y analizar moléculas: proteínas
ADN/ARN
ELECTROFORESIS
... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico
(dependerá de su carga eléctrica)
cátodo ánodo * Moléc. (+)  polo (-) o cátodo
* Moléc. (-)  polo (+) o ánodo
ELECTROFORESIS LIBRE
 moléculas en disolución o suspensión:
poco resolutiva
Arne Tiselius
1937
(Nobel 1948)
ELECTROFORESIS DE ZONA
 SOPORTE que retiene las moléculas:
elevado poder de resolución
ánodo
cátodo
SOPORTE

3. EQUIPO ELECTROFORÉTICO
- +
muestra
muestra
+
fuente de
alimentación
fuente de
alimentación
cable
cable
-
tampón
tampón
cubeta
cubeta
gel
gel
electrodo
electrodo
cátodo ánodo
electrodo cátodo
ánodo
* Fuente de alimentación
* Cubeta
* Tampón de electroforesis
* Soporte electroforético
(gel)
* Dos electrodos
ánodo (+)
cátodo (-)
Componentes:
(E. horizontal)
(E. vertical)

4. FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
1_ Campo eléctrico
*Diferencia de potencial: voltaje (V-voltios)
*Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica
depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)
*Resistencia (R-ohmios): determinada por el soporte y tampón
electroforesis
*Temperatura: efecto Joule  refrigerantes
2_ Muestra
*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
*Tamaño
*Forma: formas globulares avanzan más
3_ Tampón de electroforesis
*pH: determina la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico  moléculas (-)
*Fuerza iónica: moderada (0.05 o 0.1 M) para que no interfiera
4_ Soporte

5.  No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento
a su paso  separación sólo por CARGA
* Electroforesis de proteínas: • Acetato de celulosa, papel, almidón,
agar
Tipos de Soporte
 Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su
paso  separación por tamaño (tamizado molecular)
* Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO
• Acrilamida
* Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO
• Agarosa, acrilamida
SOPORTE ELECTROFORÉTICO
Gel poroso
Características
 Gel poroso (entramado tridimensional interno)
 Tiene que permitir el paso de moléculas
 Material inerte: NO puede estar cargado y no
debe adsorber las moléculas de la muestra

6. EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA
+ -
Campo eléctrico (DV)
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa
Electroforesis horizontal
1. Aplicación de la muestra
2. Electroforesis
3. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Negro amido
4. Densitometría
Aplicaciones diagnósticas en serología
(separación proteínas séricas)
muestra
Avance de las proteínas
Strip

7. EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Electroforesis vertical
Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida
* Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida
* Variación de la concentración  variación del tamaño de poro
[poliacrilamida] tamaño poro
1. Preparación del gel
2. Montaje de la cubeta
3. Aplicación de la muestra
4. Electroforesis
5. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Sales de plata

8. Aplicaciones:
* Separar proteínas
* Determinar peso molecular de una proteína
* Separar proteínas oligoméricas
* Separar proteínas en función de su pI
* Separar proteínas de mezclas muy complejas
* Ver si hay una proteína en concreto
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
SDS-PAGE
Electroforesis 2D
Western Blot
Isoelectroenfoque
Ventajas:
* Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO
* Químicamente inertes
* Transparentes (permite densitometría)
* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura)
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme

9. SDS-PAGE
Condiciones de la PAGE:
* No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO  PAGE
S-S
S-S
-
-
-
--
-
- -
-
-
--
-
- -
+ SDS
+ DTT
25 kDa
+ SDS
S-S
- -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
- - -
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
-
-
- - 44 kDa
* Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO  SDS-PAGE
Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea,
reductores (DTT, b-mercaptoetanol)...
• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-)
 todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño
PM = 50 kDa

10. SDS-PAGE: determinación del peso molecular
Marcadores de peso molecular:
* Mezcla de diferentes proteínas
pre-teñidas de las que conocemos el
peso molecular.
* Por comparación podemos averiguar
el PM de nuestra proteína.

11. ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Soporte: (restrictivo)
* Gel de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb)
* Gel de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida)
Separación sólo por TAMAÑO
Densidad de carga igual para todas las
moléculas por los grupos fosfato
Ácidos nucleicos = carga (-)

12. Aplicaciones:
* Separar, identificar y purificar fragmentos
de DNA o RNA
* Determinar tamaño de un fragmento de DNA
* Separación de cromosomas enteros
* Secuenciación de DNA
* Identificación de regiones de unión a
proteínas
* Detectar la presencia de un gen (o secuencia
específica de DNA) en una muestra
* Determinar si se expresa un gen específico
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Gel de poliacrilamida
Gel de agarosa
Southern Blot
Northern Blot

13. EN GEL DE AGAROSA
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (DV)
1. Preparación del gel
2. Aplicación de la muestra
3. Electroforesis
4. Detección por tinción con Bromuro
de Etidio (BrEt): se intercala en el
DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia
Electroforesis horizontal
Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa

14. EN GEL DE AGAROSA
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (DV)
1. Preparación del gel
2. Aplicación de la muestra
3. Electroforesis
4. Detección por tinción con Bromuro
de Etidio (BrEt): se intercala en el
DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia
Electroforesis horizontal
Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa