.

2. Definiciones
La cromatografía es un método
físico de separación en el que
los componentes a separar se
distribuyen entre dos fases, una
estacionaria (fase estacionaria) y
otra que se mueve (fase móvil)
en una dirección definida. Puede
ser analítica (lo que la limita a
dar únicamente un diagnóstico
de los componentes de la
mezcla) o preparativa (en la que
se aíslan cantidades
ponderables de compuestos).

3. Definiciones
Los dos tipos principales son la cromatografía de gases
(GC) y la cromatografía de líquidos (LC).
En la GC se separan sustancias gaseosas con base en su
adsorción o partición en una
Fase estacionaria a partir de
una fase gaseosa.

4. Definiciones
La LC comprende técnicas como la
de exclusión de tamaño (separación
basada en el tamaño molecular), de
intercambio iónico (separación
basada en cargas eléctricas) y de
cromatografía de líquidos de alta
eficiencia (HPLC, high performance
liquid chromatography), basada en la
adsorción o separación de una fase
líquida. Algunos autores prefieren el
término cromatografía de líquidos a
alta presión(HPLC, high pressure
liquid chromatography).

5. Principio de la separación
Cada compuesto E (eluato)
posee una diferente
constante de reparto, que
es la cuantificación de su
distribución entre las dos
fases, lo que condiciona su
tiemon de residencia o
avance en el lecho
cromatográfico.
K = [E]e/[E]m

6. Principio de la separación
Las dos fases son la
estacionaria y la móvil.
Ambas compiten por los
eluatos, y mientras más se
favorezca la retención por
parte de la fase estacionaria,
el compuesto se eluirá más
lentamente. Los poco
retenidos lo harán más
rápidamente,
consiguiéndose así la
separación.

7. Principio de la separación
En esta figura se aprecia la distribución de dos
sustancias, A y B, a lo largo de una columna
cromatográfica en una separación típica.

8. Principio de la separación
Aunque hay diversas formas de cromatografía,
nominalmente hay equilibrio entre dos fases, una móvil y
una estacionaria (nunca se alcanza realmente el
equilibrio). Al agregar continuamente más fase móvil, los
analitos se distribuirán entre las dos fases y terminarán
por ser eluidos, y si la distribución es lo suficientemente
distinta
para las
diversas
sustancias,
terminarán
por
separarse.

9. Cromatografía de adsorción
La fase estacionaria es un sólido
sobre el que se adsorben los
eluatos; la móvil puede ser un
líquido (cromatografía líquido-
sólido) o un gas (cromatografía
gas-sólido). Los eluatos se
distribuyen entre las dos fases
por una combinación de
procesos de sorción y desorción.
La cromatografía en capa delgada es un ejemplo: en
ella la fase estacionaria es un plano en la forma de un
sólido soportado sobre una placa inerte, y la móvil es
un líquido.

10. Cromatografía de partición
La fase estacionaria es un líquido
soportado en un sólido inerte. La móvil
puede ser también un líquido
(cromatografía de partición líquido-
líquido) o bien un gas (cromatografía
gas-líquido, GLC).
En el modo normal (cromatografía de
fase normal) la partición líquido-líquido
usa una fase estacionaria polar (como
metanol sobre sílice) con una fase móvil
no polar (como hexano), reteniéndose así
los compuestos polares. Si la fase
estacionaria es no polar, se habla de
cromatografía de fase inversa o reversa.

11. Cromatografía de intercambio
iónico
El mecanismo
de
separación se
basa en
equilibrios de
intercambio
iónico. Se usa
una resina de
intercambio
iónico como
fase
estacionaria.

12. Cromatografía de exclusión de
tamaño
Aquí se separan
moléculas
solvatadas de
acuerdo con su
tamaño gracias
a su facilidad de
penetrar en una
estructura
como la de una
criba (la fase
estacionaria).

13. Métodos automatizados
En los equipos de GC o
de HPLC las columnas
cromatográficas puede
empacarse con partículas
pequeñas que
constituyen la fase
estacionaria
(cromatografía de
adsorción), o puede
recubrirse con una capa
delgada de fase líquida
(cromatografía de
partición).

14. Métodos automatizados
En la cromatografía de gases, la forma más común en la
actualidad es una columna capilar en la que
micropartículas o un líquido recubren la pared interna
del tubo capilar.

15. Eficiencia de la columna
Se halla expresada en función del número de sus platos
teóricos (concepto derivado de la teoría de la
destilación), cada uno de los cuales corresponde a una
de las etapas de equilibrio.
Una eficiencia elevada se tiene con un número elevado
de platos teóricos.
La altura de plato H equivale a
la longitud de una columna
dividida entre el número de
platos teóricos, por lo que para
que la columna no sea larga, H
debe ser tan corta como sea
posible.

16. Eficiencia de la columna
Se puede calcular el número de platos o eficiencia de un
cromatograma con la ecuación:
donde N es el número de platos de una columna con
respecto a determinado compuesto; tR es el tiempo de
retención y wb es el ancho del máximo medido en la
base, en las mismas unidades que tR.

17. Eficiencia de la columna

18. Se debe notar que wb no es el ancho de la base del
máximo, sino el obtenido a partir de la intersección
en el eje de las abscisas con tangentes trazadas en
los puntos de inflexión a cada lado del máximo.
Eficiencia de la columna

19. Calcula el número de platos en la columna que genera
el máximo cromatográfico en el siguiente
cromatograma.
Ejemplo: calculando eficiencia..

20. Ejemplo: calculando eficiencia.
52.3
9

21. El número efectivo de platos Nefec corrige los platos
teóricos por volumen muerto (o vacío), por lo que es
una medida del número real, útil, de platos en una
columna. Aquí t’R es el tiempo de retención corregido =
tR – tM; tM = tiempo que requiere la fase móvil para
atravesar la columna = que corresponde con el tiempo
que tardaría en aparecer un eluato sin retención =
tiempo muerto.
Ejemplo: calculando eficiencia.

22. Para los máximos asimétricos se emplea la ecuación de
Foley-Dorsey.
Máximos asimétricos

23. Una vez conocido el número de platos se
puede obtener H (en cm o mm/plato
dividiendo la longitud L
de la columna entre N. Suele determinarse
para el último compuesto en eluir.
El ancho del máximo está relacionado con
H, y es más angosto a medida que H
decrece. La altura efectiva de plato Hefec es
L/Nefec.
Para una columna de (HPLC) bien diseñada,
H debe ser dos a tres veces el diámetro de
partícula. Son típicos los valores de 0.01 a
0.03 mm.
Altura del plato

24. Importancia del tamaño de
partícula
Para una columna de HPLC, H debe ser 2-3 veces el
diámetro de partícula (valor típico = 0.01 a 0.03 mm). La
eficiencia en estas
columnas se relacio-
na con el tamaño de
partícula. La gráfica
muestra N en fun-
ción de la velocidad
lineal para diferentes
tamaños de
partícula en una
columna de 10 cm.

26. Factor de retención
El factor de retención k está definido como
donde tR = tiempo de retención y tM = tiempo muerto.
k grande favorece una buena separación, pero esto
también podría representar un mayor tiempo de
residencia.
Se puede incrementar k aumentando el volumen de la
fase estacionaria.
Un cambio en k puede ser un síntoma de una
degradación de la fase estacionaria.

27. Factor de retención
El número efectivo de platos se relaciona con el factor de
retención y el número de platos efectivos como sigue:

28. Resolución
La resolución entre dos máximos Rs está definida como
sigue:
donde tR1 y tR2 son los tiempos de retención de los dos
máximos (el máximo 1 se eluye primero) y wb es el ancho
de la línea base de los máximos. Es una medida de la
capacidad que tiene una columna para separar dos
máximos.

29. Para definir un valle entre dos máximos de igual altura es
necesaria una resolución de 0.6.
Un valor de 1.0 causa un traslape del 3% de dos máximos
de igual ancho, y se considera lo mínimo en una
separación para permitir una buena cuantificación.
Una resolución de 1.5 origina un traslape de 0.1% para
máximos de igual ancho e igual altura y se considera
suficiente para una resolución a nivel de la base.
Resolución

30. Resolución
La resolución se puede describir en términos
termodinámicos sin considerar el ancho del máximo. El
factor de separación α es una cantidad termodinámica
que mide la retención relativa de los analitos y se
determina por medio de:
donde t’R1 y t’R2 son los tiempos de retención corregidos
y k1 y k2 son los factores de retención correspondientes.
Este factor describe lo bien que están separados los
máximos sin considerar su ancho.

31. Resolución
Ya con este parámetro, la resolucióln se puede describir
como sigue:
Donde kprom es el promedio de los factores de capacidad
de los dos máximos. En esta ecuación se relaciona la
resolución con la eficiencia, esto es, el ensanchamiento
de bandas y el tiempo de retención, y se conoce como
ecuación de resolución o ecuación de Purnell.

32. Ejemplo: calculando factor de
separación y resolución.
Se separan etanol y metanol en una columna capilar de
cromatografía de gases y sus tiempos de retención
respectivos son 370 y 385 s. Los anchos de base
respectivos (wb) son 16.0 y 17.0 s. El máximo no
retenido se presenta a los 10.0 s. Calcula el factor de
separación y la resolución.

33. Ejemplo: calculando factor de
separación y resolución.
Usa el máximo de la elución más retardado para
calcular N:
Ahora determina α:

34. Ejemplo: calculando factor de
separación y resolución.
Obtén ahora kprom:

35. Ejemplo: calculando factor de
separación y resolución.
Finalmente, obtén Rs:

36. Cromatógrafo de gases.

37. Cromatógrafo de gases.

39. Con un cromatógrafo de gases se
pueden determinar muchísimos
compuestos, aunque hay limitaciones: los
analitos deben ser volátiles y estables a
las temperaturas que se usan, por lo
regular, de 50 a 300 ºC.
La GC es útil para todos los gases, la
mayor parte de las moléculas orgánicas
no ionizadas sólidas o líquidas con hasta
alrededor de 25 carbonos, muchos
compuestos organometálicos (se pueden
preparar derivados volátiles de iones
metálicos).
Posibilidades.

40. Si los compuestos no son
volátiles o estables, con
frecuencia se pueden
preparar derivados
adecuados para su
análisis por GC. Este
método no se puede
usar para sales ni para
macromoléculas; en esos
casos, lo más
generalizado es usar
HPLC.
Posibilidades.

41. Columnas.
Tres generaciones en GC.
Separación de aceite de
menta en
• Columna empacada de ¼
in x 6 ft (i. e. 6.35 mm x
1.83 m, arriba).
• Columna capilar de acero
inoxidable de 0.03 in x 500
ft (i. e. 0.76 mm x 152.4 m,
centro).
• Columna capilar de vidrio
de 0.25 mm x 50 m (abajo).

42. Fases estacionarias.
Se han propuesto más de mil
fases estacionarias para CG. La
selección de la fase estacionaria
es crítica para alcanzar
selectividad, y
se han hecho esfuerzos para
predecir la selección adecuada
de la fase líquida inmóvil para no
recurrir sólo a las técnicas de
ensayo y error. A menudo, las
fases se seleccionan de acuerdo
con su polaridad, teniendo en
cuenta que “lo semejante
disuelve a lo semejante”.

44. Gases portadores o de arrastre
Los gases empleados en GC son de ultra alta pureza.
Se pueden usar helio, que es caro; no obstante, es el
más usado. Está también el hidrógeno, más barato
pero con el gran inconveniente de su elevada
exposividad. Finalmente, contamos también al
nitrógeno, que es
barato, seguro,
eficiente pero que se
difunde más lento.

45. HPLC.

46. HPLC.

47. Fase estacionaria para HPLC.
Partículas esféricas de sílice
porosa, 10 µm; aumento 800x.
Las partículas son totalmente
porosas, con poros de 100 Å.
Se encuentran disponibles
como sílice base para
cromatografía de adsorción, o
con fases adheridas.

48. Disolventes para HPLC.
En HPLC se emplean
disolventes de diferente
polaridad. Si la fase
estacionaria es reversa,
se emplea agua, acetato
de etilo, acetona,
tetrahidrofurano,
acetonitrilo (como el de
la imagen), etc.

49. Cromatografía en capa delgada.
La cromatografía de capa delgada (TLC, thin-layer
chromatography) es una forma plana de
cromatografía que se aplica en el cribado a gran
escala para análisis cualitativo, aunque también se
puede usar en análisis cuantitativos.

50. Cromatografía en capa delgada.
La fase estacionaria es una capa delgada de
adsorbente finamente dividido soportado sobre una
placa de vidrio o de aluminio. Cualquiera de los
sólidos que se usan en cromatografía de líquidos en
columna se puede usar aquí, siempre que se pueda
encontrar un aglutinante adecuado para tener una
buena adherencia a la placa.

51. Cromatografía en capa delgada.
El experimento puede ser a escala analítica o
preparativa (en la imagen). La fase estacionaria suele
ser sílice y a menudo se le adiciona adicionado una
sustancia reveladora (sobretodo en placas a nivel
analítico).

52. Cromatografía en capa delgada.
El revelador permite que, al someter a la
luz UV a este tipo de placas, pueda
revelarse la presencia de los diferentes
eluatos.

53. Cromatografía en capa delgada.
Otros reveladores son
la vainillina, el sulfato
cérico Ce(SO4)2 o la
ninhidrina
(izquierda,muy útil
para revear la
presencia de
aminoácidos) más
calentamiento, o bien
el yodo elemental o
metálico, I2 (derecha).

54. Cromatografía en capa delgada.

55. Cromatografía en capa delgada.
Los compuestos se
desplazarán más (y
por tanto, poseerán
mayores valores de Rf)
si poseen menor
polaridad con
independencia del
disolvente. Si el
disolvente es polar,
todos los eluaros se
desplazarán más.

56. Cromatografía en capa delgada.
En las placas de fase
reversa los criterios se
invierten.

57. Cromatografía en columna.
La ccd sirve como criterio para llevar a cabo una
separación cromatográfica con la tradicional columna.
Uno de los criterios a seguir es el de la llamada
cromatografía relámpago: la columna será isocrática
(esto es, se empleará una sola mezcla de disolventes
como fase móvil), aunque desde luego esto podrá
variarse.
El disolvente será aquel con el
que se alcance un Rf de 0.3
para el eluato de menor
polaridad de la mezcla.

58. Cromatografía en columna.
En la técnica de ccd y en cromatografía en columna el
orden de polaridad de los eluyentes, de menor a mayor,
será:
• Hexano
• Acetato de etilo
• Acetona
• Metanol
Se pueden emplear otros desde luego, pero nunca agua
(hablando de fase normal).