Este documento describe métodos para determinar la presencia de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en alimentos. Explica el método del número más probable (NMP) y la filtración por membrana para contar estas bacterias. También detalla las pruebas presuntivas y de confirmación para identificar E. coli, así como los límites microbiológicos establecidos para diversos alimentos.

1. MICROBIOLOGÍA DE
LOS ALIMENTOS
Determinación de Coliformes Totales
y Fecales
ANNY NATALIA BRAVO
FERNANDO ROSERO

2. INTRODUCCION
La denominación de Coliformes se le otorga a todo aquel
grupo de bacterias que tienen ciertas características
bioquímicas en común y son de mucha importancia como
indicadores de contaminación del agua y de los
alimentos. Por las malas practicas de higiene del
operador o también por la contaminación desde la
fuente o lugar de donde se obtuvo la materia prima,
equipos y utensilios

3. Escherichia Coli.
Normalmente vive en el intestino del hombre y de los
animales y no suele causar ningún tipo de problema grave,
crece a 37C, es necesaria para el funcionamiento correcto del
proceso digestivo. Sin embargo, algunas cepas
por intercambio de material genético, han adquirido la
capacidad de causar infecciones y provocar diarreas
sangrantes.
Escherichia coli 0104 H2 . Produce una potente toxina que Se
desarrolla en el intestino y después, a través de la
mucosa, pasa a la sangre.

4. Coliformes totales
• Familia Enterobacteriaceae
• Fermentan lactosa, producción de gas a 35 – 37°C en 48 hr,
• Bacilos gram negativos,
• No formadores de esporas
• Malos hábitos de manipulación
• Son útiles para indicar contaminación postproceso térmico
• (Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia)
• Leche cruda, vegetales, carne, suelo, agua y semillas. y otros alimentos
crudos
• se eliminan fácilmente por tratamiento térmico.

5. Coliformes fecales
• Fermentan lactosa, producción de gas a una temperatura de 44,5 a 45,5°C
• Malos hábitos de manipulación
• Informa sobre las condiciones higiénicas del producto y eventual presencia de
patógenos.
• E. coli y cepas de Enterobacter (Salmonella y el de Shigella), Citrobacter y
Proteus.
• Salmonella. Son bacilos, gram negativos, aerobios no pigmentos sobre los
medios de cultivo, granjas de animales, aviares, personas portadoras.
• Shigella. Son bacilos, gram negativos, aerobios y mesófilos. pueden producir la
disentería bacilar y trastornos intestinales.
• E. coli Bacterias bacilos cortos, gram negativas. tracto intestinal del hombre y
de los animales,
• Agua embotellada, leche, jugos, alimentos infantiles, y alimentos procesados,
en general.

6. MÉTODOS DE DETECCIÓN DE
CONTAMINACIÓN MICROBIANA
para implementar cualquier método de
detección, se requiere preparar las muestras del
alimento, lo que generalmente consiste en la
elaboración de diluciones que permitan
disminuir la concentración del microorganismo
en la muestra y poder observar mejor. Una vez
que se han elaborado las diluciones se procede a
la utilización de cualquiera que sea el método
seleccionado.

8. determinación de coliformes totales
1. Recuento en placa (SPC o REP) Es el método más
utilizado para la determinación del número de células
viables o unidades formadoras de colonias (U.F.C.) en un
alimento. Los recuentos de microorganismos viables se
basan en el número de colonias que se desarrollan en
placas previamente inoculadas con una cantidad
conocida de alimento (dilución) e incubadas en unas
condiciones ambientales determinadas. Para la
dilución se suele utilizar agua de peptona tamponada
o Ringer ¼). Por su parte, las diluciones se inoculan
en placas vertidas de agar triptona glucosa extracto o
agar cuenta estándar. Las placas se incuban en
condiciones de aerobiosis, a 35 °C durante 24 a 48
horas. Luego se aplican las reglas para el recuento,
establecidas para este método. Se utiliza luego un
contador de colonias Quebec.

9. 2. Método del número más
probable (MPN o NMP)
se utilizan un total de nueve tubos con
medio de cultivo, en tres de los cuales se
siembra 0,1 g. de muestra, en tres 0,01 g y
en los otros tres restantes 0,001 g. Luego
de la incubación, se observan y se cuentan
el número de tubos positivos. Se puede
considerar como positivos aquellos tubos
en los que: Hubo crecimiento que se
detecta como aparición de turbidez
(siempre que la muestra sembrada no
enturbie el medio).

10. El resultado 3-1-0 se busca en la tabla del NMP y se obtiene un valor de 43/g
o ml

13. Método de detección de coliformes fecales
Los coniformes fecales tienen significado
sanitario y se les considera como
presuntos Escherichia coli. Se utilizan dos
tipos de procedimientos para hacer la
prueba de los coliformes. Son el
procedimiento del número más probable
(MPN), y el de filtración a través de una
membrana (MF). El método MPN ya ha
sido explicado anteriormente.

14. Filtración por membrana
En el método más común por filtración (MF), la
muestra de alimento se pasa a través de un filtro de
membrana estéril, que tiene las bacterias y luego el
filtro se encuba en un medio de cultivo. Una de las
ventajas del método de filtración a través de
membrana es la prontitud con que pueden
obtenerse los resultados y, en consecuencia, se
pueden llevar a cabo rápidamente acciones
correctivas. Esta técnica puede aplicarse en el
análisis de casi todos los tipos de agua, también se
utiliza en el análisis de leche y otros alimentos
líquidos.

16. Resultado se procederá a seleccionar aquellas membranas que
tienen entre 20-60 colonias azules. Las colonias son contadas
utilizando un microscopio estereoscópico con 10-15 x de
aumento y luz fluorescente para el cálculo de coliforme fecal se
utiliza la siguiente formula:
Ejemplo:
Si tenemos 60 colonias contadas en un
volumen de 0.01 ml de nuestra original filtrada,
tendremos:
= (60 / 0.01)*100
= 600.000 fecales
Se reporta: 600.000 coliformes fecales/100 ml

17. Determinación del numero mas
probable para coliformes
fecales
En general niveles altos de coliformes indican
manipulación y elaboración deficientes de los
alimentos. La determinación se hace a partir de la
segunda etapa (confirmativa) del método de NMP,
cultivando en caldo lactosado con incubación a 44.5
°C. Generalmente se combinan las determinaciones,
según se requiere. Para determinar coliforme con el
método MPN es importante que tomemos en cuenta
las siguientes etapas.
1. Prueba presuntiva • Caldo Lauril Triptosa (CLT). •
Caldo Mc. Conkey. • Caldo lactosa. • Medio EC.
2. Prueba confirmativa: • Medio EC. • Medio bilis
lactosa (BLVB)

18. MÉTODO DE DETECCIÓN
DE ESCHERICHIA COLI
Se caracteriza por ser coliforme termotolerante (fermenta
lactosa a 44.5°C)
produce indol a partir de triptófano y glucuronidasa
Cuando su número supera 1/ml ó de I0/gr
Agar de MacConkey a 44 ,5 °C (entre 3 y 10 colonias)
Se someten a la prueba de Mackenzie-Taylor-Gilbert (MTG)
Cuando el número de células de E. coli minimo se realizan las
pruebas de presencia o ausencia o una determinación por el
método del NMP

19. IDENTIFICACION DE
E. COLI

20. Especificaciones microbiológicas
establecidas para diversos alimentos.

22. Valores promedios de coliformes totales y fecales (NMP/ml o g) en los
diversos alimentos.

23. A TENER
ENCUENTA

24. Recuento por el número mas probable (NMP) de coliformes,
coliformes fecales y deE. coli.
Origen Coliformes, coliformes fecales y E. coli se emplean como “microorgnaimsmos indicadores”. Su presencia
puede deberse a: elaboración inadecuada, contaminación del alimento ya preparado, o crecimiento en
el alimento.
Coliformes fecales y E. coli pueden indicar contaminación fecal, que pueden vivir en ambientes no
intestinales, incluyendo instalaciones industriales.
Límites de
tolerancia
Los recuentos de microorganismos indicadores deben compararse con los límites de tolerancia definidos
por la legislación, cuyas especificaciones están unidas al método utilizado para definir los límites
Limitaciones El método del número mas probable (NMP) se aplica para recuento de coliformes, coliformes fecales y de
cepas gasógenas (aerógenas) de Escherichia coli. El método no sirve para aislar ni contar serotipos de E.
coli asociados a enfermedades humanas, Tales cepas no dan positiva la reaccion de los coliformes fecales
y por tanto ni pueden detectarse ni contarse con este método.
Alimentos que
se aplica
Alimentos de cualquier tipo, sus ingredientes y agua, incluyendo la de la instalación donde se prepara el
alimento.

25. Progresividad del
método
a) Se determina la presencia de coliformes (prueba presuntiva)
b) Determina si los cultivos que contienen coliformes contienen además coliformes fecales
C) finalmente se confirma la presencia de E. coli
Inoculación Tres o mas diluciones decimales de la muestra se inoculan en un medio de cultivo líquido (en tubos) y
se incuban a temperatura definida durante un tiempo definido El número mas probable de
microorganismos de los tres grupos se calcula sobre una tabla estadística estándar del
NMP utilizando el número de cultivos que indican la presencia o ausencia de estos microorganismos.
Presunción Prueba presuntiva de la presencia de coliformes: producción de gas en caldo LST que se interpreta
producido por fermentación de lactosa.
Confirmación Presencia de coliformes: producción de gas en caldo BGLB
Presencia de coniformes fecales: producción de gas a 44.5 o 45,5oC en caldo
Presencia de E. coli : los cultivos positivos en caldo EC se siembran en estrías sobre agar L-EMB Las
colonias con centro oscuro con o sin aspecto metálico confirman la presencia de E. coli.