Este documento describe experimentos sobre espectrofotometría y cuantificación de proteínas. Se realizó un espectro de absorción de la hemoglobina, hemina y hemoglobina con reactivo de Drabkin, observando picos máximos a 415 nm, 395 nm y 420 nm respectivamente. También se explican las diferencias estructurales entre hemoglobina oxigenada y desoxigenada que causan sus diferentes espectros. Finalmente, se cuantificaron proteínas mediante el método de Biuret.

1. UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIA Y FILOSOFÍA
“ALBERTO CAZORLA TALLERI”
BIOQUÍMICA
Práctica de Laboratorio Nº 1
Espectrofotometría
Grupo 1.8
INTEGRANTES:
Arias Llerena, Melina Christina
Aricoché Del Campo, Kiara Beatriz
Armas Torres, Valery Leonor
Bautista Huacho, José Elias
Ugarte Obando, Lucía Beatriz
PROFESORES:
MSc.Teresa Barreto Gaviria
PhD. Mirko Zimic Peralta
Lic. Diego Paz Caya
Marzo, 2022

2. I. INTRODUCCIÓN:
La espectrofotometría es uno de los métodos más sencillos y útiles que sirve para hallar la concentración
de una sustancia en una solución. Para ello, se utiliza un aparato llamado espectrofotómetro (Figura 1),
el cual es manipulado para ajustar la longitud de onda de luz que pasará por la solución y finalmente la
cantidad de luz absorbida por esta última será medida. Cabe mencionar que antes de realizar la medición
de la absorbancia de la solución, es necesario que se mida la absorbancia de disolvente o “blanco” y
asignarle el valor 0 para que sirva de referencia.
Este método tiene como fundamento el hecho de que las moléculas tienen la capacidad de absorber
ciertas radiaciones como las que se encuentran dentro del espectro UV-visible. Las moléculas pueden
diferir respecto a su capacidad para absorber las distintas longitudes de onda y la eficiencia con la que
lo hacen dependiendo de varios factores importantes como su estructura atómica y las condiciones del
medio en el que se encuentren como el pH, la temperatura y la constante dieléctrica. Las moléculas se
distinguen de otras por la serie de estados excitados que le corresponden, creando un espectro de
absorción característico para cada molécula, el cual equivaldría a una señal de identidad de la misma.
Por lo anteriormente mencionado, se puede concluir que el método de la espectrofotometría puede ser
de gran valor para determinar y caracterizar biomoléculas como las estudiadas en este laboratorio.
La absorbancia medida para una un compuesto químico que absorbe luz, también conocido como
cromóforo, guarda una relación directamente proporcional con la concentración de este en la solución
y también con la distancia que recorre la luz en la solución. Estas relaciones se ven reflejadas en la
ecuación de Lambert-Beer.
A=log I/Io = e*C*l
A modo de interpretación, podemos decir que la relación positiva entre absorbancia y concentración se
debe a que mientras más moléculas haya, habrá una interacción mayor entre ellas y la luz. Por otro lado,
mientras mayor sea la distancia recorrida por la luz, más altas serán las posibilidades de que se encuentre
con una molécula. Además, vemos que la absorbancia está relacionada con la constante de
proporcionalidad “e”, conocida como coeficiente de extinción molar, la cual es particular para cada
cromóforo(Díaz et al., 2010).
También existen métodos para la determinación de concentración de proteínas como el ensayo Bradfort,
el ensayo Lowry y el ensayo Biuret. Se ha demostrado que cada ensayo tiene sus ventajas y desventajas
relacionadas a la sensibilidad. El método de Biuret consiste en hacer reaccionar iones cúpricos con
proteínas, mediante lo cual se producirá una formación compleja de color púrpura-violeta resultante de
la interacción entre iones cúpricos y el enlace peptídico. La reacción de Biuret con proteínas es
independiente de la composición de estas. Sin embargo, esta reacción es algo insensible comparada con
los otros métodos de determinación colorimétrica de proteínas. El método de Lowry se basa en la
reacción de Biuret pero añadiendo una reacción con el reactivo de Folin fenol. Hay una variación en la
composición de la proteína que se debe a la contribución de ciertos aminoácidos como la tirosina y el
triptófano. El uso de esta reacción ha ido decayendo en los últimos años al igual que la reacción de
Biuret debido a la disponibilidad de ensayos más sencillos y sensibles a las proteínas. El método de
Bradford, por otro lado, consiste en el uso del tinte CB, el cual al unirse a las proteínas forma un
complejo tinte-proteína con elevada absorbancia molar y permite la determinación de la concentración
de estas últimas (Sapan et al., 1999).
Para el presente laboratorio se observó el espectro de absorción de biomoléculas como la hemina y la
hemoglobina, a cada una le corresponde uno distinto ya que la naturaleza de cada molécula difiere

3. respecto a la otra. Además de ello, se determinó la concentración de dos muestras de albúmina con
concentraciones desconocidas gracias al gráfico de absorbancia vs concentración. Como vimos antes,
esta relación se deduce de la ley de Lambert-Beer.
II. PARTE PRÁCTICA
Experimento 1: Espectro de absorción de la hemoglobina
1. En el siguiente experimento se realizaron las siguientes 3 mezclas:
MEZCL
A
Hemina (uL) Hb (uL) Reactivo Drabkin
(uL)
Agua destilada
(uL)
A 10 0 0 990
B 0 200 0 800
C 0 200 800 0
Se realizó un barrido entre 390 nm y 630 nm, con un intervalo de 5 nm, utilizando una cubeta
control o blanco para cada lectura.

4. Longitud de
onda (λnm)
A(Hemi
na)
B(Hb) C(Drabkin+ Hb)
390 1.292 0.594 0.755
395 1.241 0.758 0.892
400 1.145 0.984 1.051
405 1.001 1.301 1.243
410 0.849 1.600 1.475
415 0.710 1.737 1.744
420 0.592 1.561 1.889
425 0.499 1.140 1.735
430 0.433 0.771 1.327
435 0.385 0.532 0.923
440 0.346 0.379 0.643
445 0.318 0.289 0.481
450 0.295 0.231 0.374
455 0.277 0.193 0.297
460 0.259 0.163 0.23
465 0.244 0.143 0.186
470 0.232 0.127 0.159
475 0.223 0.115 0.144
480 0.214 0.105 0.133
485 0.206 0.098 0.123
490 0.198 0.092 0.114
495 0.190 0.088 0.106
500 0.182 0.085 0.102
510 0.164 0.081 0.105
520 0.150 0.094 0.124
530 0.141 0.152 0.148
540 0.132 0.201 0.155
550 0.128 0.167 0.152
560 0.126 0.127 0.134
570 0.125 0.169 0.112
580 0.127 0.196 0.088
590 0.131 0.064 0.064
600 0.132 0.025 0.041
610 0.129 0.018 0.025
620 0.115 0.017 0.017
630 0.095 0.016 0.014
III. RESULTADOS

5. ● Comparar en una sola gráfica los espectros de absorción de las soluciones A, B y C e identificar las
longitudes de onda de máxima absorbancia.
- Las longitudes de máxima absorbancia de onda de A son de 395.
- Las longitudes de máxima absorbancia de onda de B son de 415.
- Las longitudes de máxima absorbancia de onda de C son de 420.
IV. PREGUNTAS
● ¿Qué diferencias encuentra entre los máximos de absorbancia de la hemina y las muestras de
hemoglobina?- Explique el origen de esas diferencias.
Las diferencias que se encuentra entre los máximos de absorbancia de la hemina y las muestras de
hemoglobina es que el de la Hemina fue de 395 nm mientras que en la hemoglobina fue de 415 nm, por
lo tanto hay mayor absorbancia de fotones en Hb, esto quiere decir que la intensidad de luz transmitida
es menor y es mayor la luz visible reflejada.
● ¿Qué longitud de onda utilizará para identificar hemoglobina en una solución? Explique el porqué.
Para identificar la hemoglobina en una solución se utilizará la longitud de onda de 415 nm. Como se
mencionó anteriormente la longitud máxima es característica de una molécula, ya que depende de su
conformación química y del tipo de enlaces químicos para que se diferencie de otras. La razón de que
su longitud de onda sea 415 nm es porque contiene un grupo Fe que puede enlazarse con el oxígeno, lo
cual hace que en las gráficas se vean las longitudes de onda máximas, en comparación de la hemina que
no contiene oxígeno y no se ve algún pico en esas longitudes de onda.
El grupo hemo está contiene un átomo de hierro en el centro de la porfirina que es un tetrapirrol cíclico
de gran tamaño con enlaces metileno. (Villavicencio-Queijeiro, Alexa. (2012)).
Lo que sucede en esta estructura, es que el hierro se une con la porfirina dentro del plano, formando un

6. enlace sólido con el oxígeno, haciendo que la forma estructural del grupo hemo sea plana. Sin embargo,
para que el O2 pueda unirse al Fe, este tiene que romper los enlaces salinos que tiene la histidina que
está en la parte central inferior. De esa manera, cada vez que un O2 intente unirse al resto de los grupos
hemos, será más sencilla su unión porque habrán menos enlaces salinos que romper. (Gmot, -)
● ¿Existe alguna razón estructural que origine el espectro de absorción de la hemoglobina? Explique.
La hemoglobina tiene una estructura cuaternaria conformada por dos unidades alfa y beta, 141
aminoácidos en alfa ,así como 146 aminoácidos en beta. Presenta 4 grupos hemos que se encuentran en
un enlace hidrofóbico de cada cadena entre las hélices de la hemoglobina. (Jensen, F. , 1998)
También se encuentra el grupo de la histidina que está unida al Fe, el Fe se encuentra en la parte inferior
de la histidina, además allí puede formar enlaces con el oxígeno. Al formar ese enlace cambia la
estructura del Fe angular a una planar lo que podría ser la razón por la que se presenta ese espectro de
absorción en la gráfica. Esto facilita los siguientes enlaces entre el O2 y los grupos hemo restantes.
(Sánchez-Lara, E.)
● ¿Cuáles son los cambios que Ud observa en el espectro de absorción de la Hb cuando se utiliza el
reactivo de Drabkin, a qué se debe?
El pico máximo del espectro de absorción de la hemoglobina cuando se utiliza el reactivo de Drabkin
alcanza un valor de 1.889 a 420 nm, el cual está en una posición un poco más elevada que el pico
máximo de la hemoglobina; a parte de ello, presenta un segundo pico a los 540 nm. El reactivo de
Drabkin está compuesto por ferrocianuro potásico y cianuro potásico, por lo que al reaccionar con la
hemoglobina convierte a esta última en cianometahemoglobina(Lewis et al., 2008). Esto se debe a que
el Fe(+2) de la hemoglobina es oxidado por el ferrocianuro y pasa a ser Fe(+3), convirtiendo la
hemoglobina en metahemoglobina y finalmente la metahemoglobina recibirá los iones cianuro para
formar cianometahemoglobina, que absorbe a 540 nm y provoca la presencia de un segundo pico a dicha
longitud de onda(S/f,2022).
● ¿Puede Ud. identificar cuáles son los picos de absorción que distinguen la hemoglobina oxigenada
y desoxigenada? Justifique su respuesta (revise la bibliografía y cite).
Según se ve en el gráfico del espectro los dos picos de absorbancia más altos son en 544 y 582 nm, esto
correspondiente al Hb-oxigenado, por otro lado, el pico alto de absorbancia es en 551 nm es en el estado
de la Hb-desoxigenada. (Figura 2)
La molécula de la hemoglobina tiene 4 subunidades formadas que son dos tipo alfa y los otros dos de
tipo beta, cada subunidad puede adquirir una molécula de O2 a través de su grupo hemo. (Casiday y.
Frey, 2015). Esta facultad de unión de la Hb con el O2 está regulada por sus interacciones alostéricas,
es decir, sus interacciones entre centros espacialmente diferentes y que son transmitidos como cambios
conformacionales de la proteína. (A. Salvay,2001).
La hemoglobina adopta dos conformaciones en su estructura son denominadas: T (tensa-
desoxihemoglobina) a causa de tener ocho enlaces salinos que se establecen entre subunidades
diferentes y R (relajada) , este carece de estos enlaces salinos y posee una mayor afinidad por el O2.
En la oxigenación, el átomo de hierro se desplaza hacia el plano del hemo arrastrando la histidina
proximal con él. Este desplazamiento, rompe algunos enlaces salinos y desplaza el equilibrio de la
forma T a la forma R. En otras palabras, el grupo hemo no es plano cuando no está unido al oxígeno;
el átomo de hierro se extrae del plano de la porfirina, hacia el residuo de histidina (azul claro) al que
está unido. Esta configuración no plana, es característica del grupo hemo desoxigenado y se conoce
comúnmente como forma "abovedada". Los electrones de valencia en los átomos que rodean al hierro
en el grupo hemo y los electrones de valencia en el residuo de histidina (azul claro) forman "nubes" de
densidad electrónica (rosa). Sin embargo, cuando el Fe en el grupo hemo se une a una molécula de

7. oxígeno (gris), el anillo de porfirina adopta una configuración plana (línea roja) y, por lo tanto, el Fe
se encuentra en el plano del anillo de porfirina ( Casiday y. Frey, 2015) (Figura 3)
Experimento 2: Cuantificación de proteínas Cuantificación por el método de Biuret
Se preparó el siguiente experimento descrito a continuación:
Reactivo Blanco
Curva estándar
M1 M2
1 2 3 4 5 6
Agua (μL) 100 90 80 50 40 20 0 50 50
BSA 28mg/mL
(μL)
0 10 20 50 60 80 100 0 0
Muestra (μL) 0 0 0 0 0 0 0 50 50
Para el estándar de proteínas se utilizó seroabúmina bovina (BSA) y las muestras problemas M1 y M2,
corresponden a muestras de albúmina. A todos los tubos se les adicionó 900uL de reactivo de biuret y se
incubó 10 minutos a 37o
C. Luego se leyó en espectrofotómetro a 540 nm.
Calcule las concentraciones de proteínas en las muestras M1 y M2
Tubo BSA(mg/mL) A 540nm
1 2.8 0.076
2 5.6 0.145
3 14 0.37
4 16.8 0.433
5 22.4 0.569
6 28 0.738
M1 ¿? 0.231
M2 ¿? 0.143
● ¿Cuál es la concentración de proteínas en las muestras problema?
Con los datos mostrados en la tabla, se obtuvo la ecuación de la recta:
Y=0.026X + 0.0007

8. En primer lugar, hallaremos M1 reemplazando el dato de la absorbancia 540 nm para la muestra M1
por el factor Y de la ecuación.
0.231 = 0.026X + 0.0007
X = 8.8577 mg/mL
Debido a que 50uL de la muestra 1 fueron inicialmente diluidos en 50uL de agua, procederemos a
calcular la concentración inicial M1 con la ecuación de la dilución: Mi*Vi=Mf*Vf
M1*50uL = 8.8577mg/mL*100uL
M1 = 17.7154mg/mL
En segundo lugar, hallaremos M2 reemplazando el dato de la absorbancia 540 nm para la muestra M2
por el factor Y de la ecuación.
0.143 = 0.026X + 0.0007
X = 5.4731 mg/mL
Debido a que 50uL de la muestra 2 fueron inicialmente diluidos en 50uL de agua, procederemos a
calcular la concentración inicial M2 con la ecuación de la dilución: Mi*Vi=Mf*Vf
M2*50uL = 5.4731mg/mL*100uL
M2 = 10.9462mg/mL
● Si Ud hubiese utilizado una muestra de suero como muestra problema del experimento 2. ¿Los valores
de concentración obtenidos para las muestras de suero representan a la concentración de albúmina o a
la concentración total de proteínas?
El reactivo de Biuret es un método que permite detectar la presencia de enlaces peptídicos, los cuales
están presentes en todas las proteínas. (Badillo-Catañeda y col., (2018))
Esto se debe a que el reactivo de Biuret contiene el CuSO4 que va a interactuar, en un medio alcalino
de NaOH, con el grupo amino de las proteínas, haciendo que la solución se torne violeta cuando hay
presencia de enlaces peptídicos entre aminoácidos. (Fernández, (-)) Es por eso que los valores
obtenidos para las muestras de suero representan a la concentración total de proteínas.

9. ● ¿Con los ensayos realizados en la presente práctica, podría usted diferenciar la concentración de una
muestra de Hemoglobina en sangre o de Albúmina en suero? Describa el ensayo a utilizar para la
cuantificación de proteínas en cada caso, indicando las longitudes de onda que utilizará.
El método de Biuret, que muestra la práctica fue diseñado para demostrar la evidencia y cuantificar
proteínas totales presentes en la muestra que deseamos analizar, esto a un rango en de luz visible de la
espectroscopia, de longitud de onda de 540 nm.
Por otro lado, el método de ácido bicinconínico (BCA), este método genera una reacción colorimétrica
que se detecta a 562 nm, proveyendo de igual manera en la evidencia y cuantificación de las proteínas.
(E. Fernández)
Además, se pueden obtener: una curva estándar, el coeficiente de extinción y el rango de sensibilidad
para dos muestras en simultáneo, todo por medio de la reacción con los enlaces peptídicos. Por lo que,
obteniendo el análisis de la cuantificación no podemos diferenciarla. (E. Fernández)
V. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
Experimento 1
En el gráfico de absorbancia del experimento 1, se ve las diferentes longitudes de onda que las diferentes
moléculas pueden absorber. Por ejemplo, en la absorbancia de la hemoglobina en comparación de la
hemina, fue de 395 nm mientras que en la hemoglobina fue de 415 nm, esto debido a la presencia de
oxígeno en la hemoglobina. Esto se debe a la interacción del hierro, átomo que se ubica en el centro de la
hemoglobina, y la histidina, aminoácido que se encuentra de forma próxima, producen cambios en la
estructura cuando el oxígeno se une a los grupos hemos.
En un segundo caso, comparando las gráficas de la hemoglobina y la hemoglobina con Drabkin. El amplio
pico de absorción de la cianohemoglobina permite su medición utilizando instrumentos de banda ancha y
estrecha (530-550 nm). El Drabkin, está compuesto por ferricianuro de potasio, cianuro de potasio y
fosfato de dihidrógeno de potasio. El ferricianuro de potasio oxida la hemoglobina a metahemoglobina y
luego a cianometahemoglobina. En la gráfica se observa que la curva tiene una longitud de onda mayor
que la misma hemoglobina, esto porque ha disminuído el nivel de energía ya que la molécula ha sido
perturbada por el drabkin.
Experimento 2
En el stock de la muestra problema 1 y 2, la concentración de la tabla de preparación se ha colocado 50
uL de muestra y se ha diluido con 50 uL de agua, antes de realizar el ensayo Biuret. Debido a que ha
habido una dilución, para saber la concentración de la muestra 1 y 2 se debe de multiplicar por 2 a los
valores que se ha hallado de concentración, porque los datos medidos, que se dan, es la determinación
de la concentración de la muestra del fluido, no de la muestra del stock original. Hubiera sido distinto si
hubiéramos puesto los 50 uL, correspondientes, sin diluir.
Cabe mencionar que es importante que tengamos claro qué es lo que deseamos cuantificar en nuestras
muestras problema. El método de Biuret utilizado en el presente trabajo para la cuantificación de proteínas
se basa en una reacción ampliamente utilizada para medir la concentración total de proteínas en suero. El
método se basa en la formación de un complejo, en una solución alcalina, formado por el ión cobre y grupos
amino secundarios o terciarios separados por un grupo carbonilo o, en el caso de los péptidos, otro átomo de
carbono terciario. El complejo resultante es de color azul, lo cual se explica por el hecho de que absorbe
radiación visible a 540 nm. Entonces, es relevante recordar que el método de Biuret no es capaz de
diferenciar proteínas puesto que la reacción es específica para enlaces peptídicos, los cuales están presentes

10. en todas las proteínas. Es por ello que solo debe usarse para cuantificar el contenido total de proteínas en
suero(Bertholf, 2014).
Para poder cuantificar la muestra de proteínas se usaría la longitud de onda de 415 porque es el pico
máximo de absorción; permite identificar la hemoglobina pero es un método inexacto, por ello se usa el
reactivo de Drabkin para cuantificar hemoglobina en una muestra de sangre a nivel clínico.
VI. BIBLIOGRAFÍA:
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VII. ANEXOS:
Figura 1: Espectrofotómetro

12. Figura 2 : Espectrómetro con lo picos de absorción que distinguen la hemoglobina oxigenada y
desoxigenada
Figura 3 : Conformaciones de la estructura de la hemoglobina con oxígeno y sin oxígeno.