ELISA, enzyme-linked immuno assay, metodos de elisa, diseño de elisa, sandwich elisa, elisa directo, elisa indirecto.

1. ELISA
Daniel Goicochea
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología

2. Fundamento
• Se basa en la reacción Ag-Ab
específico
• Marcaje con enzima
indicadora (unida a un Ag o
Ab) que produce productos
coloreados

3. • La diferencia principal entre las técnicas de RIA y
ELISA es que la primera utiliza como marcador un
isótopo y la segunda la actividad de un enzima
• Anteriormente se empleaban isótopos
radioactivos, que suponía mayor riesgo y costo en
el laboratorio.
ELISA

4. Métodos de ELISA

5. ELISA Directo
• Ag inmobilizados y detectados por
Ab primarios conjugados con
enzimas. Es muy importante la
especificidad del Ab primario.
• PROS: mínimo procedimiento, evita
reactividad cruzada al no usar un
Ab secundario
• CONS: requiere marcado de todos
los Ab primarios – alto costo, no
todos los Ab son adecuados para
ser marcados

6. ELISA Indirecto
• Los Ab primarios no están marcados,
son detectados por Ab secundarios
conjugados con enzimas.
• PROS: Se puede usar una gran
cantidad de Ab secundarios para
diferentes ensayos, los Ab primarios
mantienen máxima
inmunoreactividad
• CONS: Puede ocurrir cross-reactivity

7. ELISA No competitivo (Sandwich)
• Ag capturado por Ab y detectado
por Ab diferentes. Ambos Ab deben
ser elegidos con cuidado para
prevenir la reactividad cruzada o
competencia por sitios de unión.
• PROS: Sensibilidad, alta
especificidad, el Ag no necesita
haber sido purificado antes de usar
• CONS: Los Ag deben tener al menos
dos lugares de unión a Ab

8. ELISA Competitivo
• EL Ag de la muestra y el Ag
purificado inmobilizado
compiten por la unión (captura)
del Ab.
• PROS: crude or impure samples
may be used, high
reproducibility.
• CONS: lower overall sensitivity
and specificity.

9. Directo No competitivo
Directo

10. Diseño para cuantificación de Antígeno
• Método «Sándwich» o ELISA de captura
• El Ag debe ser capaz de ser reconocido por
dos moléculas de Ab, simultáneamente: Uso
de Ab policlonal o de dos Ab monoclonales
(que reconocen distintos epítopos)

11. Miotoxina de Bothrops asper

12. Toxina tetánica

13. Diseño para cuantificación de
anticuerpo
• Método indirecto: unión de Ag a fase sólida y
unión de Ab de la muestra. Detección por
conjugado.
• Riesgo: cambio conformacional del Ag al
unirse a fase sólida

14. IgE sérica (alergias)

16. Enzimas y substratos
• Principales enzimas: peroxidasa de rábano y
fosfatasa alcalina de mucosa intestinal bovina.
• Pueden unirse a Ab sin alterarlos ni perder su
capacidad catalítica.
• Catalizan reacciones que producen productos
coloreados solubles o precipitables:
– Solubles: cuantificación por espectofotrometría, o
en el caso de fluorogénicos que se pueden
detectar a bajas concentraciones
– Pp: técnicas de localización cuantitativa (WB, EIT,
etc.)

17. Resultados
• Positivo:
– Presencia de anticuerpos (empleado en detección
de enfermedades) o antígenos
• Falso positivo:
– Producción de Ab en una persona que estuvo
enferma, pero ya se curó
– Inespecificidad Ag-Ab
• Falso negativo:
– Producción en bajas cantidades de Ab, puede
pasar desapercibido

18. Muestra: 256 adultos del Distrito de Cauday, Cajamarca
Detección de anti-Toxocara IgG por dot-ELISA, usando antígenos TES (T. canis larvae
excretory-secretory Ag)
Positivos Negativos
Toxocara dot-ELISA 53.1% (136) 46.9%
Las muestras de suero recibieron antígenos de Ascaris suum y disminuyó los resultados positivos
Las muestras negativas siempre se mantuvieron negativas
Positivos Negativos
Toxocara dot-ELISA 44.92% (115) 55.08%

19. HIV ELISA detection
• The most popular ELISA involves an indirect
method in which HIV antigen is attached to a
well of a 96-well microtiter plate. Antibody in
the sample is allowed to react with the
antigen-coated solid support

20. • El método de ELISA descrito detecta antígenos
solubles en la orina de los pacientes detectado
por un Ab monoclonal para confirmar casos
de pacientes con Legionella pneumophila
serogroup 1 (L.pn 1).
• Especificidad del ensayo: 100%
• Detección de antígeno en la orina: 77%