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1. Técnicas:
ELISA y Western Blot
Aspectos prácticos…
Prof. Diana Ortiz
Cátedra Inmunología
EJMV-UCV
dprincz@gmail.com

2. Técnica de ELISA
Fundamento:
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: Ensayo por Inmunoadsorción
Ligado a Enzimas.
Inmunoensayo: detección Antígeno – Anticuerpo unido a una
enzima y cuantificado por espectofotometría
Ventajas:
Es una prueba de alta
sensibilidad y especificidad.
Es cuantitativa.
Es relativamente
económica.
Se pueden procesar hasta
96 muestras por placa.
Reactivos de gran
estabilidad.
Limitaciones:
Positividad Vs. Infección
activa: depende del tipo de
anticuerpo evaluado. A
menos que se evalúe
presencia de antígenos en la
muestra problema.
Dificultad de detección de
Acs en pacientes con alguna
inmunodeficiencia, en período
de ventana o infectados por
cepas desconocidas.

3. Técnica de ELISA
Tipos de ELISA:

4. Técnica de ELISA

5. Fases:
1. Unión del antígeno o anticuerpo primario a los pocillos de la
placa (soporte sólido (polímero): poliestireno, polivinilo)
2. Lavado
3. Bloqueo
4. Muestra (antígeno o anticuerpo)
5. Lavado
6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima
(sensibilidad)
7. Lavado
8. Sustrato de la enzima
9. Cuantificación (lector de ELISA)
Técnica de ELISA

6. Técnica de ELISA
Aspectos a considerar:
Adecuado uso de controles positivos y negativos
(control de calidad).
Adecuado diseño de la técnica (Ag-Ac, Enzima
sustrato).
Concentración/ dilución de antígenos y anticuerpos.
Reactivos en buen estado.
Cuidado de la cadena de frío.
Sensibilidad: Capacidad que tiene la prueba de detectar como positivos los
casos de pacientes enfermos (verdaderos positivos).
Especificidad: Capacidad que tiene la prueba de reportar como negativos
los casos sanos (verdaderos negativos).

7. Técnica de ELISA
Evaluación de anticuerpos ELISA
Estuches comerciales:
Detección de
anticuerpos
IgM, IgG, IgE,
IgA.
Kit Pyloriset EIA-G
(Orion Diagnostic):
Títulos ≥ 20 positivos

8. 1.- IgA secretora anti H. pylori en saliva: (ELISA)
Sensibilización: 2,5µg/pozo Ag Hp toda la noche a 4°C o 2h a 37°C
Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween
Bloqueo: PBS-BSA 1% x 2h a 37°C
Muestras de saliva 1/10 x 1h a 37°C
Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween
Anticuerpo secundario conjugado: con peroxidasa 1/1000 x 1h a 37°C
Revelado: OPD (o-phenylenediamine) + Peróxido de hidrógeno
Se detiene la reacción con H2SO4
Valores: UDO > 0,300 positivos
(Ortiz y col., 2000)
2.- IgA secretora total en saliva: (ELISA)
Monoclonal IgA (Sigma) (Ortiz y col., 2000)
Técnica de ELISA
Elisa estandarizada en laboratorio

9. Técnica de ELISA
Enzimas más utilizadas:
Peroxidasa
Fosfatasa alcalina
β-galactosidasa
Tetra-metil-benzidina

10. Interpretación de resultados:
Técnica de ELISA
¿Qué es un valor cut off?
Títulos de anticuerpos
Valores reportados en
unidades de Densidad óptica

11. Algunas Aplicaciones de la ELISA
Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC, etc.
Proteínas
Agentes infecciosos (virales, bacterianos, parásitos, hongos)
Marcadores de drogas
Control de calidad de vacunas
Screening de recién nacido
Investigación clínica
Anticuerpos: Acs antinucleares
Antígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag postático, carcinoembrionario, etc.
Autoanticuerpos
Técnica de ELISA

12. Elispot
Mide el número de células productoras de anticuerpos. El
antígeno se une al fondo de un pocillo, se añaden las células
productoras de anticuerpos en un medio semisólido y los
anticuerpos que se han secretado y unido se detectan
mediante un anticuerpo anti-Ig ligado a una enzima como en
un ELISA.
Una variante de la ELISA

13. Inmunohistoquímica

14. Western Blot
Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica
altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas
en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos
celulares o de tejidos.
Etapas:
1. Preparación de la muestra
2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de
poliacrilamida)
3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa )
4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de
anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

15. Western Blot
Preparación del gel de
poliacrilamida SDS-PAGE
y corrida electroforética.

16. Western Blot
Tinción del gel con azul de Coomassie

17. Western Blot
Transferencia
Se transfieren las bandas de
proteínas o desde el gel hacia
una membrana de
nitrocelulosa (flechas azules).

18. Western Blot

19. Western Blot

20. Western Blot

21. Revelado
Western Blot

22. Western Blot
Wang, Mol Vis 2012; 18:1115-1122.
http://www.molvis.org/molvis/v18/a118

23. CORTES X, GARCIA Z, TORRES L, TAYLOR L. Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos
por anticuerpos contra los virus linfotrópicos de células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre en
Costa Rica. Rev. costarric. cienc. méd [online]. 2007, vol.28, n.1-2 [cited 2017-02-15], pp. 11-20 .
Western Blot

24. Western blot

25. Western blot
Aplicaciones:
Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la
biología molecular
Permite identificar antígenos inmuno-dominates para vacunas.
Estudiar perfil de citocinas.
Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra.
Factores de crecimiento
Niveles de fosforilación, modificaciones post traduccionales, etc
Diagnóstico:
Prueba confirmatoria de VIH
Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente
llamada“enfermedaddelasvacaslocas”
Enfermedad de Lyme.

26. Western Blot

27. ELISA Vs. Western Blot…

28. Ensayo de unión a múltiples antígenos: MABA
Péptidos 20µ
µ
µ
µg/ml diluidos en buffer carbonato pH 9.6
(1 h)
Bloqueo: leche descremada al 5% en PBST pH 7.2 (2 h)
Muestras: Suero 1/100 en PBST (1 ½ h) Saliva 1/10
Anti IgG o IgA peroxidasa 1/30.000 , 1/6000 (1 ½ h)
Revelado quimioluminescente
Identificación de reconocimiento a epitopes sintéticos
Muestras: Sueros y salivas
MABA
(Noya o y col, 1998)

29. Fig. 24: Reactividad de sueros (IgG) frente a péptidos sintéticos de H. pylori utilizando MABA.
En vertical se muestran las tiras correspondientes a cada paciente: tira 1: conjugado, tiras 2-28 sueros de pacientes. En
horizontal están los péptidos sintéticos que fueron sensiblizados en el papel de nitrocelulosa, del 2- 4: péptidos de UreB, 5: pool
de Ure, 6: pool de flagelina, 7-14: péptidos de VacA, 15: pool de VacA, 16-26: péptidos de Cag, 27: pool de Cag, 1 y 28:
Antígeno de H. pylori.
MABA
(Ortiz-Princz D, 2015)

31. https://www.youtube.com/watch?v=GE8JlP0PBEM
https://www.youtube.com/watch?v=_8r5XVmKfOc
Videos Western blot:
https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs
https://www.youtube.com/watch?v=RWQWy0HODJc
https://www.youtube.com/watch?v=iKV6l0B9Ak0
https://www.youtube.com/watch?v=_8xftsCIwYo
Videos ELISA: