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Espectrometría de Fluorescencia Molecular

Introducción
El objetivo de esta práctica fue determinar quinina en un agua tónica mediante fluorescencia
molecular.
Como objetivos secundarios se estudiaron algunas características de este método, por ejemplo, la
desactivación de la fluorescencia por bromuro o la influencia de la acidez en la fluorescencia de la
quinina.
Anteriormente se obtenieron los espectros de excitación y emisión de la quinina para determinar
las longitudes de onda óptimas.
También se determinaron algunas características analíticas del método, como el límite de
detección y la reproducibilidad.

Procedimiento
La práctica se llevó a cabo en cinco etapas principales:

   ●   Obtención de los espectros de emisión y excitación de la quinina.

       Se obtuvo el espectro de emisión de la quinina barriendo desde 250 hasta 650nm,
seleccionando una longitud de onda de excitación de 300nm.
       Para obtener el espectro de excitación se barrió desde 200 hasta 400 nm, fijando la longitud
de onda de emisión óptima determinada a partir del espectro de emisión obtenido.
       Para realizar estos espectros se utilizó una disolución de 10ppb de quinina con una
concentración de H2SO4 de 0.05M.


   ●   Influencia de la acidez del medio en la fluorescencia de la quinina.

      Con disoluciones de diferentes concentraciones de H2SO4, se obtuvo la intensidad de
emisión de fluorescencia de la quinina de cada una de estas disoluciones, las cuales tenían una
concentración igual y constante de quinina de 5ppb.
      Las concentraciones de H2SO4 que se utilizaron fueron: 0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 1.5 y
2M.
      Para realizar este estudio se utilizó una longitud de onda de excitación de 300nm.


   ●   Influencia del bromuro en la fluorescencia de la quinina.

      Fue un estudio muy parecido al anterior, pero en lugar de cambiar las concentraciones de
H2SO4 en este caso se variaba la concentración de KBr en cada una de las disoluciones, mientras
que se utilizó una concentración constante y óptima de H2SO4 determinada en el estudio anterior.
También se utilizó la misma concentración de quinina que anteriormente.
      Para realizar este estudio se utilizó una longitud de onda de excitación de 300nm.

   ●   Realización de un calibrado de quinina.

       Se utilizaron las siguientes concentraciones de quinina en las disoluciones patrón: 0.1, 0.5,

                                                                                  Daniel Martín Yerga
1, 3, 5, 7, 10, 30, y 50ppb.
        Se realizó el blanco cinco veces para la posterior determinación del límite de detección y se
hizo por triplicado el patrón de 7ppb para la determinación de la precisión del método.
        A cada disolución se le añadió la cantidad óptima de H2SO4 determinada anteriormente.
        La longitud de onda de excitación utilizada esta vez fue de 350nm.


   ●   Determinación de quinina en un agua tónica.

      Se realizó la medida de tres muestras de agua tónica las cuales fueron diluidas en dos
ocasiones, primero 1:100 y finalmente, la dilución anterior fue diluida 1:500.




Resultados y Discusión

Espectro de emisión.

En el espectro de emisión se podían ver tres bandas intensas a estas longitudes de onda con los
máximos aproximadamente a 300, 400 y 610nm.
La banda de emisión a 300nm es debida a la dispersión Rayleigh a la misma longitud de onda que
la radiación de excitación, la banda a 610nm muy intensa también debida a la dispersión Rayleigh,
mientras que la banda de emisión de la quinina estaba en torno a 400nm, más ancha que las
anteriores.

Se eligió la longitud de onda de 440nm para realizar las medidas de emisión.


Espectro de excitación.

En el espectro de excitación se obtuvo una banda hacia 250nm y otra banda más ancha desde
300nm hacia mayores longitudes de onda con un máximo en 350nm.
Se eligió 350nm como la longitud de onda de excitación, excepto en los primeros estudios que se
utilizó 300nm por error.




Influencia de la acidez en la fluorescencia.


 Concentración       Señal de emisión
   H2SO4 (M)             (440nm)


                                                                                  Daniel Martín Yerga
0.01                614.07
       0.05                 604.5
        0.1                 615.9
        0.3                 645.6
        0.5                 598.3
         1                  620.2
        1.5                 633.4
         2                  615.5


En principio no se diferencian en magnitud muy importante cada una de las diferentes
concentraciones de ácido sulfúrico, así que en teoría no habría ningún problema en utilizar
cualquiera de ellas según los datos obtenidos. En la práctica elegimos usar la de 1M ya que es
preferible que haya acidez en el medio para medir la fluorescencia.



Influencia de KBr en la fluorescencia.


 Concentración       Señal de emisión
    KBr (M)              (440nm)
       0.01                594.1
       0.05                575.25
        0.1                570.2
        0.3                579.6
        0.5                569.95
         1                 542.07
        1.5                553.12
         2                 558.52


Aunque hay algunos datos que no concurren con lo esperado, se puede decir que en general, la
señal de emisión de fluorescencia disminuye a mayor concentración de KBr.




Para calcular la constante de Stern-Volmer se utilizó la siguiente ecuación y los valores de la tabla
(se desecharon algunos valores):

                             I −1= a−1 K q ∙[ Br ]/ a
                               F




                                                                                  Daniel Martín Yerga
Concentración      Inverso de la señal                                                                        Gráfica Stern-Volmer
    KBr (M)                                                                                         0.001900

       0.01              0.001683




                                                                      Inverso señal fluorescencia
                                                                                                    0.001850
       0.05              0.001738
                                                                                                    0.001800
        0.1              0.001754
                                                                                                    0.001750
         1               0.001845
                                                                                                    0.001700
Constante de desactivación:
                                                                                                    0.001650
Kq = 0.076 l/mol
                                                                                                    0.001600
                                                                                                               0     0.2    0.4      0.6   0.8      1     1.2
                                                                                                                     Concentración KBr (M)




Calibrado para la quinina.


 Concentración       Señal de                                                                                      Calibrado Quinina
     (ppb)           emisión                               900.00
        0              50.48                               800.00

       0.1             53.76                               700.00
                                      Intensidad emisión




       0.5             59.57                               600.00

        1              67.47                               500.00

                                                           400.00
        3             121.44
                                                           300.00
        5             162.18
                                                           200.00
        7             196.92
                                                           100.00
       10             256.90
                                                             0.00
       30             585.04                                        0.0                                 10.0         20.0         30.0     40.0         50.0    60.0
                                                                                                                     Concentración (ppb)
       50             793.67


Recta de regresión:
      Señal = 68.2 + 16.1·[quinina]                                                                       r = 0.997


Cálculo del límite de detección y de la precisión del método.

   Muestra           Señal
   Blanco 1          47.18
   Blanco 2          64.90


                                                                                                                                                  Daniel Martín Yerga
Blanco 3             44.17
    Blanco 4             54.66
    Blanco 5             41.48

Señal LD = 78.82
LD = 0.66 ppb


    Muestra              Señal
     7ppb-1              196.41
     7ppb-2              202.87
     7ppb-3              191.48

% RSD = 2.90%

Determinación de quinina en agua tónica.

                         Señal          Concentración
                                           (ppm)
   Muestra 1             75.56                22.98
   Muestra 2             75.35                22.33
   Muestra 3             76.12                24.72

Concentración de quinina en el agua tónica: 23 ± 1 ppm




Conclusiones
Según los resultados obtenidos se observa que en el estudio de la acidez y de la influencia de KBr
en la fluorescencia, al utilizar una longitud de onda de excitación de 300nm los resultados no son
los esperados y no se pueden determinar con facilidad los fenómenos que ocurren al cambiar el
medio en esos estudios.

Mientras que para hacer el calibrado y la determinación de quinina en el agua tónica, al haber
excitado a 350nm se obtuvieron unos resultados más óptimos con lo esperado, lo que fue debido
a que la señal de emisión se comportó de una manera más concordante con la realidad.



Cuestiones
    1. ¿Por qué no se utiliza HCl como ácido para diluir las disoluciones de quinina?

        No se utiliza HCl ya que el cloruro es un quencher de la fluorescencia de la quinina. A mayor concentración de
cloruro en la disolución de medida, la fluorescencia disminuirá en mayor medida por lo que se obtendrían errores en
las señales de fluorescencia.


                                                                                                Daniel Martín Yerga
Aunque al realizar el calibrado se eliminaría el error en su conjunto, pero las señales de emisión obtenidas
serían mucho más bajas que sin presencia de cloruro y la sensibilidad del método se vería reducida en gran medida.



    2. ¿Se podría determinar bromuro utilizando su capacidad de desactivación de la fluorescencia de
       quinina? Justifica la respuesta.

       Se podría determinar ya que la intensidad de la fluorescencia de la quinina es proporcional al inverso de la
concentración de bromuro. Se podría hacer un calibrado representando la intensidad de emisión frente al inverso de la
concentración de bromuro, por lo que midiendo la muestra se podría obtener la concentración que contiene de
bromuro, siempre y cuando no haya otros interferentes que influyan en la fluorescencia de la quinina.


    3. ¿Qué interferentes podría contener un agua tónica en la determinación de quinina? Justifica la
       respuesta.

        El interferente más importante que podría haber en agua tónica es el ion cloruro que como se ha dicho en la
cuestión 1 es un quencher de la fluorescencia de la quinina.
Pero como el cloruro está en bajas concentraciones en el agua tónica el problema no es apreciable y se puede
despreciar esta interferencia.


    4. Explica las diferencias y/o analogías entre filtro interno y autoabsorción.

         Filtro interno es cuando hay mucha concentración de la sustancia a determinar en la muestra, con lo que hace
que se invierta la fluorescencia y a concentraciones cada vez más altas del analito se emita fluorescencia en menor
medida.
         Autoabsorción se produce cuando un pico de emisión de fluorescencia se solapa con una longitud de onda a
la cual exista absorción de alguna molécula que se encuentre en el medio. Este efecto hace disminuir la señal de
fluorescencia que se recoge en el detector ya que parte de la radiación emitida es absorbida y no llega al detector.


    5. Explica el significado químico-físico de la constante de Stern-Volmer.

       La constante de Stern-Volmer se podría definir por la siguiente ecuación:
                                         Kq=kq /kf kic kisc
       En general, da una idea de la velocidad de desactivación de la fluorescencia de una sustancia debida al
quenching.
       Las constantes de la ecuación son las siguientes:
       kq: constante de velocidad de quenching
       kf: constante de velocidad de la fluorescencia
       kic: constante de velocidad de la conversión interna
       kisc: constante de velocidad del cruce entre sistemas




                                                                                               Daniel Martín Yerga

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Determinación de quinina en agua tónica mediante Espectrometría de Fluorescencia Molecular

  • 1. Espectrometría de Fluorescencia Molecular Introducción El objetivo de esta práctica fue determinar quinina en un agua tónica mediante fluorescencia molecular. Como objetivos secundarios se estudiaron algunas características de este método, por ejemplo, la desactivación de la fluorescencia por bromuro o la influencia de la acidez en la fluorescencia de la quinina. Anteriormente se obtenieron los espectros de excitación y emisión de la quinina para determinar las longitudes de onda óptimas. También se determinaron algunas características analíticas del método, como el límite de detección y la reproducibilidad. Procedimiento La práctica se llevó a cabo en cinco etapas principales: ● Obtención de los espectros de emisión y excitación de la quinina. Se obtuvo el espectro de emisión de la quinina barriendo desde 250 hasta 650nm, seleccionando una longitud de onda de excitación de 300nm. Para obtener el espectro de excitación se barrió desde 200 hasta 400 nm, fijando la longitud de onda de emisión óptima determinada a partir del espectro de emisión obtenido. Para realizar estos espectros se utilizó una disolución de 10ppb de quinina con una concentración de H2SO4 de 0.05M. ● Influencia de la acidez del medio en la fluorescencia de la quinina. Con disoluciones de diferentes concentraciones de H2SO4, se obtuvo la intensidad de emisión de fluorescencia de la quinina de cada una de estas disoluciones, las cuales tenían una concentración igual y constante de quinina de 5ppb. Las concentraciones de H2SO4 que se utilizaron fueron: 0.01, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1, 1.5 y 2M. Para realizar este estudio se utilizó una longitud de onda de excitación de 300nm. ● Influencia del bromuro en la fluorescencia de la quinina. Fue un estudio muy parecido al anterior, pero en lugar de cambiar las concentraciones de H2SO4 en este caso se variaba la concentración de KBr en cada una de las disoluciones, mientras que se utilizó una concentración constante y óptima de H2SO4 determinada en el estudio anterior. También se utilizó la misma concentración de quinina que anteriormente. Para realizar este estudio se utilizó una longitud de onda de excitación de 300nm. ● Realización de un calibrado de quinina. Se utilizaron las siguientes concentraciones de quinina en las disoluciones patrón: 0.1, 0.5, Daniel Martín Yerga
  • 2. 1, 3, 5, 7, 10, 30, y 50ppb. Se realizó el blanco cinco veces para la posterior determinación del límite de detección y se hizo por triplicado el patrón de 7ppb para la determinación de la precisión del método. A cada disolución se le añadió la cantidad óptima de H2SO4 determinada anteriormente. La longitud de onda de excitación utilizada esta vez fue de 350nm. ● Determinación de quinina en un agua tónica. Se realizó la medida de tres muestras de agua tónica las cuales fueron diluidas en dos ocasiones, primero 1:100 y finalmente, la dilución anterior fue diluida 1:500. Resultados y Discusión Espectro de emisión. En el espectro de emisión se podían ver tres bandas intensas a estas longitudes de onda con los máximos aproximadamente a 300, 400 y 610nm. La banda de emisión a 300nm es debida a la dispersión Rayleigh a la misma longitud de onda que la radiación de excitación, la banda a 610nm muy intensa también debida a la dispersión Rayleigh, mientras que la banda de emisión de la quinina estaba en torno a 400nm, más ancha que las anteriores. Se eligió la longitud de onda de 440nm para realizar las medidas de emisión. Espectro de excitación. En el espectro de excitación se obtuvo una banda hacia 250nm y otra banda más ancha desde 300nm hacia mayores longitudes de onda con un máximo en 350nm. Se eligió 350nm como la longitud de onda de excitación, excepto en los primeros estudios que se utilizó 300nm por error. Influencia de la acidez en la fluorescencia. Concentración Señal de emisión H2SO4 (M) (440nm) Daniel Martín Yerga
  • 3. 0.01 614.07 0.05 604.5 0.1 615.9 0.3 645.6 0.5 598.3 1 620.2 1.5 633.4 2 615.5 En principio no se diferencian en magnitud muy importante cada una de las diferentes concentraciones de ácido sulfúrico, así que en teoría no habría ningún problema en utilizar cualquiera de ellas según los datos obtenidos. En la práctica elegimos usar la de 1M ya que es preferible que haya acidez en el medio para medir la fluorescencia. Influencia de KBr en la fluorescencia. Concentración Señal de emisión KBr (M) (440nm) 0.01 594.1 0.05 575.25 0.1 570.2 0.3 579.6 0.5 569.95 1 542.07 1.5 553.12 2 558.52 Aunque hay algunos datos que no concurren con lo esperado, se puede decir que en general, la señal de emisión de fluorescencia disminuye a mayor concentración de KBr. Para calcular la constante de Stern-Volmer se utilizó la siguiente ecuación y los valores de la tabla (se desecharon algunos valores): I −1= a−1 K q ∙[ Br ]/ a F Daniel Martín Yerga
  • 4. Concentración Inverso de la señal Gráfica Stern-Volmer KBr (M) 0.001900 0.01 0.001683 Inverso señal fluorescencia 0.001850 0.05 0.001738 0.001800 0.1 0.001754 0.001750 1 0.001845 0.001700 Constante de desactivación: 0.001650 Kq = 0.076 l/mol 0.001600 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Concentración KBr (M) Calibrado para la quinina. Concentración Señal de Calibrado Quinina (ppb) emisión 900.00 0 50.48 800.00 0.1 53.76 700.00 Intensidad emisión 0.5 59.57 600.00 1 67.47 500.00 400.00 3 121.44 300.00 5 162.18 200.00 7 196.92 100.00 10 256.90 0.00 30 585.04 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 Concentración (ppb) 50 793.67 Recta de regresión: Señal = 68.2 + 16.1·[quinina] r = 0.997 Cálculo del límite de detección y de la precisión del método. Muestra Señal Blanco 1 47.18 Blanco 2 64.90 Daniel Martín Yerga
  • 5. Blanco 3 44.17 Blanco 4 54.66 Blanco 5 41.48 Señal LD = 78.82 LD = 0.66 ppb Muestra Señal 7ppb-1 196.41 7ppb-2 202.87 7ppb-3 191.48 % RSD = 2.90% Determinación de quinina en agua tónica. Señal Concentración (ppm) Muestra 1 75.56 22.98 Muestra 2 75.35 22.33 Muestra 3 76.12 24.72 Concentración de quinina en el agua tónica: 23 ± 1 ppm Conclusiones Según los resultados obtenidos se observa que en el estudio de la acidez y de la influencia de KBr en la fluorescencia, al utilizar una longitud de onda de excitación de 300nm los resultados no son los esperados y no se pueden determinar con facilidad los fenómenos que ocurren al cambiar el medio en esos estudios. Mientras que para hacer el calibrado y la determinación de quinina en el agua tónica, al haber excitado a 350nm se obtuvieron unos resultados más óptimos con lo esperado, lo que fue debido a que la señal de emisión se comportó de una manera más concordante con la realidad. Cuestiones 1. ¿Por qué no se utiliza HCl como ácido para diluir las disoluciones de quinina? No se utiliza HCl ya que el cloruro es un quencher de la fluorescencia de la quinina. A mayor concentración de cloruro en la disolución de medida, la fluorescencia disminuirá en mayor medida por lo que se obtendrían errores en las señales de fluorescencia. Daniel Martín Yerga
  • 6. Aunque al realizar el calibrado se eliminaría el error en su conjunto, pero las señales de emisión obtenidas serían mucho más bajas que sin presencia de cloruro y la sensibilidad del método se vería reducida en gran medida. 2. ¿Se podría determinar bromuro utilizando su capacidad de desactivación de la fluorescencia de quinina? Justifica la respuesta. Se podría determinar ya que la intensidad de la fluorescencia de la quinina es proporcional al inverso de la concentración de bromuro. Se podría hacer un calibrado representando la intensidad de emisión frente al inverso de la concentración de bromuro, por lo que midiendo la muestra se podría obtener la concentración que contiene de bromuro, siempre y cuando no haya otros interferentes que influyan en la fluorescencia de la quinina. 3. ¿Qué interferentes podría contener un agua tónica en la determinación de quinina? Justifica la respuesta. El interferente más importante que podría haber en agua tónica es el ion cloruro que como se ha dicho en la cuestión 1 es un quencher de la fluorescencia de la quinina. Pero como el cloruro está en bajas concentraciones en el agua tónica el problema no es apreciable y se puede despreciar esta interferencia. 4. Explica las diferencias y/o analogías entre filtro interno y autoabsorción. Filtro interno es cuando hay mucha concentración de la sustancia a determinar en la muestra, con lo que hace que se invierta la fluorescencia y a concentraciones cada vez más altas del analito se emita fluorescencia en menor medida. Autoabsorción se produce cuando un pico de emisión de fluorescencia se solapa con una longitud de onda a la cual exista absorción de alguna molécula que se encuentre en el medio. Este efecto hace disminuir la señal de fluorescencia que se recoge en el detector ya que parte de la radiación emitida es absorbida y no llega al detector. 5. Explica el significado químico-físico de la constante de Stern-Volmer. La constante de Stern-Volmer se podría definir por la siguiente ecuación: Kq=kq /kf kic kisc En general, da una idea de la velocidad de desactivación de la fluorescencia de una sustancia debida al quenching. Las constantes de la ecuación son las siguientes: kq: constante de velocidad de quenching kf: constante de velocidad de la fluorescencia kic: constante de velocidad de la conversión interna kisc: constante de velocidad del cruce entre sistemas Daniel Martín Yerga