El documento proporciona información sobre Clostridium botulinum, la bacteria que produce la toxina botulínica. Describe las características de C. botulinum, incluyendo su morfología, hábitat y mecanismo de transmisión. También explica los procedimientos para el aislamiento e identificación de la bacteria a través de pruebas bioquímicas y la detección de toxinas mediante la inoculación en ratones.

1. ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERAL
DOCENTE: Blgo. WILBER ZUÑIGA
INTEGRANTES: JUNIOR GALVEZ VENEGAS
PAUL VARA ZAMALLOA
J.JOSE HUARCA SUTTA

3. INTRODUCCION
• BOTULUS
• 1897:
• B. heridas
• B. lactantes
1870
Primera descripción de
C. BOTULINUM
toxina
VAN ERNENGEM

4. CLOSTRIDIUM BOTULINUM
REINO Bacteria
DIVISION Firmicutes
CLASE Clostridia
ORDEN Clostridiales
FAMILIA clostridiaceae
GENERO clostridium
ESPECIE clostridium botulinum

5. CLOSTRIDIUM
BOTULINUM
Bacilos Gram positivos
4-8 micras
Es móvil, flagelo con esporas
Anaerobio
20 – 30 °C
PH 7.2 a 7.4
FUENTE DE INFECCION SUELO
HABITAT INTESTINO DE ALGUNOS ANIMALES
MECANISMO DE TRANSMICION ALIMENTOS

6. • Se adquiere por la ingestión de
alimentos enlatados (carnes o
verduras). Aquí se encuentran las
esporas de C. botulinum.
• Las esporas germinan si la
esterilización no fue correcta, debido
a que en estos productos se forma un
ambiente de anaerobiosis.
• Tiempo de incubación variable y
depende de la cantidad ingerida.
Promedio 12 – 36 horas.
BOTULISMO

7. .
MEDIOS DE CULTIVO E INCUBACIÓN
MEDIOS SÓLIDOS.- Se pueden utilizar son el agar sangre o yema de huevo,
el agar Brucella con 5% de sangre ovina y el agar alcohol feniletílico con
sangre.
MEDIOS LÍQUIDOS.- Incluyen un medio de almidón, glucosa y carne picada,
un medio de carne cocida, un medio clostridial reforzado, caldo anaerobio y
otros.
En los medios sólidos, las colonias de C. botulinum a menudo son de un
color blanco grisáceo con un borde irregular. Las colonias son
generalmente betahemolíticas en agar sangre, mientras que en un medio
de yema de huevo, con frecuencia muestran iridiscencia en la superficie,
que se extiende más allá de la colonia (lipasa positiva), y son variables
para la actividad de la lecitinasa. La zona iridiscente que rodea la
colonia tiende a ser mayor para las toxinas C, D y E.

8. Especie
Glucosa Maltosa Lactosa Salicilina H2S L de
Gelatina
Indol Leche
C. Chavovel + + + + + Acidificada
C. septicum + + + + + + Acidificada
C. novyi + + + + Digerida
C. perfringens + + + + +
C. Perfringens + + + + + Muy
fermentada
C. hemolyticum + + + + Acidificada
C. tetani +/ Sin cambio
C. botulinum + + + + Acidificada
C. hystoliticum +/ + Digerida
PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA DETERMINAR LA ESPECIE DEL
CLOSTRIDIUM BOTULIUM
• Prueba de la
producción de
lecitinasa y lipasa en
agar yema de huevo
• Prueba de la urea

9. Las muestras que pueden ser útiles para
aislamiento son las siguientes:
• Heces
• Alimentos
• hisopado de herida.
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM
BOTULINUM
1. Obtención y transporte de la Muestra
El tratamiento con calor o etanol puede ayudar a la
recuperación en muestras altamente contaminadas tales
como alimentos o heces. Estos tratamientos destruyen
los microorganismos que compiten a la vez que permiten
la supervivencia de las esporas clostridiales

10.  Triturar u homogenizar el alimento (muestra)
 Poner en el tubo de dilución de tapa rosca muestra a
igual al peso de la solución salina a utilizar (dilución
1/1).
 Centrifugar el homogenizado a alta velocidad,
preferentemente en centrifuga refrigerada (se tendrán
2 tubos, o sea dos muestras).
 Cogemos uno de s tubos centrifugados y lo
sometemos a baño María por 10 min. (agua hervida).

11. 2. Enriquecimiento
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM
BOTULINUM
• Para el aislamiento usamos medios enriquecidos
como el de carne cocida o el medio tripticasa-
glucosa (ATG).
• En tubos de dilución con tapa rosca colocamos 10 ml
del medio a usar (este esta previamente calentado,
por lo tanto semilíquido).
• Previamente en cada tubo hemos agregado un poco
de la muestra y luego agregaremos en cada tubo el
ATG semilíquido calentado previamente.
Se podrá observar (si la muestra es positiva) la presencia de gas y
resquebrajamiento del medio.

12. 3. Aislamiento Selectivo
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM
BOTULINUM
A partir del sedimento se siembra en agar yema de huevo para anaerobios y se incuba a 30º
durante 72 horas. Las colonias de clostridium son con borde regular rodeadas de precipitado
amarillento debido a la actividad lipolítica que da lugar a ácidos grasos que precipitan son de
aspecto nacarado.
Seleccionar colonias del medio agar para el aislamiento de C. botulinum rodeadas de un halo opaco
con brillo aperlado y pasar a caldo TPGY. Incubar a 30ºC durante 5 días Si los cultivos son
toxigénicos, se debe Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar
para el aislamiento de Clostridium botulinum (CBI)
Seleccionar colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que presenten un
halo opaco indicativo de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY.. Incubar a 30ºC durante 5 días en jarra
de Bre Wer (anaerobiosis)

13. • Algunas especies producen lecitinasa o
lipasa que pueden demostrarse en agar
yema de huevo. La lecitinasa (alfa-
toxina, fosolipasa C) produce un halo
opaco alrededor de la colonia por lisis
de la lecitina y la lipasa transforma las
grasas en glicerol y ácidos grasos,
dando una capa iridiscente que cubre
la superficie de la colonia.
AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM
BOTULINUM
4. Pruebas Bioquimicas

14. • Se sembró la bacteria en medio BHI y se incubó por 7 días a 35ºC.
• El cultivo se centrifugó a 2 500 rpm durante 20 minutos.
• el sedimento se lavó dos veces con agua destilada estéril (ADE) y se resuspendió en 2 mL de ADE.
• Este preparado se cuantificó según lo siguiente: se tomó 0,5 mL de la suspensión, se calentó en baño a 80ºC
durante 10 minutos para eliminar las células vegetativas y provocar la germinación de las esporas.
• se enfrió en baño de agua fría y se le añadió 4,5 mL de ADE.
Preparación y cuantificación de la suspensión
de esporas de C. botulinum.
• Se hicieron diluciones decimales, desde 10-1 hasta 10-5 y se
sembró, por esparcimiento, 0,1 ml de cada una de las
diluciones en platos de agar tripticasa soya, por duplicado.
• Las placas se incubaron 48 horas a 35ºC en anaerobiosis y se
realizó el recuento de colonias, procedimiento que se repitió
a los 2 y a los 8 días de preparada la suspensión inicial.

15. PRUEBA EXPLORATORIA DE PRESENCIA DE LA TOXINA
 Del contenido, inyectamos 0.5 ml. Al ratón de prueba, esto con
aguja de tuberculina (N° 25) vía intraperitoneal.
 Del otro tubo centrifugado se le inyectara a otro ratón de prueba
de la misma cantidad de inoculo.
 Se recomienda que antes de inyectarle el sobrenadante a los
ratones se le debe inocular la antitoxina
 Observar por 4 días
 La positividad de la prueba se comprueba por la parálisis motora
progresiva, es abdomen contraído, respiración dificultosa, arrastre
de las patas, debilidad de la muestra.
 La presencia de la toxina E causa una mucho más rápida (en
menos de 24)