Este documento describe las técnicas inmunoenzimáticas, en particular la técnica de ELISA, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal (mAb). Explica que los ELISA permiten detectar moléculas biológicas a bajas concentraciones mediante la unión del epítope al paratope y la detección enzimática. Luego, detalla cómo se puede utilizar un ELISA para determinar el isotipo específico (IgG1, IgG2a, etc.) de un mAb dado mediante el uso de anticuerpos de captura anti-cadena pes

1. TECNICAS
INMUNOENZIMATICAS
Determinación de isotipo de Ac monoclonal mediante la técnica
de ELISA
Inmunología (Bioquímica) 2019
Dra. Andrea Cecilia Parrado

2. ¿Qué es un Anticuerpo Monoclonal?
• Un anticuerpo monoclonal (monoclonal
Antibody; mAb en inglés) es un
anticuerpo que proviene de un único
clon (LB) productor de anticuerpos con
características determinadas.
• Constituyen una población homogénea
y reconocen un único epítope.

3. Un poco de historia....
Premio Nobel en Fisiología y Medicina de 1984:
“Por el desarrollo de la técnica de
hibridomas para la producción de
anticuerpos monoclonales”.
Nature, Vol. 256 August 7 1975
Milstein (izquierda) y Kölher (derecha), creadores de la
técnica de hibridización somática para la generación de
anticuerpos monoclonales

4. ¿Cómo se producen los Anticuerpos Monoclonales?
1- Plan de inmunización para
la obtención de linfocitos B
específicos para el antígeno
2- Fusión de los LB con
células de mieloma para
formar los hibridomas
4- Producción a gran escala de
la producción de mAbs
3- Clonación y selección
de células especificas
por dilución limite o por
aislamiento en agar
blando5- Purificación
de los mAbs
In vitro
In vivo

5. Aplicaciones
• Purificación de proteínas
• Identificación y aislamientos de poblaciones celulares
• Como REACTIVO en técnicas de interacción primaria
Diagnósticas
• Terapias oncológicas conjugados a citotoxinas
• Terapia anti-rechazo de transplantes y enfermedades
autoinmunes
Terapéuticas
PERO.....antes de usarlas como herramientas hay que tener en cuenta..

6. •Isotipo: Inmunoprecipitaciónen gel, ELISA
• Epítope reconocido: ELISAs, inmunobloto Western blot
Nativo o lineal, repetido, compartido con otras proteínas o
reconocidos por otros monoclonales, etc.
• Afinidad: estimación por ELISA/RIA, de ser posible
Caracterización

7. Técnicas de interacción primaria
Es la unión EPITOPE - PARATOPE
¿Cómo se puede evidenciar la interacción primaria?
Enzimoinmunoensayos
(EIA)
Inmunofluorescencia
(IF)
Radioinmunoanálisis
(RIA)
Enzima que cataliza una
reacción enzimática
Sustancias fluorescentes
(fluorocromos)
Sustancias radioactivas
(radionucleídos)
Unidos a uno de los dos inmunoreactantes (Ac o Ag)
CONJUGADO
S
P

8. ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIA)
FUNDAMENTO: utilización del poder amplificador que genera una reacción enzima-sustrato.
EIA
Homogéneos
(Fase líquida)
Competitivo
No
competitivo
Heterogéneos
(Soporte sólido
inmoviliza Ag o Ac)
Competitivo
No
competitivo
Indirecto
Captura o
Sandwich
https://www.youtube.com/watch?v=FmVV4e8evc8
https://www.youtube.com/watch?v=KrGC0ZgIDI8

9. Aplicaciones
CUALITATIVAS SEMICUANTITATIVAS CUANTITATIVAS
Presencia de Ag o de
Ac específicos en una
muestra
Título de Ac específicos
en una muestra
Concentración de
Ag en una muestra
(Diluciones seriadas del suero)
TÍTULO: la inversa de la última
dilución con un DO mayor al
cut-off
(Curva de calibración
con Ag standard)

10. ¿Cómo se determina el isotipo de un mAb?
(mAbs de determinado
isotipo y especificidad)
Lavados
Ac de captura anti-Ig
(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, o IgM)
Ac anti- cadena L ( o )
conjugado a enzima
Absorbancia
Sustrato +
Cromógeno
Lavados
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2017/11/pdb.top093823.abstract
Muestra
1
3
2 Bloqueo 4
5
6
7
8

11. Los EIA o ELISA permiten la detección de distintos tipos de moléculas
biológicas a muy bajas concentraciones y cantidades. Por lo tanto,
son considerados importantes herramientas para la investigación
científica básica y aplicada, así como también para el diagnóstico
clínico.
CONCLUSIÓN

12. Bibliografía
• Hornbeck P, Fleisher TA, Papadopoulos NM. Determinación de
isotipos de anticuerpos. Curr Protoc Immunol. 2017 2 de febrero; 116:
2.2.1-2.2.7. doi: 10.1002 / cpim.19.
• ”. Margni y col. Inmunología e inmunoquímica fundamentos –Capítulo
37: “Hibridomas y anticuerpos monoclonales. 5° Ed., 1996
• Frances Weis-Garcia and Robert H. Carnahan. Isotype Determination
of Rodent-Derived Monoclonal Antibodies Using Sandwich ELISA. Cold
Spring Harb Protoc. 2017.
• Edward A. Greenfield. Antibodies A Laboratory Manual, Second
edition, 2013