Este documento presenta 10 problemas de espectrofotometría relacionados con la determinación cuantitativa de sustancias como NADH, citosina y ácido pirúvico. Incluye conceptos como coeficiente de absorción molar, absorbancia, transmitancia y ley de Beer. También describe el funcionamiento básico de un espectrofotómetro convencional y provee respuestas a los problemas planteados.

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CÁTEDRA: BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Licenciatura en Alimentos
REPASO- ESPECTROFOTOMETRÍA.
1) ¿Cuál es la concentración de una solución de NADH (coeficiente de
absorción molar a 340 nm igual a 6220 M-1
cm-1
), 1 mL de la cual tiene una
absorbancia de 0,16 en una cubeta de 1 cm de paso óptico?
2) Una solución de NADH tiene una absorbancia a 340 nm de 1,24. ¿Cuántos
mL de esta solución se deberán tomar para preparar 10 ml de una solución 1
M?
3) ¿Cuántos µmoles de NADH hay en 10 mL de una solución que tiene una
absorbancia de 0,31 a 340 nm?
4) La citosina posee un coeficiente de absorción molar de 6 103
M-1
cm-1
a 270
nm a pH 7. Calcule la absorbancia y el porcentaje de transmitancia de
soluciones 10 nM y 1 mM en cubetas de 1 cm y 1 mm.
5) Una solución que se encuentra en una cubeta de 1 cm de espesor contiene
2 g/L de una sustancia que transmite sólo el 75 % de la luz incidente a una
determinada longitud de onda. Calcular la absorbancia de una solución que
contenga a) 4 g/L b) 1g/L c) 6 g/L y d) 5,4 g/L. Si el peso molecular del
compuesto es 250, calcule el coeficiente de absorción molar.
6) El nicotinamida adenín dinucleótido puede hallarse en forma oxidada
(NAD+
) o reducida (NADH), siendo los coeficientes de absorción para el NAD+
de 18000 M-1
cm-1
(260 nm) y para el NADH de 14500 M-1
cm-1
(260 nm) y de
6220 M-1
cm-1
(340 nm).
Se prepara una solución 10 mM de NADH. A la semana, a fin de determinar si
el compuesto se ha oxidado, se mide en una cubeta de 1 cm de camino óptico
la absorbancia a 340 nm de una dilución 1/100 de la solución. Si esta
absorbancia fue de 0,36 determinar cuál es la relación NADH/NAD+
. ¿Qué
absorbancia daría esa misma solución a 260 nm? (considerar la misma
dilución).
7) Calcular las concentraciones de los compuestos A y B en una solución
dada si la absorbancia de esta solución en una cubeta de 3 cm de espesor es
0,62 a 450 nm y 0,54 a 485 nm. El compuesto A tiene un coeficiente de
absorción molar de 12000 M-1
cm-1
a 450 nm y 4000 M-1
cm-1
a 485 nm. El
compuesto B tiene un coeficiente de absorción molar igual a 5000 M-1
cm-1
a
450 nm y 11600 M-1
cm-1
a 485 nm.
8) A 0,3 mL de una muestra de proteína de concentración desconocida se le
agregaron 0,7 mL de agua y 4,0 mL de reactivo de Biuret y se esperó hasta
desarrollo de color. La absorbancia a 540 nm fue de 0,221 en un tubo de 1 cm
de diámetro. A 0,3 mL de una solución standard (5 mg de proteína/mL), se le

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agregaron 0,7 mL de agua y 4,0 mL de reactivo de Biuret. Esta mezcla dio
como resultado una absorbancia de 0,161 en un tubo de iguales
características. El blanco de reactivo fue 0,041. a) Calcular la concentración de
proteína en la solución desconocida. b) Si empleara 0,5 mL de la misma
muestra, ¿qué volumen de agua y de reactivo de Biuret debería agregar? ¿Qué
absorbancia obtendría?
9) El ácido pirúvico puede determinarse colorimétricamente por conversión en
su 2,4 dinitrofenilhidrazona. Se realizó una curva de calibración con diversas
cantidades de ácido pirúvico, obteniéndose los siguientes resultados:
Acido pirúvico
(g)
20 40 60 80 100 125 150
Lecturas 0,175 0,302 0,435 0,560 0,673 0,795 0,900
Fue analizado un blanco de reactivo por triplicado dando respectivamente:
0,040, 0,050 y 0,045. Se analizaron tres soluciones desconocidas de ácido
pirúvico que dieron las siguientes lecturas de absorbancia: a) 0,280; b) 0,555 y
c) 0,919. ¿Qué concentración de ácido pirúvico tienen dichas soluciones si el
volumen de muestra empleado fue 3 mL?
10) Diseñe un protocolo de laboratorio para realizar una curva de calibración
para determinar concentración de proteína empleando la técnica del Biuret
descripta en el problema 9 teniendo en cuenta que este método posee un
rango de sensibilidad entre 0,05 y 0,5 mg mL-1
RESPUESTAS
1) 0,026 mM
2) 0,05 mL
3) 0,5 moles
4) 0,06 10-3
, T 99,99 %
0,006 10-3
, T 99,99 %
6, T 0,0001%
0,6, T 25 %
5) a) 0,25 b) 0,0625 c) 0,375 d) 0,3375
15,6 M-1
cm-1
6) 1,375- 1,597
7) A 0,013 mM, B 0,011 mM
8) a) 7,5 mg/mL b) 0,5 mL de H2O, 4 mL de rvo de Biuret, A= 0,341
9) a) 12,2 g/mL b) 26,7 g/mL c) fuera de la curva de calibración; no se
cumple ley de Beer

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MATERIAL SUPLEMENTARIO
El espectrofotómetro convencional
Un espectrofotómetro convencional enfoca la luz policromática de la fuente en
un monocromador. Este tiene como componentes principales una ranura de
entrada, un elemento que dispersa la luz en sus longitudes de onda
componentes (en general una red de difracción), y una ranura de salida que
permite seleccionar la longitud de onda deseada.
Esa luz “monocromática” atraviesa la muestra, y llega al detector. Las
mediciones fotométricas se hacen en base a la relación entre la potencia de luz
que alcanza al detector cuando está interpuesta la muestra (P) y cuando no lo
está (P0) o cuando está interpuesto un “blanco”.
La transmitancia se define como
T = P / P0
y la absorbancia como
A = - log T = - log P / P0
La base de la espectrometría de absorción y su uso para el análisis cuantitativo
está dada por la relación conocida como ley de Beer:
A = a . b. C
Donde
a es la absortividad, un coeficiente característico de la sustancia absorbente a
cada longitud de onda,
b es la longitud del camino óptico (distancia que atraviesa la luz dentro de la
muestra), y
C es la concentración de la sustancia absorbente.
En realidad el monocromador no selecciona una única longitud de onda, sino
un rango, cuya amplitud depende de la calidad (resolución) del mismo. Esta
resolución depende fundamentalmente del diseño (montaje) del
monocromador, de su distancia focal y de las dimensiones y densidad de líneas
en la red de difracción.
Para cambiar la longitud de onda de medición, o para hacer un barrido
espectral, se mueve el elemento dispersor o algún espejo por medio de un
motor por pasos.

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Algunos espectros de absorción