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- 1. Q U Í M I C A B I O L Ó G I C A . D E P A R T A M E NT O D E B Q C A . F C N Y C S . U N P S J B 2 0 1 7 ELECTROFORESIS
- 2. ¿ Que es la electroforesis? ¿Qué permite analizar? ¿ Que factores influyen ?
- 3. Separar y analizar moléculas: proteínas ADN/ARN ... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico (dependerá de su carga eléctrica) * Moléc. (+) polo (-) o cátodo * Moléc. (-) polo (+) o ánodo ELECTROFORESIS LIBRE moléculas en disolución o suspensión: poco resolutiva ELECTROFORESIS DE ZONA SOPORTE que retiene las moléculas: elevado poder de resolución cátodo ánodo ánodo cátodo SOPORTE
- 4. pH bajo: carga neta positiva pI: carga neta nula pH alto: carga neta negativa
- 5. EQUIPO ELECTROFORÉTICO - + muestra muestra + - fuente de alimentación fuente de alimentación cable cable cubeta cubeta tampón tampón gel gel electrodo electrodo cátodo ánodo electrodo cátodo ánodo * Fuente de alimentación * Cubeta * Tampón de electroforesis * Soporte electroforético (gel) * Dos electrodos ánodo (+) cátodo (-) Componentes: (E. horizontal) (E. vertical)
- 6. FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS 1_ Campo eléctrico *Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500 V) alto voltaje (500-10000 V) *Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI) *Resistencia (R): determinada por el soporte y tampón electroforesis *Temperatura: efecto Joule : El aumento de temperatura generado puede dañar el soporte, el equipo electroforético y desnaturalización de las proteinas refrigerantes 2_ Muestra *Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula *Tamaño *Forma: formas globulares avanzan más 3_ Tampón de electroforesis *pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas generalmente es ligeramente básico moléculas (-) *Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera 4_ Soporte
- 7. SOPORTE ELECTROFORÉTICO No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento a su paso separación sólo por CARGA * Electroforesis de proteínas: • Papel, almidón, agar, acetato de celulosa Gel poroso Características Gel poroso (entramado tridimensional interno) Tiene que permitir el paso de moléculas Material inerte: NO puede estar cargado y no debe adsorber las moléculas de la muestra Tipos de Soporte Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su paso separación por tamaño (tamizado molecular) * Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO • Acrilamida * Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO • Agarosa, acrilamida
- 8. EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA + - Campo eléctrico (DV) Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa Electroforesis horizontal 1. Aplicación de la muestra 2. Electroforesis 3. Detección por tinción: Azul de Coomassie Negro amido 4. Densitometría / Espectrofotometría Aplicaciones diagnósticas en serología (separación proteínas séricas). muestra Avance de las proteínas
- 9. EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Electroforesis vertical Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida * Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variación de la concentración variación del tamaño de poro [poliacrilamida] tamaño poro 1. Preparación del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicación de la muestra 4. Electroforesis 5. Detección por tinción: Azul de Coomassie Sales de plata
- 10. Aplicaciones: * Separar proteínas * Determinar peso molecular de una proteína * Separar proteínas oligoméricas * Separar proteínas en función de su pI * Separar proteínas de mezclas muy complejas * Ver si hay una proteína en concreto EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE) SDS-PAGE Electroforesis 2D Western Blot Electroenfoque Ventajas: * Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO * Químicamente inertes * Transparentes (permite densitometría) * Estables (pH, fuerza iónica, temperatura) * Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme
- 11. SDS-PAGE Condiciones de la PAGE: * No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO PAGE S-S S-S - - - - - - - - - - - - - - - + SDS + DTT 25 kDa S-S + SDS - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 44 kDa S-S S-S 50 kDa * Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO SDS-PAGE Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea, reductores (DTT, b-mercaptoetanol)... • SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-) todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño
- 12. SDS-PAGE: determinación del peso molecular Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.
- 13. A trabajar se ha dicho……………… ajo Práctico Electroforesis en tiras de acetato de celulosa Separar mediante electroforesis las proteínas contenidas en el suero. Electroforesis en gel de poliacrilamida Calcular gráficamente la masa molecular aparente de proteínas por comparación con proteínas patrones en un grafico de distancia vs Log PM aparente.
- 15. Electroforesis en tiras de acetato de celulosa Tipo de electroforesis ………….. Soporte: acetato de celulosa ( conservadas en metanol). Muestra: suero humano. pH de trabajo: 8, 5 Buffer: Veronal Sódico. Siembra: con aplicador , en ¿ cátodo o ánodo? Voltaje: 2mA por tira. Tiempo de corrida: 45 minutos. Revelado: Amidoschwart o Ponceau. Solución decolorante: metanol, agua y acido acético ( 47,5:47,5: 5). Disolución de cada banda: Acido Acético al 80 %. Cuantificación espectrofotométrica a 495 nm.
- 17. Electroforesis en gel de poliacrilamida