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06/12/2011




                                                                                        ENTEROBACTERIAS
             ETA causadas por                                         • Familia Enterobacteriacea
              Enterobacterias                                         • Cocobacilos o bacilos gram
                                                                        negativos
                                                                      • No esporoformadores
                                                                      • Anaerobios facultativos.
                                                                      • Fermentadores de glucosa,
                                                                        con formación de ácido y
                                                                        gas.
                                                                      • Oxidasa negativos (variable)
                                                                      • Reducen nitratos a nitritos.
                                                                      • Pueden aislarse del
                                                                        intestino del hombre y de
                                                                        otros animales
                                                                                                         Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                               Salmonella
    Enterobacterias: Clasificación
                                                                       • Según la clasificación actual
                                                                         existen dos especies:
                                                                           – S. bongori
                                                                           –   S. enterica.
                                                                       • La especie S.enterica es la que
                                                                         se ha encontrado en los alimentos
                                                                         y en el agua y está subdividida en
                                                                         7 subespecies:
                                                                           – subesp. enterica (I)
                                                                           – subesp. salamae (II)
                                                                           – subesp. arizonae (IIIa)
                                                                           – subesp. diarizonae (IIIb)
                                                                           – subesp. houtenae (IV)
                                                                           – subesp. indica (VI)
                      Marcela Martínez M.Sc.                                                           Marcela Martínez M.Sc.




                                                                          Los síndromes producidos por
    Patogenia de Salmonella spp.
                                                                       Salmonella son fundamentalmente:

•    Ingestión alimentos o                                            • Grastroenteritis por
     bebidas                                                            Salmonella
     contaminados.
                                                                      • Fiebre entérica
•    Multiplicación en
                                                                      • Bacteriemia
     intestino delgado.
                                                                      • Infecciones focales
•    Inmunodepresión -
     invasión.                                                        • Secuelas
•    Citotoxinas y
     enterotoxinas.
                                         Fiebre tifoidea (S. typhi)
                        Marcela Martínez M.Sc.                                                           Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                          1
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                  Fiebre entérica                                                  Gastroenteritis por Salmonella
                                       • Producida por                                                                           • Es causado por la ingestión
                                                                                                                                   de alimentos que contienen
                                              – S. tiphy: fiebre tifoidea                                                          Salmonella sin especificar el
                                                                                                                                   hospedador.
                                              – S. paratiphy: fiebre
                                                paratifoidea                                                                     • Los síntomas aparecen en
                                                                                                                                   12 o 14 horas
                                       • La dosis infectiva es                                                                   • Síntomas: nauseas, vómitos,
                                         muy baja: unos 10                                                                         dolor abdominal, cefalgia,
                                         bacterias por gramo.                                                                      escalofríos y diarrea.

                                       • Son siempre de origen                                                                   • Dosis infecciosa: 107 a 109
                                                                                                                                   bacterias por gramo.
                                            humano.
                          Marcela Martínez M.Sc.                                                                    Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                    Salmonelosis
           Hábitat de Salmonella
                                                                                                Alimentos implicados
                                                                              • Hay dos fuentes
• El principal hábitat de                                                       principales de Salmonella
  Salmonella es el tracto                                                       en alimentos:
  intestinal de humanos y                                                          – Materias primas
  animales tales como aves,
                                                                                        •   Carne
  reptiles, animales de granja.
                                                                                        •   Leche
                                                                                        •   Aves de corral
• Alimentos de origen animal
                                                                                        •   Huevos
  y los que están expuestos a
  contaminación por aguas                                                          – Manipuladores portadores
  residuales.                                                                           • Manos contaminadas
                                                                                          fecalmente.

                          Marcela Martínez M.Sc.                                                                    Marcela Martínez M.Sc.




     Factores que hacen posible la                                           Contaminación en carnes
      aparición del caso o brote:                                            Animales con septicemia
                                                                              producida por Salmonella
• Tratamiento térmico
                                                                             Desde el contenido intestinal y
  insuficiente.                                                               desde las heces que se adhieren
                                                                              en el pelo, en la piel y en las
• Condiciones de                                                              patas de los animales cuando
  almacenamiento pos-                                                         llegan para el sacrificio.
  tratamiento inadecuadas:
                                                                             Operaciones de escaldado y
   – Temperatura inadecuada                                                   pelado.

   – Tiempo excesivo                                                         Contaminación cruzada desde
                                                                              canales contaminadas a
                                                                              utensilios, superficies de trabajo,
• Contaminación pos-
                                                                              y desde las manos de operarios
  tratamiento térmico                                                         que manipulan la carne, a las
                                                                              piezas de carne y a la carne
                          Marcela Martínez M.Sc.                                                               Marcela Martínez M.Sc.
                                                                              picada.




                                                                                                                                                                    2
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Contaminación de canales de aves                                                             Contaminación              (gallinas, patas y pavas) infectadas.
                                                                                             de huevos                 Penetración de la cáscara y de las
 Desde la superficie del TGI                                                                                           membranas.
 Desde la materia fecal                                                                                               La superficie de la cáscara se puede
  existen en las patas y en                                                                                             contaminar durante su transito a través
  las plumas.                                                                                                           de la cloaca o cuando está expuesta a
                                                                                                                        un ambiente contaminado con materia
 Operaciones decisivas:
                                                                                                                        fecal.
  desplumado, evisceración
  y enfriamiento de las                                                                                                Las salmonelas pueden penetrar el
  canales.                                                                                                              huevo cuando se enfría o se lava
                                                                                                                        inadecuadamente.
 Contaminación cruzada:
  manos de los operarios,                                                                                              Las salmonelas existentes en la
  material y utensilios                                                                                                 superficie contaminan el agua de
  durante el troceado y la                                                                                              lavado, las superficies de contacto y las
  preparación.                                                                                                          manos de los manipuladores.
                                      Marcela Martínez M.Sc.                                                            Marcela Martínez M.Sc.




           Salmonella: Factores de                                                                Procedimientos de control de
         crecimiento y supervivencia                                                                      Salmonella
  • El crecimiento se reduce a                     • No forman esporas son                   1. Operación para garantizar la
    T° inferiores a 15°C y se                        capaces de sobrevivir por                  destrucción de las salmonelas
    inhibe a T° inferiores a 7°C.                    mucho tiempo en los                        en los alimentos contaminados,
    La T° máxima de                                  alimentos y en otros                       especialmente en los productos
                                                                                                crudos de origen animal.
    crecimiento es de 49°C.                          sustratos:
                                                          – Judías verdes, remolacha, col,   2. Prevención de la contaminación
  • La Aw mínima es 0,94                                    zanahoria, apio, pepinos,           de los alimentos listos para
                                                            lechuga, pimientos, rábanos,        comer.
  • El pH mínimo es 3,8                                     espinacas y tomates
                                                                                             3. Almacenamiento de los
                                                          – Superficies tales como la
                                                                                                alimentos a temperaturas bajas
  • Susceptible a irradiación,                              cerámica, el vidrio y el acero
                                                            inoxidable y en la piel             o elevadas que impidan el
    oxido de etileno y                                                                          crecimiento de las salmonelas.
                                                            humana,
    desinfectantes comerciales.
                                      Marcela Martínez M.Sc.                                                            Marcela Martínez M.Sc.




   INVESTIGACIÓN DE Salmonella EN ALIMENTOS
                                                                                                  Preenriquecimiento no selectivo
 1. Pre-Enriquecimiento en medio líquido no selectivo
             – Agua de peptona tamponada
             – Caldo nutritivo
             – Caldo lactosado
 2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos                                               Se incuban 25g
             – Caldo Tetrationato (menos usado Caldo selenito)
             – Caldo Rappaport
                                                                                                de la muestra en
             – Caldo Selenito cistina                                                           225ml de pre-
 3. Aislamiento en placas de agares selectivos                                                  enriquecimiento
             –   Agar sulfito bismuto (BS)                                                      por 18-24 h a
             –   Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)
             –   Agar Hektoen (HE)                                                              35-37 C
             –   Agar Salmonella - Shigella

 4. Identificación bioquímica
             – Agar TSI
             – Medio LIA (K/K)
             – Urea                   Marcela Martínez M.Sc.                                                            Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                                                     3
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                                                    Aislamiento en medios sólidos selectivos y
      Enriquecimiento selectivo                           diferenciales para Salmonella


Se pasa 1ml del caldo
de pre-enriquecimiento
a un tubo con 10ml de
caldo de
enriquecimiento
selectivo, y se incuba a
43 C en baño María por
24h


                           Marcela Martínez M.Sc.                    Marcela Martínez M.Sc.




       Agar Salmonella-Shigella                                   Agar XLD




         Observe las colonias lactosa negativa y
         sulfuro + típicas de Salmonella (Negras                                 Obsérvese las colonias negras
         con borde transparente)                                                 sulfuro +.
                           Marcela Martínez M.Sc.                    Marcela Martínez M.Sc.




           Agar Bismuto Sulfito                                Agar Hektoen
        Observe las colonias negras
        típicas de Salmonella




                                                                 Observe la colonia negra
                                                                 verdosa típica de Salmonella



                           Marcela Martínez M.Sc.                    Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                         4
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    Pruebas bioquímicas para Salmonella                         Pruebas bioquímicas para Salmonella spp.




             TSI      LIA      Citrato (-) Urea (-)   SIM
             K-A      (-)
                            Marcela Martínez M.Sc.                                           Marcela Martínez M.Sc.




                                                                Shigella spp.
                   Shigella spp.
                                                                Cuatro especies:
• Bacilo Gram negativo                                           •   S. dysenteriae (es toxigénica produce la
                                                                     toxina de Shiga y la más virulenta)
• Estrechamente relacionado
                                                                 •   S. flexneri (es la especie más
  con E. coli por sus                                                frecuente)
  propiedades bioquímicas,
                                                                 •   S.boydii
  serológicas y por similitudes
  genéticas.                                                     •   S. sonnei

• No fermentar la lactosa, ser
  inmóvil, no produce lisina
  decarboxilasa y raramente
  produce gas a partir de
  hidratos de carbono
                            Marcela Martínez M.Sc.                                           Marcela Martínez M.Sc.




            Epidemiología: Shigella                                             Shigella - Patogenia
• Sólo infecta al hombre                                    •    Transmisión persona-
                                                                 persona vía fecal-oral
• Niños de países
  subdesarrollados                                          •    Invasión y
• Dosis infectante de                                            multiplicación en el
  200 bacterias por                                              colon
  gramo
                                                            •    Respuesta inflamatoria
• Hacinamiento, moscas                                           secundaria
  y cucarachas
                                                            •    S. dysenteriae: toxina
• Transmisión oral-fecal                                         de Shiga

                            Marcela Martínez M.Sc.                                           Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                              5
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                 Disentería bacilar                           Distribución en la naturaleza
• Diarrea caracterizada                                • Agua inadecuadamente
  por eliminación                                        tratada.
  frecuente de heces                                   • Hortalizas crudas y las
  conteniendo pus,                                       frutas, por ejemplo, la
  sangre y/o moco.                                       lechuga y las fresas
• Retortijones, fiebre                                 • Moscas contaminadas
  alta, pérdida de                                       por contacto con aguas
  apetito, náuseas,                                      residuales o con heces
  vómito

                              Marcela Martínez M.Sc.                                  Marcela Martínez M.Sc.




                                                       Alimentos implicados en brotes de
      Supervivencia en alimentos
                                                                   shigelosis
                                                       •   Leche
• Sobreviven en los alimentos
  a -20°C, a temperaturas de                           •   Ensalada de patatas
  nevera, a temperaturas                               •   Ensalada de atún
  ambientales durante                                  •   Puré de patatas
  tiempos prolongados e                                •   Ensalada de pavo
  incluso a 80°C durante unos                          •   Leche agria
  pocos segundos.                                      •   Ensalada aderezada
                                                       •   Queso blanco
• En los alimentos con pH
                                                       •   Budín de chocolate
  neutro, tales como la
  mantequilla y la margarina,                          •   Manzanas estofadas
  huevos, en la leche, en los                          •   Ensalada de camarones
  camarones y en la harina .                           •   Arroz cocido
                              Marcela Martínez M.Sc.   •   Ensalada de hortalizas     Marcela Martínez M.Sc.




                        Shigella spp.                                            Shigella spp.
Métodos de presencia/ausencia                          Métodos de presencia/ausencia
1. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos       3. Identificación bioquímica
          –   Caldo selenito                                   •   Fermentacion de glucosa, sacarosa y lactosa
          –   Caldo para Gram positivos                        •   Producción de ácido sulfhídrico
          –   Caldo EE de Mossel                               •   Descaboxilación de la lisina
          –   Caldo Shigella
                                                               •   Producción de la urea
                                                               •   baterías comerciales miniaturizadas (por ej., Micro ID,
2. Aislamiento en placas de agares selectivos                      Minitek, API 20E, Enterotube II, Vitek)
          –   MacConkey: lactosa negativo
          –   Agar SS: Salmonella-shigella agar        4. Identificación serológica
          –   Agar XLD: Xilosa-lisina-dexosicolato
          –   Agar Hektoen


                              Marcela Martínez M.Sc.                                  Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                     6
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    Crecimiento de Shigella en SS                                            Pruebas bioquímicas Shigella




                            Marcela Martínez M.Sc.                                                 Marcela Martínez M.Sc.




                    Shigella spp.
                                                                         Escherichia coli
 • Métodos especiales de Identificación
          – Sistema miniauturizados: Excelente identificación            Bacilos Gram negativos
          – Medios cromogénicos: Pocos
          – Serología:                                                   No esporulados
              » Primordial para su identificación
                                                                         Anaerobio facultativos

 • Métodos moleculares                                                   Fermentadores
          – PCR
             » Factores de virulencia                                    Móviles
             » ial, ipaH y otros relacionados a invasividad
                                                                         Agente etiológico de
          – Secuenciación
                                                                          septicemia, infecciones del
                                                                          tracto urinario, meningitis
                                                                          neonatal y gastroenteritis
                          Marcela Martínez M.Sc.
                                                                                                   Marcela Martínez M.Sc.




Escherichia coli                                                       Escherichia coli
                                                                                                      Enteroinvasiva
                                                                                                      • Contagio por alimentos contaminados...
                                                                                                      • La bacteria se adhiere, invade y destruye las
                                                                                                      células epiteliales...
                                                                                                      • Causa diarreas con sangre (disentería) y
                                                                                                      acuosas...
                                                                                                      • Enterotoxina codificada en un plasmidio...

                                                                                                      Enterohemorrágica
                                                                                                      • Contagio por alimentos contaminados...
                                                                                                   • Baja dosis infectiva (<100 bacterias)...
                                                                                                   • Causa desde diarreas leves hasta colítis
                                                                                                   hemorrágica...
                                                                                                   • Toxinas VT1 y VT2 codificadas en dos
    ECET: enterotoxígena…                   ECEH: enterohemorrágica…                               profagos. Parecidas a las tóxinas de Shigella...
    ECEP: enteropatógena…                   ECEA: enteroagregativa…
    ECEI: enteroinvasiva… Marcela Martínez M.Sc.
                                            ECDA: difusamente                                      • Puede producir SHU por daño renal posterior
                                                                                               Marcela Martínez M.Sc.
                                        adherente…                                                 a las colítis




                                                                                                                                                        7
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Escherichia coli                   Enterotoxigénica                                   Escherichia coli…      Enterotoxigénica
                                   • Contagio por alimentos o aguas                                          • Contagio por alimentos o aguas
                                   contaminadas...                                                           contaminadas...
                                   • Causa “diarrea de viajero” leves hasta colítis                          • Causa “diarrea de viajero” leves hasta colítis
                                   hemorrágica...                                                            hemorrágica...
                                   • Fimbrias denominadas Factores de                                        • Fimbrias denominadas Factores de
                                   colonización (CFA) codificadas en un                                      colonización (CFA) codificadas en un plasmidio.
                                   plasmidio. CFAI y CFAII, se adhieren                                      CFAI y CFAII, se adhieren específicamente al
                                   específicamente al epitelio del intestino                                 epitelio del intestino delgado...
                                   delgado...
                                                                                                             • Toxinas STI y STII (termoestables; codificada
                                   • Toxinas STI y STII (termoestables; codificada                           en un transposón) y LTI y LTII (termolábiles)...
                                   en un transposón) y LTI y LTII (termolábiles)...
                                                                                                             • STI. Estimula la salida de Cl- y/o inhibe
                                   • STI. Estimula la salida de Cl- y/o inhibe                               absorción de NaCl. Diarrea acuosa.
                                   absorción de NaCl. Diarrea acuosa.
                                                                                                             • STII. Se cree que estimularía la salida de
                                   • STII. Se cree que estimularía la salida de                              HCO3-. Diarrea acuosa.
                                   HCO3-. Diarrea acuosa.
                                                                                                             • LTI. Función homóloga a la toxina del cólera.
                                   • LTI. Función homóloga a la toxina del cólera.
                                                                                                             • LTII. Rara en el humano.
                                 • LTII. Rara en
                               Marcela Martínez M.Sc.el    humano.                                        Marcela Martínez M.Sc.




  Aislamientos e identificación de E. coli
  • Enriquecimiento
                                                                                                 E. coli - Mac Conkey
           – No aplica


  • Aislamiento en medios
    selectivos
           – MacConkey
           – EMB



  • Identificación
    bioquímica
           – Indol (+), Citrato (-),
             mucato (-)



                                  Marcela Martínez M.Sc.                                                    Marcela Martínez M.Sc.




                          E. coli - EMB                                                              Escherichia coli
                                                                                            Método de Recuento en placa




                                  Marcela Martínez M.Sc.                                                    Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                                                8
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                          Principio                                                       Enumeración de Escherichia coli β-glucuronidasa positivo
                                                                                                                           Agar TBX (Triptona-Bilis-X- β-D-
                                                                                       Medio de cultivo
                                                                                                                           Glucuronido)
El medio TBX contiene
                                                                                       Temperatura de incubación           44 ± 1°C
un agente cromogénico
                                                                                                                           18-24 h. (Células estresadas: 4 h a 37°C)
X -D-glucuronido, que                                                                  Tiempo de incubación
                                                                                                                           No incubar más de 24 h !!!
detecta la actividad de                                                                Placas seleccionadas para el        ≤ 150 colonias típicas y ≤ 300 colonias
la enzima -                                                                            recuento                            totales
glucuronidasa (GUD),                                                                   Colonias típicas                    Azules

presente en la mayoría                                                                                                     Medio autoclavable.
                                                                                                                           Permite siembra en placa vertida y en
(92 a 99 %) de las cepas                                                                                                   superficie
                                                                                       Ventajas
de Escherichia coli (no                                                                                                    Rápido.
                                                                                                                           No debe realizarse confirmación
detecta la E. coli 0157)                                 AGAR TBX                                                          bioquímica
                                                                                       Desventaja                          Medio costoso
                                Marcela Martínez M.Sc.                                                                Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                      FDA-BAM
      Escherichia coli Método NMP
                                                                                                          Caldo LST 35 1 C / 24-48                   2h
              Mineral-modified glutamate medium (Caldo)                               C
                                                                                                          Caldo LBVB 35 1 C / 24-48                  2h
                           37      1 C / 24       2h               Enriquecimiento
                   Acidificación (coloración amarilla)


                                                                                     CF              Caldo EC 45,5                 0,2 C / 24-48       2h
                 Agar TBX (Triptona-Bilis-Glucuronido)
                          44      1 C / 20 a 24 h
                        Colonias Típicas: azules                                                           Agar EMB 35 1 C / 18-24 h

                                                                                     E. coli                                  PCA
                                                                                                              Gram y Pruebas bioquímicas:
         Calcular el NMP en función de los tubos que dan
             presencia de colonias típicas en Agar TBX                                                     I M V i C y gas de lactosa (LST)
                                Marcela Martínez M.Sc.
                                                                                                           1 5 2      2 (días deM.Sc.
                                                                                                                      Marcela Martínez
                                                                                                                                       incubación)




   Pruebas bioquímicas E. coli                                                        Yersinia
                                                                                      enterocolítica

                                                                                         Bacilos Gram negativos
                                                                                         no esporulados
                                                                                         anaerobio facultativos
                                                                                         fermentadores
                                                                                         inmóviles
                                                                                        agente etiológico de peste
                                                                                      bubónica (Y. pestis),
                                                                                      diarreas acuosas agudas
                               Citrato                                                (otras especies)
    TSI A-A                                              Indol +
     Gas +                       (-)
                               Marcela Martínez M.Sc.                                                                 Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                                                                             9
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         Serotipos responsables de
                                                                     Yersiniosis humana
            Yersiniosis humana
                                                     • Se presenta muy comúnmente
 • Solamente son
                                                       en niños de menos de siete
   patógenos                                           años de edad.
   determinados biotipos
   de Y. enterocolitica                              • Los síntomas consisten en
                                                       dolor abdominal y diarrea
 • Cuatro serotipos (0:3;                              acompañada de una fiebre
   0:5,27; 0:8 y 0:9) son                              ligera.
   responsables de la                                • Se cree que los cerdos son el
   mayoría de los casos de                             principal reservorio de
   yersiniosis humana.                                 bioserotipos patógenos para
                                                       las personas
                           Marcela Martínez M.Sc.                                 Marcela Martínez M.Sc.




    Crecimiento de Yersinia enterocolítica
                en alimentos                                         Cepas ambientales
                                                    • Suelo
• Crece Desde -1 °C hasta +40°C.
                                                    • Agua dulce
• Crecimiento óptimo en torno a
  29°C.                                             • Tracto intestinal de muchos
                                                      animales.
• Es termosensible.
                                                    • Alimentos entre los que se
• Es un microorganismos
                                                      incluyen la leche y los
  psicrótrofo y como tal es capaz
                                                      productos lácteos, las carnes,
  de crecer a temperaturas de
                                                      especialmente la de cerdo, las
  refrigeración.
                                                      canales de las aves de corral, el
• Crece a un pH de 7-8                                pescado y el marisco, las frutas
                                                      y las hortalizas.
                           Marcela Martínez M.Sc.                                 Marcela Martínez M.Sc.




    Brotes de Yersiniosis producidos                   Aislamiento e identificación de Yersinia

             por alimentos                           Métodos de presencia/ausencia
                                                         1. Pre-Enriquecimiento en medio líquido
 • Son muy poco frecuentes
                                                                 1. Incubación prolongada (7 días) a 4°C
 • Los cerdos son portadores                                     2. Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
   crónicos de los serotipos                                     3. Caldo triptona y soja (TBS)
   patógenos.                                            2. Aislamiento en agares selectivos
                                                                 1. Agar Cefsulodin-Irgasan-Novobiocina (CIN)
 • Casi todos los brotes                                         2. Agar Salmonella-Shigella Desoxicolato y
   producidos por alimentos                                         cloruro cálcico (SSDC)
   en los que se identificó un                           3. Identificación con pruebas bioquímicas
   origen han sido atribuidos a
                                                                 –   Agar Hierro Kliger
   la leche fresca o
                                                                 –   Urea positiva
   contaminada pos
   tratamiento térmico.                                  4. Serotipado y biotipado
                                                                                Marcela Martínez M.Sc.
                           Marcela Martínez M.Sc.




                                                                                                                         10
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                         La verdadera generosidad para
                         con el futuro consiste en
                         entregarlo todo al presente
                                              Albert Camus




Marcela Martínez M.Sc.
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  • 1. 06/12/2011 ENTEROBACTERIAS ETA causadas por • Familia Enterobacteriacea Enterobacterias • Cocobacilos o bacilos gram negativos • No esporoformadores • Anaerobios facultativos. • Fermentadores de glucosa, con formación de ácido y gas. • Oxidasa negativos (variable) • Reducen nitratos a nitritos. • Pueden aislarse del intestino del hombre y de otros animales Marcela Martínez M.Sc. Salmonella Enterobacterias: Clasificación • Según la clasificación actual existen dos especies: – S. bongori – S. enterica. • La especie S.enterica es la que se ha encontrado en los alimentos y en el agua y está subdividida en 7 subespecies: – subesp. enterica (I) – subesp. salamae (II) – subesp. arizonae (IIIa) – subesp. diarizonae (IIIb) – subesp. houtenae (IV) – subesp. indica (VI) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Los síndromes producidos por Patogenia de Salmonella spp. Salmonella son fundamentalmente: • Ingestión alimentos o • Grastroenteritis por bebidas Salmonella contaminados. • Fiebre entérica • Multiplicación en • Bacteriemia intestino delgado. • Infecciones focales • Inmunodepresión - invasión. • Secuelas • Citotoxinas y enterotoxinas. Fiebre tifoidea (S. typhi) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 1
  • 2. 06/12/2011 Fiebre entérica Gastroenteritis por Salmonella • Producida por • Es causado por la ingestión de alimentos que contienen – S. tiphy: fiebre tifoidea Salmonella sin especificar el hospedador. – S. paratiphy: fiebre paratifoidea • Los síntomas aparecen en 12 o 14 horas • La dosis infectiva es • Síntomas: nauseas, vómitos, muy baja: unos 10 dolor abdominal, cefalgia, bacterias por gramo. escalofríos y diarrea. • Son siempre de origen • Dosis infecciosa: 107 a 109 bacterias por gramo. humano. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Salmonelosis Hábitat de Salmonella Alimentos implicados • Hay dos fuentes • El principal hábitat de principales de Salmonella Salmonella es el tracto en alimentos: intestinal de humanos y – Materias primas animales tales como aves, • Carne reptiles, animales de granja. • Leche • Aves de corral • Alimentos de origen animal • Huevos y los que están expuestos a contaminación por aguas – Manipuladores portadores residuales. • Manos contaminadas fecalmente. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Factores que hacen posible la Contaminación en carnes aparición del caso o brote:  Animales con septicemia producida por Salmonella • Tratamiento térmico  Desde el contenido intestinal y insuficiente. desde las heces que se adhieren en el pelo, en la piel y en las • Condiciones de patas de los animales cuando almacenamiento pos- llegan para el sacrificio. tratamiento inadecuadas:  Operaciones de escaldado y – Temperatura inadecuada pelado. – Tiempo excesivo  Contaminación cruzada desde canales contaminadas a utensilios, superficies de trabajo, • Contaminación pos- y desde las manos de operarios tratamiento térmico que manipulan la carne, a las piezas de carne y a la carne Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. picada. 2
  • 3. 06/12/2011  Por vía transovárica en las ponedoras Contaminación de canales de aves Contaminación (gallinas, patas y pavas) infectadas. de huevos  Penetración de la cáscara y de las  Desde la superficie del TGI membranas.  Desde la materia fecal  La superficie de la cáscara se puede existen en las patas y en contaminar durante su transito a través las plumas. de la cloaca o cuando está expuesta a un ambiente contaminado con materia  Operaciones decisivas: fecal. desplumado, evisceración y enfriamiento de las  Las salmonelas pueden penetrar el canales. huevo cuando se enfría o se lava inadecuadamente.  Contaminación cruzada: manos de los operarios,  Las salmonelas existentes en la material y utensilios superficie contaminan el agua de durante el troceado y la lavado, las superficies de contacto y las preparación. manos de los manipuladores. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Salmonella: Factores de Procedimientos de control de crecimiento y supervivencia Salmonella • El crecimiento se reduce a • No forman esporas son 1. Operación para garantizar la T° inferiores a 15°C y se capaces de sobrevivir por destrucción de las salmonelas inhibe a T° inferiores a 7°C. mucho tiempo en los en los alimentos contaminados, La T° máxima de alimentos y en otros especialmente en los productos crudos de origen animal. crecimiento es de 49°C. sustratos: – Judías verdes, remolacha, col, 2. Prevención de la contaminación • La Aw mínima es 0,94 zanahoria, apio, pepinos, de los alimentos listos para lechuga, pimientos, rábanos, comer. • El pH mínimo es 3,8 espinacas y tomates 3. Almacenamiento de los – Superficies tales como la alimentos a temperaturas bajas • Susceptible a irradiación, cerámica, el vidrio y el acero inoxidable y en la piel o elevadas que impidan el oxido de etileno y crecimiento de las salmonelas. humana, desinfectantes comerciales. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. INVESTIGACIÓN DE Salmonella EN ALIMENTOS Preenriquecimiento no selectivo 1. Pre-Enriquecimiento en medio líquido no selectivo – Agua de peptona tamponada – Caldo nutritivo – Caldo lactosado 2. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos Se incuban 25g – Caldo Tetrationato (menos usado Caldo selenito) – Caldo Rappaport de la muestra en – Caldo Selenito cistina 225ml de pre- 3. Aislamiento en placas de agares selectivos enriquecimiento – Agar sulfito bismuto (BS) por 18-24 h a – Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) – Agar Hektoen (HE) 35-37 C – Agar Salmonella - Shigella 4. Identificación bioquímica – Agar TSI – Medio LIA (K/K) – Urea Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 3
  • 4. 06/12/2011 Aislamiento en medios sólidos selectivos y Enriquecimiento selectivo diferenciales para Salmonella Se pasa 1ml del caldo de pre-enriquecimiento a un tubo con 10ml de caldo de enriquecimiento selectivo, y se incuba a 43 C en baño María por 24h Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Agar Salmonella-Shigella Agar XLD Observe las colonias lactosa negativa y sulfuro + típicas de Salmonella (Negras Obsérvese las colonias negras con borde transparente) sulfuro +. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Agar Bismuto Sulfito Agar Hektoen Observe las colonias negras típicas de Salmonella Observe la colonia negra verdosa típica de Salmonella Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 4
  • 5. 06/12/2011 Pruebas bioquímicas para Salmonella Pruebas bioquímicas para Salmonella spp. TSI LIA Citrato (-) Urea (-) SIM K-A (-) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Shigella spp. Shigella spp. Cuatro especies: • Bacilo Gram negativo • S. dysenteriae (es toxigénica produce la toxina de Shiga y la más virulenta) • Estrechamente relacionado • S. flexneri (es la especie más con E. coli por sus frecuente) propiedades bioquímicas, • S.boydii serológicas y por similitudes genéticas. • S. sonnei • No fermentar la lactosa, ser inmóvil, no produce lisina decarboxilasa y raramente produce gas a partir de hidratos de carbono Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Epidemiología: Shigella Shigella - Patogenia • Sólo infecta al hombre • Transmisión persona- persona vía fecal-oral • Niños de países subdesarrollados • Invasión y • Dosis infectante de multiplicación en el 200 bacterias por colon gramo • Respuesta inflamatoria • Hacinamiento, moscas secundaria y cucarachas • S. dysenteriae: toxina • Transmisión oral-fecal de Shiga Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 5
  • 6. 06/12/2011 Disentería bacilar Distribución en la naturaleza • Diarrea caracterizada • Agua inadecuadamente por eliminación tratada. frecuente de heces • Hortalizas crudas y las conteniendo pus, frutas, por ejemplo, la sangre y/o moco. lechuga y las fresas • Retortijones, fiebre • Moscas contaminadas alta, pérdida de por contacto con aguas apetito, náuseas, residuales o con heces vómito Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Alimentos implicados en brotes de Supervivencia en alimentos shigelosis • Leche • Sobreviven en los alimentos a -20°C, a temperaturas de • Ensalada de patatas nevera, a temperaturas • Ensalada de atún ambientales durante • Puré de patatas tiempos prolongados e • Ensalada de pavo incluso a 80°C durante unos • Leche agria pocos segundos. • Ensalada aderezada • Queso blanco • En los alimentos con pH • Budín de chocolate neutro, tales como la mantequilla y la margarina, • Manzanas estofadas huevos, en la leche, en los • Ensalada de camarones camarones y en la harina . • Arroz cocido Marcela Martínez M.Sc. • Ensalada de hortalizas Marcela Martínez M.Sc. Shigella spp. Shigella spp. Métodos de presencia/ausencia Métodos de presencia/ausencia 1. Enriquecimiento en medios líquidos selectivos 3. Identificación bioquímica – Caldo selenito • Fermentacion de glucosa, sacarosa y lactosa – Caldo para Gram positivos • Producción de ácido sulfhídrico – Caldo EE de Mossel • Descaboxilación de la lisina – Caldo Shigella • Producción de la urea • baterías comerciales miniaturizadas (por ej., Micro ID, 2. Aislamiento en placas de agares selectivos Minitek, API 20E, Enterotube II, Vitek) – MacConkey: lactosa negativo – Agar SS: Salmonella-shigella agar 4. Identificación serológica – Agar XLD: Xilosa-lisina-dexosicolato – Agar Hektoen Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 6
  • 7. 06/12/2011 Crecimiento de Shigella en SS Pruebas bioquímicas Shigella Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Shigella spp. Escherichia coli • Métodos especiales de Identificación – Sistema miniauturizados: Excelente identificación  Bacilos Gram negativos – Medios cromogénicos: Pocos – Serología:  No esporulados » Primordial para su identificación  Anaerobio facultativos • Métodos moleculares  Fermentadores – PCR » Factores de virulencia  Móviles » ial, ipaH y otros relacionados a invasividad  Agente etiológico de – Secuenciación septicemia, infecciones del tracto urinario, meningitis neonatal y gastroenteritis Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Escherichia coli Escherichia coli Enteroinvasiva • Contagio por alimentos contaminados... • La bacteria se adhiere, invade y destruye las células epiteliales... • Causa diarreas con sangre (disentería) y acuosas... • Enterotoxina codificada en un plasmidio... Enterohemorrágica • Contagio por alimentos contaminados... • Baja dosis infectiva (<100 bacterias)... • Causa desde diarreas leves hasta colítis hemorrágica... • Toxinas VT1 y VT2 codificadas en dos ECET: enterotoxígena… ECEH: enterohemorrágica… profagos. Parecidas a las tóxinas de Shigella... ECEP: enteropatógena… ECEA: enteroagregativa… ECEI: enteroinvasiva… Marcela Martínez M.Sc. ECDA: difusamente • Puede producir SHU por daño renal posterior Marcela Martínez M.Sc. adherente… a las colítis 7
  • 8. 06/12/2011 Escherichia coli Enterotoxigénica Escherichia coli… Enterotoxigénica • Contagio por alimentos o aguas • Contagio por alimentos o aguas contaminadas... contaminadas... • Causa “diarrea de viajero” leves hasta colítis • Causa “diarrea de viajero” leves hasta colítis hemorrágica... hemorrágica... • Fimbrias denominadas Factores de • Fimbrias denominadas Factores de colonización (CFA) codificadas en un colonización (CFA) codificadas en un plasmidio. plasmidio. CFAI y CFAII, se adhieren CFAI y CFAII, se adhieren específicamente al específicamente al epitelio del intestino epitelio del intestino delgado... delgado... • Toxinas STI y STII (termoestables; codificada • Toxinas STI y STII (termoestables; codificada en un transposón) y LTI y LTII (termolábiles)... en un transposón) y LTI y LTII (termolábiles)... • STI. Estimula la salida de Cl- y/o inhibe • STI. Estimula la salida de Cl- y/o inhibe absorción de NaCl. Diarrea acuosa. absorción de NaCl. Diarrea acuosa. • STII. Se cree que estimularía la salida de • STII. Se cree que estimularía la salida de HCO3-. Diarrea acuosa. HCO3-. Diarrea acuosa. • LTI. Función homóloga a la toxina del cólera. • LTI. Función homóloga a la toxina del cólera. • LTII. Rara en el humano. • LTII. Rara en Marcela Martínez M.Sc.el humano. Marcela Martínez M.Sc. Aislamientos e identificación de E. coli • Enriquecimiento E. coli - Mac Conkey – No aplica • Aislamiento en medios selectivos – MacConkey – EMB • Identificación bioquímica – Indol (+), Citrato (-), mucato (-) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. E. coli - EMB Escherichia coli Método de Recuento en placa Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 8
  • 9. 06/12/2011 Principio Enumeración de Escherichia coli β-glucuronidasa positivo Agar TBX (Triptona-Bilis-X- β-D- Medio de cultivo Glucuronido) El medio TBX contiene Temperatura de incubación 44 ± 1°C un agente cromogénico 18-24 h. (Células estresadas: 4 h a 37°C) X -D-glucuronido, que Tiempo de incubación No incubar más de 24 h !!! detecta la actividad de Placas seleccionadas para el ≤ 150 colonias típicas y ≤ 300 colonias la enzima - recuento totales glucuronidasa (GUD), Colonias típicas Azules presente en la mayoría Medio autoclavable. Permite siembra en placa vertida y en (92 a 99 %) de las cepas superficie Ventajas de Escherichia coli (no Rápido. No debe realizarse confirmación detecta la E. coli 0157) AGAR TBX bioquímica Desventaja Medio costoso Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. FDA-BAM Escherichia coli Método NMP Caldo LST 35 1 C / 24-48 2h Mineral-modified glutamate medium (Caldo) C Caldo LBVB 35 1 C / 24-48 2h 37 1 C / 24 2h Enriquecimiento Acidificación (coloración amarilla) CF Caldo EC 45,5 0,2 C / 24-48 2h Agar TBX (Triptona-Bilis-Glucuronido) 44 1 C / 20 a 24 h Colonias Típicas: azules Agar EMB 35 1 C / 18-24 h E. coli PCA Gram y Pruebas bioquímicas: Calcular el NMP en función de los tubos que dan presencia de colonias típicas en Agar TBX I M V i C y gas de lactosa (LST) Marcela Martínez M.Sc. 1 5 2 2 (días deM.Sc. Marcela Martínez incubación) Pruebas bioquímicas E. coli Yersinia enterocolítica Bacilos Gram negativos no esporulados anaerobio facultativos fermentadores inmóviles agente etiológico de peste bubónica (Y. pestis), diarreas acuosas agudas Citrato (otras especies) TSI A-A Indol + Gas + (-) Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 9
  • 10. 06/12/2011 Serotipos responsables de Yersiniosis humana Yersiniosis humana • Se presenta muy comúnmente • Solamente son en niños de menos de siete patógenos años de edad. determinados biotipos de Y. enterocolitica • Los síntomas consisten en dolor abdominal y diarrea • Cuatro serotipos (0:3; acompañada de una fiebre 0:5,27; 0:8 y 0:9) son ligera. responsables de la • Se cree que los cerdos son el mayoría de los casos de principal reservorio de yersiniosis humana. bioserotipos patógenos para las personas Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Crecimiento de Yersinia enterocolítica en alimentos Cepas ambientales • Suelo • Crece Desde -1 °C hasta +40°C. • Agua dulce • Crecimiento óptimo en torno a 29°C. • Tracto intestinal de muchos animales. • Es termosensible. • Alimentos entre los que se • Es un microorganismos incluyen la leche y los psicrótrofo y como tal es capaz productos lácteos, las carnes, de crecer a temperaturas de especialmente la de cerdo, las refrigeración. canales de las aves de corral, el • Crece a un pH de 7-8 pescado y el marisco, las frutas y las hortalizas. Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. Brotes de Yersiniosis producidos Aislamiento e identificación de Yersinia por alimentos Métodos de presencia/ausencia 1. Pre-Enriquecimiento en medio líquido • Son muy poco frecuentes 1. Incubación prolongada (7 días) a 4°C • Los cerdos son portadores 2. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) crónicos de los serotipos 3. Caldo triptona y soja (TBS) patógenos. 2. Aislamiento en agares selectivos 1. Agar Cefsulodin-Irgasan-Novobiocina (CIN) • Casi todos los brotes 2. Agar Salmonella-Shigella Desoxicolato y producidos por alimentos cloruro cálcico (SSDC) en los que se identificó un 3. Identificación con pruebas bioquímicas origen han sido atribuidos a – Agar Hierro Kliger la leche fresca o – Urea positiva contaminada pos tratamiento térmico. 4. Serotipado y biotipado Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 10
  • 11. 06/12/2011 La verdadera generosidad para con el futuro consiste en entregarlo todo al presente Albert Camus Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc. 11