Este documento describe las enzimas de restricción, incluyendo su historia, tipos, mecanismos de acción, y aplicaciones. Las enzimas de restricción reconocen y cortan secuencias específicas de ADN. Existen tres tipos principales (I, II, III) que difieren en dónde cortan el ADN. Las enzimas tipo II se usan comúnmente en técnicas de biología molecular para fragmentar el ADN de manera controlada. Algunas aplicaciones incluyen mapeo de genes, diagnóstico de enfermed

1. ENZIMAS DEENZIMAS DE
RESTRICCIRESTRICCIÓÓNN
ADRIANA MARIA GIL ZAPATA
MscMsc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS

2. ENZIMAS DE RESTRICCIENZIMAS DE RESTRICCIÓÓNN
Historia: 1953 Luria y Human (Restricción
bacteriófagos)
1968, Werner Arber, en Basilea (Enzimas de
restricción)
1969 Hamilton Smith, en Baltimore (tipo II)
1972 Mertz y Davis (ADN ligasa)
Enzimas Bacterianas
Reconocen secuencias especificas: 4-8pb.
Endonucleasas.
Término: Restricción.

3. ENZIMAS DE RESTRICCIÒN

4. SECUENCIASSECUENCIAS
PALINDRPALINDRÓÓMICASMICAS
EcoRI 5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5 ’
hidroliza los enlaces fosfodiéster
que unen las bases G y A de cada
hebra, de este modo los cortes
que crea son escalonados y dan
lugar a la formación de fragmentos
de ADN cuyos extremos tienen una
corta región monocatenaria que
resultará complementaria a las de
los otros fragmentos.

5. ENZIMAS ADNENZIMAS ADN
RECOMBINANTERECOMBINANTE

6. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

7. APLICACIONES DE LA GENAPLICACIONES DE LA GENÉÉTICATICA
MOLECULARMOLECULAR
TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

8. Polimorfismos de longitud dePolimorfismos de longitud de
Fragmentos deFragmentos de RestriccionRestriccion (RFLP(RFLP‘‘s)s)

9. ENZIMAS DE RESTRICCIONENZIMAS DE RESTRICCION
TIPO ITIPO I
Una sola enzima (multimérica que posee
3 subunidades) reconoce la secuencia
específica de ADN, metila y restringe.
Pero la restricción no ocurre en el sitio de
reconocimiento, sino que es al azar y en
sitios distantes al de reconocimiento.

10. ENZIMAS DE RESTRICCIONENZIMAS DE RESTRICCION
TIPO II
La restricción ocurre en el sitio de
reconocimiento. Estas enzimas tipo II
son las utilizadas en genética molecular
puesto que permiten romper el ADN en
sitios específicos, y así, recuperar
secuencias conocidas.

11. ENZIMAS DE RESTRICCION
TIPO II

12. ENZIMAS DE RESTRICCION
TIPO III
Es similar al sistema tipo I, utilizan
una enzima oligomérica que realiza
todas las actividades enzimáticas, y
rompen el DNA 25-27 bp, más allá
del sitio de reconocimiento.

13. ENZIMAS DE RESTRICCION
Una unidad de enzima se define como la
cantidad de la misma que se necesita para
cortar 1 g de DNA en 1 hora.
Se han identificado más de 200
endonucleasas de restricción.
http://www.neb.com/nebecomm/products/category
1.asp

14. ENZIMAS DE RESTRICCION
Las enzimas tipo II, dependiendo de
su especificidad, al romper el ADN
provocan 2 tipos de cortes:
A. Cortes pegajosos, dejando
productos con extremos
complementarios (cohesivos) Ej: Eco
RI y Pst I.
B. Cortes Romos
(Desoxinucleotidil transferasa
terminal).

15. FRAGMENTOS ORIGINADOS POR
LAS ENZIMAS DE RESTRICCION

16. ENZIMAS DE RESTRICCION

17. EXTREMOS PEGAJOSOS O
COHESIVOS

18. EXTREMOS ROMOS

19. CORTES ENZIMAS DE
RESTRICCION

24. SITIOS DESITIOS DE
RECONOCIMIENTORECONOCIMIENTO
Lambda
PhiX174
M13mp18/19
pBR322
pUC18/19
pUC57
pTZ19R/Up
BluescriptIIKS

25. PLASMIDOPLASMIDO pBR322pBR322

26. APLICACIONES ENZIMAS DEAPLICACIONES ENZIMAS DE
RESTRICCIONRESTRICCION
Hacer mapa de restricción de un plásmido o
bacteriófago.
Fragmentar DNA genómico para separación de
electroforesis y “Southern Blot”.
Generación de fragmentos para ser usados
como sondas marcadas en “Southern”y
“Northern” blotting.
Generación de fragmentos para ser
subclonados en los vectores apropiados,
creación de DNA recombinante.

27. APLICACIONES ENZIMAS DEAPLICACIONES ENZIMAS DE
RESTRICCIONRESTRICCION
Desarrollo ADN Recombinante y
biotecnologia.
Mecanismos de regulación y expresión
génica.
Mapeo y cartografía de genes.
Diagnostico enfermedades geneticas con
cambio en la secuencia de ADN.
Desarrollo proteínas recombinantes.

28. APLICACIONES
DE LA GENÉTICA
MOLECULAR
ENZIMAS
DE
RESTRICCIÓN

29. APLICACIONES DE LA GENÉTICA
MOLECULAR
ENFERMEDAD GÉNICA: SITIOS DE RESTRICCIÓN

30. APLICACIONES DE LA GENÉTICA
MOLECULAR
ENFERMEDAD GÉNICA
GANANCIA O PÉRDIDA DE SITIOS DE RESTRICCIÓN

31. PCRPCR

33. PCRPCR
ALTA SENSIBILIDAD
ALTA ESPECIFICIDAD
RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de
trazas de DNA templado específico o productos
amplificados previamente)

34. REACCIREACCIÓÓN EN CADENA DE LAN EN CADENA DE LA
POLIMERASAPOLIMERASA
CICLOCICLO
1. DENATURACIDENATURACIÓÓNN
90 a 9590 a 95 °° cc
2.2. ANILLAMIENTOANILLAMIENTO
55 a 6555 a 65 °° cc
3.3. EXTENSIEXTENSIÓÓNN
72 ° c

36. TERMOCICLADORTERMOCICLADOR

37. Usos de la PCRUsos de la PCR
Pruebas de identificaciPruebas de identificacióón (n (STRsSTRs))
DetecciDeteccióón de enfermedades hereditariasn de enfermedades hereditarias
DetecciDeteccióón de enfermedad viraln de enfermedad viral
ClonaciClonacióón de genesn de genes
MutagMutagéénesisnesis dirigidadirigida
GenotipificaciGenotipificacióónn de mutaciones especificasde mutaciones especificas
((SNPsSNPs))

38. PCR ANGIOTENSINOGENOPCR ANGIOTENSINOGENO
AGTAGT
H20: 1 0 ul
Buffer: 5.0 ul
MgCl2 : 6.0 ul
dNTPs: 4.0 ul
Primers: 6.4/6.4ul
Taq: 0.2 ul
_________
38 ul + 12 ul ADN.

39. Buffer D. 37°C.Incubatin
Conditions
Nocardia corallina.Source
10mM Tris-HCl (pH 7.4), 300mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM
DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol.
Storage
Buffer
Store at –20°C.Storage
Conditions
Restriction Enzyme Usage Information.Protocol
•Blue/White Cloning Qualified: Promega's blue/white
cloning assay provides a higher level of quality control for
enzymes used in cloning applications.
Features
C▼CATG G
G GTAC▲C
Descriptin
DIGESTICON CON LADIGESTICON CON LA
ENZIMAENZIMA NcoINcoI

40. For site-specific methylation information, consult McClelland, M.,
Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3640–59.
Notes
Frequency
of Cutting
Percent
Activity in
4-CORE®
Buffer
System
75–100%100%75–100%75–100%50–75%
MULTI-CORE™DCBA
0000204
pBR322M13mp18pUC18ΦX174Ad-2λ

41. PROTOCOLO DIGESTIONPROTOCOLO DIGESTION NcoINcoI
Enzima: 0,2 ul
Bufffer : 0,5 ul
H20 : 4,3 ul
________
5,0 ul + 15ul Amplificado

42. Fragmentos obtenidos de laFragmentos obtenidos de la
digestidigestióón de AGT con la enziman de AGT con la enzima NcoINcoI
El fragmento del amplificado de AGT sin
digerir pesa: 303 pb
T: 303 pb
M: 211 pb + 92pb
El polimorfismo: T174M
Resultado de la electroforesis:
TT 0.83, TM 0.15, MM 0.02