Imprinting

1. IMPRONTA GENOMICA
(“IMPRINTING”)
Conocimientos requeridos:
clases previas de Cromatina y Epigenética
Definición:
“marca” que determina la expresión de 1 solo alelo de un cierto locus
dependiendo del sexo del progenitor que transmitió ese alelo (parent
of origin)
ocurre en mamíferos y en plantas
en genes que escapan a la oleada de metilación y desmetilación
que ocurre en el desarrollo embrionario temprano

2. concepto relativamente moderno
Primer trabajo que menciona la palabra “imprinting” en contexto biológico
(de comportamiento):
Klopfer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1964) 52: 911–914.
Maternal “Imprinting” In Goats
Primer trabajo que menciona la palabra “imprinting” en contexto genético
bien definido:
Rastan et al. Nature (1983) 303: 635-637.
Interaction between the Xce (X-controlling element) locus and imprinting of
the paternal X chromosome in mouse yolk-sac endoderm.

3. Modelo sencillo de expresión mono-alélica de genes sujetos a imprinting
se mantienen las marcas
que vinieron de los progenitores.
no importa el sexo
del individuo hijo
(el sexo va a importar después a la hora
de transmitir
los alelos a su progenie)
Erasure = borrón y cuenta nueva
“resetting” del imprinting
epigenéticamente iguales
epigenéticamente iguales
las marcas se establecen de nuevo
de acuerdo a si son gametas
masculinas
o femeninas
origen: P M
origen: P M

4. ERASURE
“borrón y cuenta nueva”
Andy Bell y Vince Clarke.)

6. marcas epigenéticas de
futura expresión
“resetting”: se borra el viejo imprinting
y se establece nuevo imprinting
marcas epigenéticas
de
futura no-expresión

7. Lista de genes “imprinteados”
en: a census of mammalian imprinting.
Morison et al., Trends Genet. 21: 457-65 (2005 )
Ejemplos: cromosoma expresión
SNRPN
UBE3A
15 paterna
materna
IGF2
H19
11 paterna
materna
Xist
Tsix
X paterna*
materna*
1
2
3
* Solamente en embrión antes de implantación; después es al azar

8. Ejemplo 1: cromosoma 15q11-q13
(brazo largo)
son genes que se expresan en sistema nervioso central
IC SNRPN _______otros genes _________UBE3A
←-----------------------------------36 Kb--------------------------------------→
expr. paterna expr: materna
IC: “imprinting center”: region que controla el imprinting de toda la
región
SNRPN y UBE3A son de expresión excluyente en cis, es decir:
si se expresa SNRPN, no se expresa UB3A en el mismo alelo, y viceversa

9. ¿En qué células se establece (se “resetea”) el imprinting
del gen SNRPN?
metodología: medición de status de metilación en islas CpG (entre ellas, las del
IC=Imprinting Center) mediante la técnica del bisulfito
Geuns et al., Hum. Mol. Genet. 12: 2873-9 (2003)
embrión temprano línea germinal femenina
línea germinal
masculina
muy metilada
nada metilada

10. Síndrome de Prader Willi
(PWS)
Causa 1: deleción en el alelo SNRPN
de origen paterno (70% de los casos)
Expresión NO NO
de la región

11. Síndrome de Prader Willi
(PWS)
causa 2: Disomía* Maternal (25% de los casos)
Expresión: NO NO
*Disomía uniparental en general puede surgir por:
1) error en meiosis dando gametas con cromosomas duplicados provenientes de un mismo
progenitor y posterior pérdida en cigoto del cromosoma heredado por el otro progenitor
2) o por recombinación entre cromosomas homólogos en mitosis en embrión temprano

12. Síndrome de Prader Willi
(PWS)
causa 3:
Defecto en el IC 3’ (PWS-IC) , que (si bien causa
insensibilidad a marcas epigenéticas inactivadoras),
tampoco permite que actúen las marcas activadoras
(5% de los casos)
Expresión: NO NO

13. Página de PWS association
http://www.pwsausa.org/index.html
Síntomas
• Neonatal hypotonia
• Feeding problems in infancy
• Excessive weight gain
• Facial features
• Hypogonadism
• Developmental delay
• Hyperphagia
• Hypopigmentation
• Small hands and/or feet
• Eye abnormalities
• Thick viscous saliva
• Articulation defects
problemas de comportamiento
• Sleep disturbance

14. Síndrome de Angelman (AS)
Causa similar pero la deleción es en la región
que se expresa a partir del alelo de origen materno:
gen UBE3A
• Angelman Syndrome Foundation
• http://www.angelman.org/angel/

15. Síndrome de Angelman (AS)
Síntomas
• developmental delay
• mental retardation
• gross and fine motor difficulties
• suck/swallowing disorder
• wide-spaced teeth
• hypopigmentation
Problemas de comportamiento
• speech disorder (in most cases, lack of speech)
• hypermotoric behavior
• easily excitable personality
• frequently happy demeanor.

16. Modelo molecular sencillo para explicar expresión mono-alélica (paterna)
de los genes de la región (excepto de UBE3A, que tiene patrón de
expresión opuesto en cis)
_____ _____
factores específ de línea germ fem metilación → inactivo
IC = Imprinting Center; región regulatoria bipartita: parte 5’ (AS-IC): promueve la acción de metilasas;
parte 3’ (PWS-IC): isla CG receptora de esas metilasas
no hay factores sin metilar → activo
● : alelos que no se expresan
○ : alelos que se expresan
IC = Imprinting Center
p

17. ¿Por qué la expresión excluyente en cis
entre SNRPN y UBE3A?
No hay un modelo molecular convincente, pero probablemente se
deba a un aislante transcripcional influido por una DMR
(región diferencialmente metilada) que actúa a distancia,de
modo similar a lo indicado en el ejemplo 2 (BWS)

18. -
Ejemplo 2:
Beckwith–Wiedemann
syndrome (BWS):
- macroglosia
- hepatomegalia
- tumor de Wilms
región en cromosoma 11p15:
genes IGF2 y
H19 regulados por el
mismo enhancer atípico
ubicado 3’
se transmite por vía materna
CTCF es un aislante transcripcional que se
ubica en la DMR (región diferencialmente metilada)
cuando no está metilada; e impide la acción
a distancia del enhancer sobre IGF2
(CTCF no tiene efecto sobre H19)
enhancer
Normalmente el alelo materno
no está metilado → CTCF se pega →
IGF2 no se expresa
En BWS, el alelo materno tiene una deleción
en DMR → CTCF no se pega →
IGF2 se expresa,
lo cual explica el tumor de Wilms (sobre-expresión
de IGF2 a partir de ambos alelos)
●
CTC
F
CTC
F
Normalmente el alelo paterno
está metilado → CTCF no se pega
→ IGF2 se expresa
Si hay deleción similar eenn aalleelloo ppaatteerrnnoo,,
nnoo ccaauussaa ccaammbbiiooss eenn llaa eexxpprreessiióónn ddee IIGGFF22
ppoorrqquuee ddeessaappaarreeccee llaa ppllaattaaffoorrmmaa ppaarraa eell
ppeeggaaddoo ddee CCTTCCFF,, qquuee iigguuaall nnoorrmmaallmmeennttee
eess iinneeffeeccttiivvaa ddeebbiiddoo aa mmeettiillaacciioonn

19. Ejemplo 3
INACTIVACION DEL CROMOSOMA X
en células XX de mamíferos
antecedentes:
Mary F. Lyon, UK (1925-)
descubrió en 1966 que:
corpúsculo de (Murray) Barr (1949), es debido a un X como
heterocromatina en células somáticas XX en interfase
sexado en las Olimpíadas (para detectar transexuales XY): the presence of
Barr bodies indicates femaleness whereas their absence indicates maleness. This test was previously
used in the International Olympic Committee Medical Commission in 1968. This test
later was replaced by PCR (Y chromosome).
• cuerpo XY (par XY como heterocromatina [hay recombinación homóloga entre
ellos en cortas regiones]) en células germinales masculinas durante el
inicio de la meiosis; luego se separan en la primera división, pero el X
sigue heterocromatinizado en las gametas

20. Ejemplo 3
INACTIVACION DEL CROMOSOMA X
en células XX de mamíferos
• Placentarios (euterianos)
debida a imprinting hasta el momento de la implantación
(estadío blastocisto). Después el imprinting es borrado
(excepto en trofoblasto → placenta) y la inactivación es
al azar por un mecanismo de conteo o dosaje
→ tejidos mosaico
• No placentarios (metaterianos) p. ej. canguros
hay imprinting de todo el X paterno a lo largo de toda la
embriogénesis, que continua en la vida adulta

21. Genes Xist y Tsix
Jeannie Lee et al., Harvard Medical School
Nature Genetics 21, 400 - 404 (1999)
los genes responsables están localizados en el XIC (X-inactivation Center),
locus definido por genética clásica
RNA: el verdadero inactivador en cis
RNA anti-sense: el verdadero activador en cis
hibridización in situ de RNA
(RNA-FISH)
El RNA Xist recubre a todo el X
del cual provino, y lo inactiva
El RNA Tsix impide que se
sintetice RNA Xist

22. ¿Qué marcas epigenéticas adquieren los X como
consecuencia del RNA Xist?
RNA
los clásicos
Chang et al., Frontiers in Bioscience 11, 852-866, 2006

23. OK, la inactivación de uno de los dos X es debida a genes del XIC….
pero ¿cuál X es el que se inactiva?¿Es al azar o es parent of origin?
Experimento: mirar expresión de genes Xist y Tsix por RT-PCR sobre
RNA de blastocistos pre-impl. de dos cepas de ratón distintas (para
aprovechar polimorfismos de longitud en RNA Xist)
en hembras: el RNA Xist es igual
que el del padre !!!
machos no tienen RNA Xist
el RNA Tsix es
el de la madre !!!
Conclusión:
en blastocistos XX pre-implantados,
el X inactivo es el de origen paterno
Madre Padre M P
F1

24. ¿Qué le pasa a la progenie de una madre sin Tsix?
(KO para Tsix, en región que no afecta al DNA Xist)
*aparece el RNA Xist
de la madre!!! *
Jeannie Lee, Harvard
M P M PP
FF11

25. Mirando los blastocistos pre-implantación wt y KO
detección de RNA Xist mediante RNA-FISH
¿consecuencias de este
KO en la vida de los
ratones?
estos embriones mutantes
knock out
tienen problemas de
superviviencia:
se les inactiva el XM que
tendría que estar activo !!
en los pocos embriones XX
que sobreviven, después de
la implantación y borrón y
cuenta nueva:
se inactiva 1 solo X, pero no
al azar:
preferentemente es en el X
mutado
(y en machos sobrevivientes,
el único X no se inactiva?)
Jeannie Lee, Harvard
Cell 103, 17–27 (2000)
En cambio los mutantes XM XPΔ no tienen problemas porque de todos modos XP estaría inactivo
en estas ratonas, después de la implantación, la inactivación del X no es al azar: preferentemente es el X mutado

26. Modelo sencillo de inactivación del cromosoma X
muestra que el imprinting de todo el X (antes de la implantación) se deberia al imprinting de Tsix (en su IC)
metilación?
borrón y cuenta nueva
IC = Imprinting Center
femenino
Modelo consistente con el cuerpo XY en células germinales masculinas

27. modelo integrador que muestra asociación entre
RNAs Xist/Tsix y marcas epigenéticas conocidas
Navarro et al.
GENES & DEVELOPMENT (2005) 19:1474-1484
Tsix induces efficient H3-K4 methylation ○
over the entire Xist/Tsix unit.
RNA Xist
origen Paterno
RNA Tsix
/
/
/
RNA Xist
RNA Xist
borrón y cuenta nueva
Ojo!!!:
metilación en K4H3
al azar es marca activadora

28. Comprobación experimental (in vivo) del “modelo del beso”
(Jeannie Lee, Science 2006)
ocurrió
beso
Xic, green
Tsix, red.
DAPI, blue
para ver
resto del
nucleo
XX ES
cells in
vivo
luego de extraer los
embriones a distintos
tiempos (de distintas
ratonas preñadas) :
DNA FISH in vitro
para ambos X
(verde y rojo)
RNA FISH para
Xist (rojo): se ve
En 1 X solamente
MEFs
Xic DNA, green
Xist RNA, red
Enriquecimiento de
K27H3 en cromosoma
con Xist RNA
se separan

29. Modelos de inactivación al azar del cromosoma X
en mamíferos
Enjambre de factores bloqueadores
de la inactivación, que quedan finalmente
agregados y unidos a 1 solo X

30. Symmetry-Breaking Model for X-Chromosome Inactivation
modelo b) del “enjambre” de la diapo anterior mediante simulación computacional
Mario Nicodemi & Antonella Prisco
PHYSICAL REVIEW LETTERS (2007)
Variables independientes a setear::
• constante cinética de difusion "k" de Arrhenius
• E = energía entre moléculas de factor de activación
(valor alto = molec. “pegajosa”)
• distancia entre los dos X
• tiempo
Variable dependiente (output):
distribución de moléculas en cada X
When E = 0, a random walk diffusion is found.
The evolution is drastically different for E = 2.4kT, where
droplets (swarm) of particles are formed, ending up in a single
cluster overing just one of the two equivalent chromosomes and,
thus, breaking their binding symmetry.
El modelo encaja mejor cuanto menor sea la distancia
entre los dos Xs,
consistente con el modelo intuitivo del beso
También consistente con situación artificial de 3 X
y queda 1 solo activo
La molécula pegajosa de este modelo bien podria ser
un activador de Tsix. Channnn!
un X el otro X

31. Y en insectos?
es al revés que en mamiferos:
Weake & Workman, Nature Structural & Molecular Biology 16, 801 - 803 (2009)
hay un complejo proteico acetilador de histonas
(HAT) en células de machos que garantiza la
doble expresión de genes en el único
cromosoma X para igualar el nivel de expresión
en hembras que tienen dos X !!

32. Para tener en cuenta….
• los genes sujetos a imprinting evaden las oleadas de metilación y
desmetilación que ocurren en la reprogramación epigenética en el
desarrollo embrionario en mamíferos
• El imprinting puede perderse en animales clonados por transferencia
nuclear porque se forma un cigoto “parcialmente asexual” que no se
originó a partir de ambas líneas germinales, donde normalmente se
establecen las marcas de imprinting
• Se ha revelado el “imprintoma” de cerebro de ratón adulto (Gregg et
al, agosto 2010): cruzas de ratones endocriados de dos diferentes
cepas (para aprovechar polimorfismos y así después rastrear el origen
parental). En las crías F1 (heterocigotas) se hizo RNA-seq masiva
(pirosecuenciación de los cDNAs). Se observó sesgo en la expresión
materna o paterna de 1300 loci.

33. ¿Y la ventajas adaptativas del impriting?
Morison et al., Trends Genet. 21: 457-65 (2005)
Difíciles de explicar pues el imprinting hace perder la obvia ventaja de la diploidía
1) Hay una teoría (Ishino, Develop. Growth Diff., 2010). que sostiene que el imprinting
surgió en la evolución como defensa contra retrotransposición en una de las dos líneas
germinales (en ambas hubiera sido letal). Los autores la fundamentan invocando a los
genes parental expressed genes (peg), sujetos a imprinting (tienen DMRs) y asociados a
la formación de la placenta, con similitud de secuencia a retrotranposones
2) Hipótesis evolutiva del “Conflicto Genético”
(“cierra” para IGF2, pero no para IGF2-r)
En especies que muestran paternidad mútiple en 1 evento reproductivo (“poliandria”)….
• el padre privilegia su propia paternidad a través del tamaño de su descendencia, incluso a
expensas de los medio-hermanos. Y lo hace transmitiendo epialelos activos de genes que
promueven el crecimiento fetal, p. ej. IGF2.
• un interés de la madre es distribuir equitativamente sus recursos en toda su progenie, aunque
nazcan pequeños. Y lo hace transmitiendo epialelos inactivos de genes que promueven el
crecimiento fetal, p. ej. IGF2.
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Además, en el caso de IGF2, la ausencia de imprinting causaría su sobre-expresión y mayor
propensión al tumor de Wilms