Este documento describe el desarrollo de un sensor amperométrico de glucosa utilizando las enzimas glucosa oxidasa y peroxidasa de rábano. Se estudió el sistema redox ferroceno/ferricinio mediante voltamperometría cíclica y se calibró el sensor para determinar glucosa en un jarabe mediante adiciones estándar.

1. Construcción de un biosensor amperométrico de glucosa.
Cuantificación de glucosa en un jarabe.
Daniel Martín Yerga
Resumen
En este trabajo se presenta un sensor amperométrico para la determinación de glucosa en una
muestra de jarabe. El sensor se preparó utilizando pasta de carbono, ferricinio y las enzimas
GOD y HRP. Se estudió mediante voltamperometría cíclica el sistema ferroceno/ferricinio.
Se realizaron dos sensores, comparándolos, y obteniendo los parámetros de Michaelis-Menten
para el sistema enzimático. El rango lineal para los sensores fueron de 2x10¯4-1x10¯3M y
5x10¯5-1x10¯3M, respectivamente.
La determinación de la glucosa se realizó mediante el método de las adiciones estándar.
1. Introducción Este trabajo describe el desarrollo de un
sensor amperométrico utilizando un
La glucosa es un componente muy sistema bienzimático para la determinación
importante en la salud humana ya que es la de glucosa en un medio acuoso.
fuente principal de enegía de las células. Es
de tanta importancia ya que la deficiencia o Se ha utilizado para ello la siguientes
un aumento de los niveles de glucosa en la reacciones enzimáticas:
sangre son síntomas de enfermedades como
GOD
la hipoglucemia o la diabetes mellitus, Glucosa + O2 gluconolactona + H2O2
respectivamente. H2O2 + Ferroceno HRP
H2O + ferricinio
Por lo que el análisis de glucosa es muy Para obtener la concentración de glucosa
frecuente en laboratorios químicos y, fue reducido el ferricinio
especialmente, en laboratorios clínicos. electroquímicamente y la corriente de
reducción obtenida es directamente
En la bibliografía se han descrito proporcional a la concentración de glucosa
numerosos métodos para la determinación en la muestra.
de glucosa.
Algunos de estos métodos estan basados en
la construcción de diversos sensores 2.Experimental
amperométricos.
Se ha utilizado un electrodo de pasta de 2.1. Reactivos
carbono con GOD y un sistema
electroquímico basado en el Se realizó una disolución buffer de fosfato
dimetilferroceno, para determinar la utilizando ácido fosfórico 0.1M llevada a
glucosa en sangre o plasma. pH 7.5 con hidróxido de sodio.
Esta disolución fue utilizada como medio
Se ha estudiado en un electrodo similar el de la celda electroquímica al realizar los
efecto que tiene la especie ferrocénica ensayos.
utilizada, ya sea ésta ferroceno,
pentilferroceno y 1,1-dimetilferroceno. Para la realización del calibrado de la
glucosa se utilizaron disoluciones estándar
La HRP ha sido utilizada para la creadas a partir de glucosa sólida y llevadas
determinación de anilina utilizando un a volumen con agua destilada.
electrodo de pasta de carbono en un sistema
FIA.

2. 2.2. Preparación de los electrodos de El proceso electroquímico del
trabajo ferroceno/ferricinio fue estudiado mediante
un ensayo de voltamperometría cíclica.
Para el estudio del proceso del
ferroceno/ferricinio se crearon in situ Fue observado como se comportaba este
electrodos a partir de pasta de carbono y proceso según se variaba la velocidad de
ferroceno sólido utilizando como base un barrido de la voltamperometría.
tubo cilíndrico de teflón con un contacto Se observó también el efecto de la
metálico. agitación en las medidas obtenidas, y el
La pasta de carbono fue formada con polvo efecto en el proceso que provocaba la
de grafito y parafina. membrana de nafión en el electrodo.
Uno de los electrodos tenía una membrana
de nafión 0.5% (1:1 en isopropanol) Estos estudios se llevaron a cabo con los
mientras que el otro fue utilizado sin siguientes parámetros para la
membrana. voltamperometría cíclica:
Para la realización de la determinación de E inicial = -200 mV
glucosa y su calibrado previo, se creó un E final = 800 mV
sensor electródico con la misma pasta de
carbono que los anteriores (276mg pasta de • Calibrado con el sensor
carbono con 9mg ferroceno), pero
añadiendo esta vez dos enzimas como la Se obtuvo un calibrado para la glucosa
glucosa oxidasa (15mg) y la peroxidasa del utilizando el sensor amperométrico.
rábano silvestre (15mg). Este sensor estaba Para realizar este calibrado se utilizó una
provisto de membrana de nafión. cronoamperometría, midiendo las
corrientes de reducción del ferricinio,
según se añadían concentraciones
2.3. Instrumentación crecientes de glucosa a la celda de medida.
Se fueron añadiendo las siguientes
Se utilizó como electrodo de referencia en concentraciones crecientes de glucosa:
los ensayos un electrodo de plata/cloruro de 5x10-5, 7x10-5, 1x10-4, 2x10-4, 5x10-4, 7x10-4
plata; mientras que como electrodo auxiliar y 1x10-5 M.
se utilizó un electrodo de platino.
Previamente al calibrado se obtuvo el
El sistema de electrodos estaba conectado a voltamperograma cíclico del sensor, para
un potenciostato μAutolab, que a su vez determinar el potencial adecuado a utilizar
estaba controlado por un ordenador y el para la reducción del ferricinio.
programa GPES.
El calibrado fue obtenido por partida doble
Se utilizó una celda electroquímica de 20 con electrodos diferentes.
ml.
• Adiciones estandar para la
2.4. Preparación de la muestra determinación de la glucosa en la
muestra
La muestras de medida fueron preparadas a
partir de una dilución del jarabe de glucosa Para la determinación de la muestra fue
en agua destilada. usado un método de adiciones estándar,
donde se iba midiendo la corriente de
2.5. Procedimiento reducción del ferricinio, según se añadían
concentraciones crecientes y definidas de
• Estudio del proceso del glucosa a la disolución de medida de la
ferroceno/ferricinio muestra.

3. 3. Resultados y discusión sin membrana - con agitación - 1.5 V/s
1E-4
• estudio del proceso 8E-5
ferroceno/ferricinio 6E-5
4E-5
sin membrana
2E-5
con agitación
i (A)
0E+0
Los datos que se obtuvieron para el -2E-5
electrodo de trabajo sin membrana, con -4E-5
agitación en la celda fueron los siguientes: -6E-5
-8E-5
vel barrido ip (uA) Ep (V) -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
(mV/s) E (V)
10 17.32 0.334
Hay varias diferencias entre los dos
25 17.47 0.334
voltamperogramas. La más importante es
50 20.00 0.347 que en el voltamperograma de 100mV/s, no
75 21.33 0.365 hay pico de reducción (lo mismo ocurrió
para velocidades menores), mientras que en
100 23.81 0.368 el voltamperograma para 1.5V/s, se puede
1000 53.45 0.531 observar un pico hacía 0.15V que
corresponde a la reducción del ferricinio.
Como se puede observar en los datos
obtenidos, la corriente del pico de En el caso de velocidades menores no se
oxidación obtenida fue aumentando según observa este pico ya que el ferricinio es
se aumentaba la velocidad de barrido. soluble en el medio utilizado y se disuelve
No se obtuvo un pico de reducción por las en la disolución con lo que no da señal de
razones explicadas posteriormente. reducción.
En el caso de la velocidad de 1.5V/s, al ser
El voltamperograma cíclico obtenido para la velocidad tan alta, al ferricinio no le da
la velocidad de barrido de 100 mV/s fue: tiempo a extenderse en el seno de la
disolución sino que se encuentra todavía en
sin mebrana - con agitación - 100 mV/s
3.00E-05
las cercanías del electrodo y produce la
señal de reducción.
2.50E-05
También se puede observar como a esta
2.00E-05 velocidad el pico de oxidación es más
1.50E-05 achatado.
i (A)
1.00E-05
5.00E-06
0.00E+00
-5.00E-06
-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
E (V)
Mientras que el correspondiente para una
velocidad de barrido de 1.5 V/s fue:

4. sin membrana con membrana
sin agitación con agitación
Los datos obtenidos para un electrodo Los datos obtenidos para las medidas de
preparado sin membrana, pero sin agitación voltamperometría cíclica con un electrodo
en la celda son los siguientes: preparado con nafión y con agitación en la
celda fueron los siguientes:
vel barrido ip (uA) Ep (V)
(mV/s) vel barrido ip (uA) Ep (V)
10 f 29.76 0.381 (mV/s)
b -23.90 0.246 10 f - -
25 f 31.23 0.384 b -63.10 0.171
b -31.35 0.236 25 f 45.63 0.378
50 f 37.13 0.378 b -101.8 0.145
b -39.50 0.228 50 f 80.62 0.433
75 f 41.54 0.389 b -129.0 0.127
b -44.10 0.212 75 f 79.91 0.443
100 f 45.81 0.386 b -148.9 0.119
b -48.48 0.220 100 f 93.95 0.461
b -172.3 0.109
En este caso se obtuvieron dos picos, uno
para la oxidación (forward) y otro para la Prácticamente el comportamiento es similar
reducción (backward). a los casos que se describieron
Los dos picos siguen el mismo anteriormente, exceptuando que se obtienen
comportamiento según se va aumentando la unos picos de valores mucho más grandes.
velocidad de barrido, y es el de aumentar su En el voltamperograma para 10 mV/s de
valor de corriente. velocidad de barrido no se obtuvo un pico
Por su parte, el potencial de pico, de oxidación.
prácticamente no varía.
El voltamperograma obtenido para la
El voltamperograma obtenido para 100mV/ velocidad de barrido de 100 mV/s fue:
s fue el siguiente:
sin membrana - sin agitación - 100 mV/s con membrana - con agitación - 100 mV/s
5E-5 3E-4
4E-5
2E-4
3E-5
2E-5 1E-4
1E-5
-1E-20
i (A)
0E+0
i (A)
-1E-5 -1E-4
-2E-5
-2E-4
-3E-5
-4E-5 -3E-4
-5E-5 -0.50 0.00 0.50 1.00
-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 E (V)
E (V)
El voltamperograma es más achatado que si
Se pueden observar los picos de oxidación en el electrodo no existe la membrana de
y reducción para el sistema nafión, pero se pueden observar los dos
feroceno/ferricinio. picos para los procesos de oxidación y de
reducción, respectivamente.

5. con membrana
sin agitación Se puede decir a partir de estos
voltameprogramas que el par
Por último se observó el comportamiento ferroceno/ferricinio es un sistema
del voltamperograma cíclico utilizando un reversible.
electrodo con membrana y agitando la
mezcla, obteniendo los siguientes datos: • Calibrado con el sensor
vel barrido ip (uA) Ep (V) Se obtuvo un calibrado para cada uno de
(mV/s) los sensores realizados:
10 f 20.44 -
b -27.13 0.171
Sensor 1
25 f 24.44 0.378
b -40.66 0.145
El potencial que se eligió para la reducción
50 f 35.24 0.433 de ferricinio en la cronoamperometría fue
b -92.00 0.127 de -0.15V.
75 f 33.40 0.443
b -109.80 0.119
100 f 35.80 0.461
La gráfica obtenida en la
b -110.60 0.109 cronoamperometría fue la siguiente:
Cronoam perom etría (sensor 1)
-2.5E-6
Los voltamperogramas obtenidos fueron
más achatados por lo que los datos para las -2.7E-6
corrientes de pico también fueron menores
que en los anteriores casos. De todos -2.9E-6
modos, el comportamiento fue similar y la
i (A)
-3.1E-6
corriente de pico aumenta al aumentar la
velocidad de agitación. -3.3E-6
Se obtuvo el siguiente voltamperograma -3.5E-6
para la velocidad de 100 mV/s:
con membrana - sin agtación - 100 mV/s 300 500 700 900
4E-4 t (s)
3E-4
2E-4 Se pueden observar correctamente las
1E-4 señales que el electrodo obtenía según se
0E+0 iban añadiendo concentraciones crecientes
i (A)
-1E-4 de glucosa.
El sensor comenzó a detectar las señales
-2E-4
para la concentración de 2x10-4M.
-3E-4
-4E-4
-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
E (V)
El voltamperograma es muy parecido al
obtenido con agitación.
Se obtuvo el potencial formal del par
ferroceno/ferricinio de 0.306 V. Para ello
se utilizaron los datos obtenidos utilizando
el electrodo sin membrana y sin agitación.

6. Se obtuvieron los siguientes datos para la Igualmente que en el anterior sensor, este
realización del calibrado: sensor detectó correctamente las señales al
ir añadiendo concentraciones crecientes de
[glucosa] (M) i (nA) glucosa.
-4 El sensor comenzó a detectar las señales
2x10 50
para la primera concentración de 5x10-5M.
5x10-4 360 Desafortunadamente la segunda y tercera
7x10 -4
570 medidas fueron incorrectas, ya que
-3
accidentalmente cayó una punta de
1x10 820
micropipeta en la celda de medida.
Mientras que la gráfica de los datos y la Después de extraer la punta de la celda y
recta de regresión calculada para esos datos cuando se volvió a estabilizar las señales,
fue: se pudo continuar obteniendo datos válidos.
Calibrado (sensor 1)
Se obtuvieron los siguientes datos con este
900
sensor para la realización del calibrado:
800
700
600 [glucosa] (M) i (nA)
500 -5
5x10 140
i (nA)
400
300 2x10-4 190
200 -4
100
5x10 510
0 7x10-4 690
0E+0 2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
-3
[glucosa] (M) 1x10 950
En este caso la gráfica para la recta de
i = 967647.1 - 130.6 [glucosa]
calibrado obtenida fue la siguiente:
r = 0.998
Calibrado (sensor 2)
Sensor 2 1000
900
El potencial que se eligió para la reducción 800
de ferricinio en la cronoamperometría fue 700
600
de 0V.
i (nA)
500
400
La gráfica obtenida en la 300
cronoamperometría fue la siguiente: 200
100
0
cronoamperometría (sensor 2)
0E+0 2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
-9.3E-7 [glucosa] (M)
-1.1E-6
i = 889690.7 + 60.1 [glucosa]
-1.3E-6 r = 0.996
i (A)
-1.5E-6 Comparando los dos sensores, se puede ver
que los dos tienen unas pendientes de la
-1.7E-6 recta de calibrado en un rango similar y que
los dos poseen una linealidad buena para
los datos que se obtuvieron.
0 500 1000 1500
t (s)

7. El segundo sensor podría decirse que fue • Adiciones estandar
más sensible su comportamiento ya que
obtiene señales desde la primera Muestra 1
concentración de glucosa añadida, y
también por que los valores de intensidad Se obtuvieron los siguientes datos en la
que obtiene son mayores para la misma cronoamperometría utilizando el método de
concentración que los del sensor número las adiciones estándar para la muestra 1:
uno.
[glucosa] ad (M) i (nA)
Se obtuvo la gráfica de Michaelis-Menten -4
2.5x10 86
para este sensor número dos:
5.0x10-4 131
-4
Michealis-Menten 7.5x10 179
-3
0.008 1.0x10 213
0.007
Con estos datos se obtuvo la siguiente
1/intensidad (nA¯¹)
0.006
gráfica:
0.005
0.004
Adiciones estándar (M1)
0.003 250.0
0.002
200.0
0.001
0.000 150.0
i (nA)
0 5000 10000 15000 20000 25000
100.0
1/[glucosa] (M¯¹)
50.0
0.0
Para la cual los datos fueron los siguientes: 2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
[glucosa] ad (M)
1/[glucosa] (M¯¹) 1/i (nA¯¹)
Y fue calculada la concentración de
5x10-5 140 glucosa en la disolución de medida que fue
2x10-4 190 de 2.65x10-4 M.
5x10-4 510
-4
7x10 690 Muestra 2
-3
1x10 950
De la misma forma para la muestra 2
fueron obtenidos los siguientes datos en la
Con estos datos se obtuvieron los valores
cronoamperometría utilizando el método de
para la constante de Michaelis-Menten y el
las adiciones estándar:
valor de la velocidad máxima del sistema
enzimático que fueron de:
[glucosa] ad (M) i (nA)
vmax = 2.97x10 -7 2.5x10-4 98
Km = 5464.9 M-1 5.0x10 -4
139
-4
7.5x10 190
-3
1.0x10 242

8. Con estos datos se obtuvo la siguiente
gráfica: Calculando el valor medio para las
muestras medidas se tiene una
Adiciones estándar (M2) concentración de 2.4x10-4 ± 0.2x10-4 M.
300.0
4. Conclusiones
250.0
200.0 Se ha desarrollado un método muy barato
con preparación del sensor sencilla para la
i (nA)
150.0
determinación de glucosa.
100.0 El método es sensible, con una respuesta
50.0 rápida del sensor a concentraciones tan
bajas como 5x10¯5M.
0.0
Por lo tanto es un método que se debe tener
2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
[glucosa] ad (M)
en cuenta a la hora de analizar glucosa en
cualquier laboratorio, siempre que no se
necesite una gran sensibilidad, por la
Y fue calculada la concentración de facilidad de la puesto a punto y su coste.
glucosa en la disolución de medida que en
este caso fue de 2.45x10-4 M.
5. Agradecimientos
Muestra 3
Este trabajo no habría sido posible de no
Para la muestra número 3 se obtuvieron los haber contado con la ayuda de Livia Suárez
siguientes datos: y Matías Vega.
[glucosa] ad (M) i (nA) Referencias
-4
2.5x10 97
1) A.E.G. Cass, G.Davis, G.D.Francis,
5.0x10-4 145 H.A.O.Hill, I.J. Higgins, E.V.PLotkin, L.D.L.
7.5x10-4 186 Scott, A.P.F.Turner, Anal. Chem., 56 (1984)
-3
667-671
1.0x10 252
2) P.Dominguez-Sánchez, C.K.O`Sullivan,
Con estos datos se obtuvo la siguiente A.J.Miranda-Ordieres, P.Tuñon-Blanco,
gráfica: M.R.Smyth, Anal.Chim.Acta, 291 (1994)
349-356.
Adiciones estándar (M3)
300.0 3) J.Wang, L-H.Wu, Z.Lu, R.Li, J.Sánchez,
Anal.Chim.Acta, 228 (1990) 251-257.
250.0
200.0 4) S.Xianzheng, H.Jiwen, W.Xiuzhang, Sensors
and Actuators B: Chemical, 12 (1993) 33-36.
i (nA)
150.0
100.0 5) A.Amine, J.M.Kauffmann, G.J.Patriarche,
Talanta, 38 (1991) 107-110
50.0
0.0
2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
[glucosa] ad (M)
La concentración obtenida para esta
muestra fue de 2.16x10-4 M.