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Subido porNicole Salgado Cortes
Inmunofluoresencia
La inmunofluorescencia es una técnica que permite la localización de moléculas en muestras mediante anticuerpos unidos a fluoróforos. El proceso incluye preparar células, fijación, permeabilización, bloqueo, marcaje con anticuerpos y montaje, asegurando una señal específica mientras minimiza interacciones inespecíficas. Se destacan diferentes métodos de amplificación de señal y la importancia de controles experimentales y contratinciones.
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Inmunofluoresencia
- 1. INMUNOFLUORESCENCIA UNA BREVE INTRODUCCIÓN NicoleSalgado Cortes MSc Microscopy & Imaging03 l 11 l 2017
- 2. INMUNO FLUORESCENCIA (especificidad) (señal) INMUNOFLUORESCENCIA LATÉCNICA Marca específica de una molécula por un anticuerpo unido a un fluoróforo, lo que permite la localización de esta molécula en la muestra.
- 3. COMPONENTE INMUNO ANTICUERPOS ANTÍGENO =molécula extraña al organismo que es reconocida por un anticuerpo (molécula de interés). ANTICUERPO = proteína del sistema inmune que actúa específicamente contra un antígeno dado
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- 5. Aequorea victoria COMPONENTE FLUORESCENTE FLUORÓFOROS Lasmoléculas fluorescentes absorben la luz de un determinado color (longitud de onda) y emiten luz de otro color. Este fenómeno persiste sólo mientras la luz estimulante continúe.
- 6. Estado basal No excitado Absorción 560nm Emisión 620 nm COMPONENTE FLUORESCENTE FLUORESCENCIA
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- 8. MICROSCOPÍA MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA FILTROS OCULARES LENTESOBJETIVOS PLATINA LÁMPARA DE MERCURIO CONTROL DE ENFOQUE AL DETECTOR DE LA LAMPARA ESPEJO DICROICO FILTRO DE EXCITACIÓN FILTRO DE EMISIÓN Longitud de onda (nanómetros) Características espectrales de fuentes de luz fluorescentes Intensidadrelativa
- 9. PROTOCOLO INMUNOFLUORESCENCIA PASO APASO Diseño experimental Preparar las células o tejido Fijación Permeabilización Bloqueo Marca con anticuerpos Contratinción Montaje
- 10. DISEÑO EXPERIMENTAL ¿Qué busco? ¿Quénecesito? ¿Cómo lo hago? Controles experimentales Selección de anticuerpos Selección de fluoróforos
- 11. PREPARACIÓN DE CÉLULAS CÉLULAS/TEJIDOEN BUEN ESTADO CONFLUENCIA APROPIADA TRATAMIENTOS Baja confluencia Alta confluencia Figura: Efecto de la confluencia en la morfología celular. Líneas celulares de pulmón CV-1 (A y B), IMR-90 (C y D), y 16HBE (E y F) en condiciones de baja y alta confluencia. Evitar cultivos celulares contaminados o tejidos rotos. Puede afectar la localización de la señal y/o la morfología celular. Considerar incubación previa a la fijación de las células.
- 12. FIJACIÓN La fijación preservala imagen “viva” rápidamente, mientras detiene los procesos degenerativos de autolisis y la acción de enzimas endógenas. PRECIPITANTESCROSS-LINKERS Los aldehídos reaccionan y forman cross-links con las estructuras, estabilizando y endureciendo la muestra. Desplazan el agua alrededor de las macromoléculas celulares, resultando en su desnaturación y precipitación in situ.
- 13. PERMEABILIZACIÓN Cuando la membranaplasmática queda intacta en la fijación, es necesario permeabilizar la célula para permitir el paso de los anticuerpos a su interior. Sin permeabilizar Permeabilización suave Digitonina Permeabilización fuerte Triton X-100
- 14. CÉLULA BLOQUEO Las mismas fuerzasque gobiernan interacciones especificas contribuyen a uniones inespecíficas. Interacciones hidrofóbicas. Interacciones iónicas Enlaces de hidrógeno El bloqueo con suero minimiza las interacciones no especificas, que resultan en señal background y falsos positivos.
- 15. MARCA CON ANTICUERPOS REACTIVIDAD ESPECIFICIDAD Esel anticuerpo apropiado para mi antígeno? Se une específicamente a un antígeno único? CONCENTRACIÓN CLONALIDAD Monoclonal o Policlonal? + -
- 16. MARCA CON ANTICUERPOSAMPLIFICACIONDE LA SEÑAL DIRECTA INDIRECTA ABC LSAB BASADO EN POLIMEROS TIPOESQUEMACARACTERISTICAS Utiliza el complejo de alta afinidad Avidina-Biotina Más sensible que la IF indirecta. Solo anticuerpo primario. Más rápido y con menos pasos Requiere un anticuerpo secundario. Más flexible y más sensible que la IF directa. Utiliza el complejo de alta afinidad Strepto Avidina- Biotina, de menor tamaño. Más sensible que la IF indirecta. Utiliza un polímero de fluoróforos. Mas rápido, con menos pasos y más sensible que ABC y LSAB.
- 17. CONTRATINCIÓN Las contratinciones nossirven como punto de referencia y permiten ubicarnos dentro de la célula o tejido. En general se utilizan tinciones que marcan el DNA o el citoesqueleto.
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Notas del editor
- #3 La inmunofluorescencia es una poderosa técnica que permite identificar estructuras y compuestos específicos en una muestra
- #6 En el exoesqueleto de insectos, o en insectos bioluminiscentes como las luciérnagas, en hongos y anémonas marinas, en nudibranquios, en minerales y en medusas como esta (la Aequorea victoria) de donde se aisló el gen de la protenia fluorescente verde o GFP
- #9 Existen diversas fuentes de luz para microscopio de fluorescencia, y cada una de estas lamparas posee un espectro de emisión diferente. Como podemos ver en el diagrama, algunas emiten mayormente en el espectro UV (mercurio y metal) mientras otras emiten en el espectro del rojo lejano (tungsteno) Debido a que las fuentes de luz emiten en un rango de longitudes de onda, se deben usar filtros para seleccionar la longitud de onda particular que necesitamos para nuestro fluoroforo. Estos filtros usualmente vienen en el formato de cubos y se componen principalmente de tres filtros: un filtro de EXCITACION que selecciona la longitud de onda usada para excitar el fluoroforo. Un filtro de EMISION que selecciona la longitud de onda de la luz emitida por el fluoroforo. Un ESPEJO DICROICO que permite reflejar la luz de excitacion hacia la muestra, pero que solo deja pasar la luz de emisión. Sin este filtro podría haber contaminación de luz de dos colores distintos y una detección errónea de la señal.
- #13 - La fijacion es un paso critico de la IF. Su objetivo es preservar la estructura celular lo mas parecido a su estado nativo. Cross linkers These fixatives crosslink proteins via free amine groups, forming intermolecular bridges and a network of linked antigenic proteins Precipitantes: act as strong dehydrants and cause the precipitation of cellular proteins. While these fixatives are effective at preserving cellular architecture, they can remove small soluble molecules and lipids
- #14 Si se utiliza un metodo de fijacion por cross-linking, la membrana plasmatica quedará intacta
- #15 Common buffers to block non-specific interactions are serum, BSA, casein, or commercial buffers
- #16 MONOCLONAL: producido a partir de una única celula inmunoe, reconoce solo un epitope de un antígeno (muy especifico pero poco sensible). POLICLONAL: producido a partir de un grupo de células inmunes, puede reconocer distintos epitopes de un mismo antigeno
- #17 A una stretavidina avidina se unen multiples biotinasconjugadas con fluorofors
- #19 After staining, cells on coverslips must be mounted onto microscope slides prior to imaging. The use of mounting media protects stained cells from dehydration and makes the sample suitable for microscopy. It is important to match the refractive index of your mounting media with microscope objectives to generate high-quality images.