Este documento describe las técnicas histológicas utilizadas para estudiar los tejidos. Explica que la histología estudia la estructura microscópica de los tejidos y cómo se clasifican en tejidos vegetales y animales. Detalla los pasos de fijación, inclusión, corte e identificación de componentes mediante colorantes y métodos histoquímicos y cómo se observan los tejidos utilizando diferentes tipos de microscopía como la óptica, de contraste de fase e interferencia.

1. Histología.
Técnicas histológicas.
Microscopía.
Prof. Tomás Atauje Calderón
Histología
Obstetricia – Ciclo III

2. Histología
• Proviene de los vocablos griegos:
▫ “Histos”: Tejido
▫ “Logía”: Tratado o estudio
• Es una disciplina que estudia todo lo relacionado
con los tejidos orgánicos, su estructura
microscópica, su desarrollo y sus funciones.
• También se le puede llamar Anatomía microscópica,
ya que no solo estudia los tejidos sino que también
observa el interior de las células.
• Las primeras investigaciones histológicas fueron
posibles gracias a la incorporación del microscopio a
los estudios anatómicos.

3. Clasificación
• Ya que solo se reconoce la presencia de tejidos en
dos grupos de organismos, se consideran dos tipos:
▫ Histología vegetal: Estudio de los tejidos vegetales
(plantas vasculares).
▫ Histología animal: Estudio de los tejidos animales
(metazoos).
*Solo se consideran 4 grupos fundamentales dentro
de los tejidos animales: Epitelial, conectivo (el más
diverso), muscular y nervioso.

4. Técnicas histológicas
• Casi todos los componentes de las células y de la matriz extracelular
son transparentes, así que para diferenciar los tejidos usaremos
colorantes. Sin embargo la mayoría de los colorantes son tóxicos y
las células vivas no los resisten.
• Par tal motivo, antes de ser coloreados, los tejidos son fijados, es
decir, muertos mediante procedimientos que producen la menor
distorsión posible de las células y de la matriz extracelular; incluidos
en materiales dotados de cierta consistencia y cortados en laminillas
muy delgadas, capaces de ser atravesadas por la luz.
• La mayoría de los preparadas histológicos que el estudiante observa
con el microscopio óptico corresponden a tejidos fijados con formol
al 10%; incluidos en parafina, cortados en laminillas muy delgadas y
coloreados con hematoxilina y eosina.
*Las piezas se extraen después de matar al animal mediante una sobredosis de
anestésico o por un traumatismo craneano; también se utiliza material
procedente de biopsias 0 de autopsias humanas (que deben ser realizadas
inmediatamente después de producida la muerte).

5. Fijación
• La fijación del material es esencial para preservar la morfología y la composición
química de los tejidos y las células. Consiste en la muerte de estas ultimas de
una manera tal que las estructuras que presentan en vida se conserven con un
mínima distorsión.
• La elección del fijador depende del estudio que se desea realizar. En lo posible,
el fijador debe: Actuar con rapidez, matando a las células antes de que
aparezcan los fenómenos agónicos; poseer un alto grado de penetración, a fin de
que se fijen todas las partes de la pieza; conservar los detalles estructurales que
presentaban los tejidos cuando estaban vivos; evitar que desaparezcan ciertos
compuestos tisulares y favorecer los siguientes pasos, como la inclusión, el corte
y la coloración del material.
• Conviene fijar piezas pequeñas, que no excedan el centímetro de lado. El
volumen del fijador debe ser 40 a 50 veces superior al volumen de las piezas. La
fijación con formol al 10% dura unas 6 horas. Para estudios que exigen una muy
buena conservación de las estructuras, el fijador se perfunde por vía sanguínea
en el animal anestesiado, lo cual permite que llegue rápidamente a todos los
tejidos.

7. Inclusión
• Para que el material pueda ser cortado en laminillas muy delgadas debe ser
incluido en un material que le confiera cierta consistencia. Si el tejido va a
ser coloreado con métodos convencionales, se lo suele incluir en parafina,
que es sólida a la temperatura ambiente pero funde entre los 50 y los 60 °C.
• Por último, la pieza se sumerge en un pequeño recipiente cúbico con
parafina líquida (fundida a unos 55 °C), que al enfriarse se convierte en un
bloque sólido llamado vulgarmente taco, con el tejido incluido en su
interior.
• El taco se corta mediante instrumentos llamados micrótomos, que permiten
obtener laminillas de 2 a 15 μm de espesor, suficientemente delgadas como
para que la luz pueda atravesarlas. Cada corte es montado sobre un
portaobjeto y despojado de la parafina mediante baños de xileno.
• Cuando se desea mantener la composición quimica de ciertos componentes
celulares, se emplean micrótomos dentro de cámaras enfriadas con CO2
líquido lIamados micrótomos de congelaci6n 0 criostatos.
• Debido a que producen una aceptable fijación y no requieren inclusión,
permiten efectuar cortes de tejidos frescos, destinados a la realización de
estudios citoquímicos.

8. Micrótomo

9. Coloración
• La mayoría de los colorantes histológicos son sales de naturaleza
orgánica. Se clasifican en básicas y ácidas. En los primeros, el grupo
cromóforo es básico (catiónico), pues es capaz de unirse con grupos
tisulares de carga negativa. En cambio, en los segundos el grupo
cromóforo es acido (aniónico), pues se combina con grupos tisulares
de carga positiva.
• La mayoría de los preparados que analizan los estudiantes están
teñidos con hematoxilina y eosina. La hematoxilina tiñe los núcleos
de color violeta oscuro y la eosina tiñe los citoplasmas y la matriz
extracelular con distintos tonos de rojo.
*Los componentes de los tejidos que se tiñen con colorantes básicos se
llaman basófilos; los que se tiñen con colorantes ácidos se llaman
acidófilos.
• Una vez terminado el proceso de coloración. se coloca sobre el
preparado una laminilla cubreobjeto, que se adhiere con un líquido
especial (bálsamo de Canadá).

11. Métodos histoquímicos
• Los métodos histoquímicos permiten identificar
compuestos químicos en sus localizaciones tisulares
originales. Estos métodos no sol0 son cualitativos
sino también cuantitativos.
• Además, a veces involucran el estudio de los
cambios dinámicos producidos en el contenido
químico durante distintos estadios funcionales de
los tejidos. L0 cual ha permitido establecer la
función de algunos componentes tisulares en varias
procesos metabólicos.

12. Histoquímica
• Para la determinación histoquímica de una sustancia se deben cumplir los
siguientes requisitos:
▫ Debe ser inmovilizada en su posición original.
▫ Debe ser identificada por un procedimiento que sea especifico para ella 0 para un
grupo químico que contenga.
• Para detectar proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y lípidos se emplean
agentes cromógenos que son capaces de unirse selectivamente a
denominados grupos químicos de esas moléculas.
• Entre ellos tenemos:
• Reactivo de Schiff: Es selectivo de los grupos aldehído, de modo que sirve para
detectar el ADN y algunos lípidos e hidratos de carbono.
• Reacción de Feulgen: EI ADN puede ser detectado por medio de la reacción de
Feulgen. Para ello, los cortes del tejido fijado se someten a una hidrólisis ácida débil y
luego se tratan con el reactivo de Schiff.
• Reacción de PAS (Periodic Acid-Schiff): Se basa en la oxidación, mediante el
ácido peryódico, de los grupos glicólicos 1-2' de los polisacáridos, lo cual produce la
liberación de los grupos aldehído, que entonces reaccionan con el reactivo de Schiff.

13. Histoquímica
• Colorantes liposolubles: La detección de lípidos en tejidos fijados por
congelación puede lograrse mediante el tetróxido de osmio (ácidos grasos
no saturados de los triacilgliceroles), Sudan IV o rojo escarlata (gotas
lipídicas) y Sudan negro B (fosfolípidos y colesterol).
• Estudio de las enzimas: Para que ciertas enzimas puedan ser reveladas,
los cortes deben realizarse can el crióstato. Otras resisten una breve fijación
en acetona fría, formaldehido 0 glutaraldehido.
• Fluorescencia: Los componentes tisulares pueden ser descubiertos por la
fluorescencia que emiten, que puede ser natural (derivada de sustancias
normales de los tejidos) o secundaria (inducida por colorantes fluorescentes
llamados fluorocromos). Algunas proteínas pueden ser marcadas con los
fluorocromos mencionados, ser inyectadas en el animal y detectadas en las
céulas o en la matriz extracelular.
• Trazadores: Permiten detectar las vías de transporte de ciertas sustancias,
tanto dentro de las células como fuera de ellas. Los trazadores suelen ser
enzimas cuyos productos son opacos a los electrones.

14. Inmunohistoquímica
• Se basa en las propiedades antigénicas de las proteínas
tisulares que pueden detectarse mediante anticuerpos
marcados. Cada anticuerpo posee dos sitios de fijación para
la proteína (0 antígeno).
• Una vez formado, el complejo antígeno-anticuerpo se conjuga
con marcadores especiales, los cuales se revelan con la ayuda
del microscopio óptico común, del microscopio de
fluorescencia o del microscopio electrónico.
• El anticuerpo puede unirse a las enzimas peroxidasa, fosfatasa
alcalina o galactosidasa; también puede conjugarse con
fluorocromos o con ferritina.
*Otra técnica inmunohistoquímica (que utiliza el microscopio
electrónico) se basa en el usa de partículas de oro coloidal.

15. Radioautografía
• Se basa en la marcación de ciertas sustancias con un
radioisotopo, el cual se descubre porque es capaz de
interactuar con los cristales de bromuro de plata de las
emulsiones fotográficas.
• Así, tras ser marcada, la sustancia que se investiga se
incorpora al tejido y se localiza en el preparado histológico
mediante una emulsión fotográfica. Para ello, el preparado se
pone en contacto con la emulsión fotográfica durante un breve
periodo y la radioautografía se revela como una fotografía
común.
• La localización del radioisotopo (que se distingue porque
forma puntitos brillantes sobre un fondo oscuro) se descubre
cuando la radioautografía se superpone a la imagen de un
corte tisular inmediato, procesado para ser visto con el
microscopio óptico o con el microscopio electrónico.

17. Miscroscopía
• Conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los
objetos de estudio que, por ser pequeños, están fuera del rango de
visión normal.
• Anton Van Leewenhoek logró fabricar lentes lo suficientemente
poderosos para observar bacterias hongos y protozoos (animáculos).
• El primer microscopio compuesto fue desarrollado por Robert
Hooke, quien estudió cortes de corcho y denominó a los pequeños
poros en forma de caja que había observado como “células”.
• El proceso de la microscopía se basa en hacer pasar un haz de luz
visible a través de lentes ópticos (simples o múltiples) para lograr
una vista ampliada de la muestra. Las imágenes resultantes pueden
ser observadas directamente; impresas en una placa fotográfica o
registradas digitalmente.

18. Microscopio óptico
• Consta de dos sistemas de lentes convergentes llamados
objetivo y ocular que están separados por una distancia
definida y alineados en un mismo eje. Al sumarse sus
respectivos aumentos, ambos sistemas concurren para la
formación de la imagen microscópica definitiva.
• Un microscopio óptico de modelo mediano (monocular 0
binocular) que habitualmente es usado por los estudiantes,
posee una parte mecánica y una parte óptica.
• La parte mecánica es la montura del microscopio. Está
representada por el pie, la columna, el tubo, los mecanismos
de movimiento, la platina y la subplatina. La parte óptica está
compuesta por el objetivo, el ocular y el aparato de
iluminación.

19. Microscopio óptico y Estereoscopio

20. Microscopio de contraste de fase
• Se utiliza para estudiar las células y los tejidos vivos. Aprovecha los
cambios (retrasos) de fase que se producen en los rayos de luz
cuando atraviesan ciertas estructuras biológicas.
• Los componentes celulares poseen índices de refracción diferentes
de los del medio, de modo que, si bien la amplitud de onda de la luz
que los atraviesa no cambia, si lo hace su velocidad, que se retrasa
(cambio de fase). Este retraso ocurre en el interior del material
observado y prosigue después que el rayo lo abandona.
• En este microscopio, los rayos periféricos atraviesan el objetivo con
un adelanto o un retraso de un cuarto de longitud de onda respecto
a los rayos centrales, que son los que inciden sobre el preparado.
Debido a que las dos longitudes de onda se suman, cuando hay una
diferencia positiva a favor de los rayos centrales, el material aparece
mas brillante que el medio que lo rodea. En cambio cuando la
diferencia es negativa, el material aparece mas oscuro que el medio.

21. Microscopio de contraste de fase

22. Microscopio de interferencia
• Se basa en principios similares a los del microscopio
de contraste de fase, pero tiene la ventaja de
proporcionar resultados cuantitativos.
• Este instrumento es capaz de discriminar
diferencias muy pequeñas entre los índices de
refracción.
• Además las variaciones de fase pueden generar
colores a veces tan acentuados que parece que las
células vivas fueron teñidas.

23. Microscopio de interferencia

24. Microscopio de fondo oscuro
• En este microscopio la luz se dispersa en el deslinde entre los
componentes celulares, siempre que estos posean índices de
refracción distintos.
• El microscopio posee un condensador que ilumina el material
de manera oblicua. La luz directa no ingresa en el objetivo, de
modo que, a causa de la dispersión de la luz, el material brilla
en media de un fondo oscuro.
• Por ejemplo, en una célula cultivada, el nucléolo, la
membrana celular, las mitocondrias y las gotas de lípidos
aparecen brillantes y se destacan sobre el fondo oscuro del
resto del citoplasma.
• Por medio de este instrumento se pueden descubrir
estructuras mas pequeñas que las que se ven con el
microscopio óptico común.

25. Microscopio de fondo oscuro

26. Microscopio de luz ultravioleta
• Emplea una luz cuya longitud de onda mide menos de la
mitad de la longitud de onda de la luz visible, lo que le permite
aumentar el poder de resolución del objetivo. Además, debido
a que la luz ultravioleta es invisible para el ojo humano pero
impresiona las películas fotográficas, el ocular de este
microscopio se halla acoplado a una cámara fotográfica.
• Como los rayos ultravioletas no atraviesan el vidrio, se utilizan
objetivos cuyas lentes son de cuarzo (material que también se
usa para fabricar los portaobjetos y los cubreobjetos). Y ya que
estos rayos dañan la vista, es necesario observar los
preparados con lentes protectores.
*El microscopio de luz ultravioleta se emplea para detectar los ácidos
nucleicos (revela sus bases purínicas y pirimidínicas).

27. Microscopio de luz ultravioleta

28. Microscopio de polarización
• Difiere de los microscopios ópticos comunes porque posee dos
elementos adicionales: El analizador, situado entre el observador y
el objetivo; y el polarizador, que se encuentra por debajo del
condensador. Ambos contienen unos cristales especiales.
denominados prismas de Nicol, que polarizan la luz (la hacen vibrar
en un solo plano).
• Este microscopio se basa en el comportamiento de la luz polarizada
cuando atraviesa los elementos tisulares. Así, cuando los atraviesa
siempre a la misma velocidad (cualquiera que sea el plano de
incidencia) se dice que son isótropos 0 monorrefringentes, pues
poseen un solo índice de refracción. En cambio, si los atraviesa a
velocidades que varían según el plano de incidencia de la luz, se dice
que son anisótropos o birrefringentes, debido a que los elementos
poseen dos índices de refracción distintos (dos velocidades de
transmisión de la luz polarizada).

29. Microscopio de polarización

30. Microscopio de fluorescencia
• Cuando la luz ultravioleta incide sobre ciertos
componentes tisulares hace que emitan colores de
longitudes de onda superiores a las originales, los
cuales se destacan en un fondo oscuro.
• Al igual que con el microscopio de luz ultravioleta, el
operador debe proteger su vista de las radiaciones.
• Este microscopio se utiliza cuando se realizan
estudios histoquímicos e inmunohistoquímicos
basados en el uso de colorantes fluorescentes.

31. Microscopio de fluorescencia

32. Microscopio confocal
• Es capaz de revelar las estructuras de los tejidos con gran
nitidez, puesto que el preparado es iluminado con rayos láser,
que enfocan un solo plano del tejido y lo recorren
horizontalmente punta por punta. Para ello, el microscopio
confocal utiliza un sistema de espejos móviles que desplazan a
los rayos láser sin que abandonen el plano enfocado. Además,
las imágenes de los planos del tejido situados par arriba y por
debajo son eliminadas por una computadora acoplada al
microscopio.
• Dado que se pueden analizar todas las capas del preparado y
que las imágenes derivadas de cada capa pueden guardarse en
la memoria de la computadora, es posible (mediante un
programa especial) confeccionar imágenes tridimensionales
del tejido.

33. Microscopio confocal

34. Microscopio electrónico de transmisión
• Es un instrumento que permite conocer la ultraestructura de las
células y de la matriz extracelular, ya que posee un poder de
resolución mayor que el del microscopio óptico. Utiliza la propiedad
que tienen los haces de electrones de ser desviados por un campo
electrostático o electromagnético, de la misma forma que un rayo de
luz se refracta cuando atraviesa una lente.
• EI poder de resolución del microscopio electrónico es tan alto que la
imagen del objetivo puede ser aumentada por el ocular en una
proporción mucho mayor que la lograda con el microscopio óptico.
Así, con un aumento inicial del objetivo de 100x, se puede ampliar la
imagen con la bobina proyectora unas 200 veces, lo que equivale a
un aumento de 20.000x.
• Con los instrumentos modernos se obtienen incrementos todavía
mayores. ya que poseen lentes intermedias que permiten lograr
aumentos de hasta 1.000.000x. Además, los negativos fotográficos
pueden a su vez ampliarse.

35. Microscopio electrónico de transmisión

36. Microscopio electrónico de barrido
• Con el microscopio electrónico de barrido o SEM (Scanning
Electron Microscope) se pueden obtener imágenes topográficas
tridimensionales de los materiales sujetos a estudio.
• Emplea un haz de electrones que actúa sobre la superficie del
material, cuyas moléculas, al ser excitadas emiten un delgado haz de
electrones secundarios, los cuales adquieren un movimiento similar
al observado en los tubos de rayos catódicos.
• Debido a que estos electrones son desviados hacia un tubo
fotomultiplicador, genera imágenes en una pantalla de televisión
para aumentar el poder dispersante de las estructuras situadas en la
superficie de la muestra. Ésta se recubre con un metal pesado, que
debe evaporarse en una cámara de vacío; la muestra se hace tratar
para que el metal se deposite de manera uniforme en toda la
superficie.
*Se ha logrado una combinación del microscopio electrónico de barrido con el
de transmisión llamado STEM (Scanning-Transmission Electron
Microscope).

37. Microscopio electrónico de barrido