La transfección introduce ácidos nucleicos en células para estudiar genes o producir proteínas. Existen métodos biológicos (usando virus), químicos (fosfato de calcio, lípidos, polímeros catiónicos), y físicos (electroporación). El método ideal es eficiente, no tóxico, reproducible y fácil de usar. Factores como el estado de las células, cultivo celular, y calidad/cantidad del ADN afectan la transfección.

1. TRANSFECCIÓN
Ingeniería de Productos Biológicos
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingenierías
Campus Guanajuato
Instituto Politécnico Nacional
M.C. Guillermo Garibay Benítez

2.  La transfección es un procedimiento que
introduce ácidos nucleicos hacia las células.
 La transfección sirve para estudiar la función
de los genes o productos de los genes y
producir proteínas recombinantes en células
de mamífero.

3.  Transfección estable: el material genético
introducido tiene un gen marcador para la selección
(transgenes) los cuales son integrados en el genoma
huesped y sostienen la expresión incluso después de
que la célula huésped se replica.
 Transfección transitoria: Estos genes transitoria
transfectados solo son expresados por un periodo de
tiempo limitado y no son integrados al genoma,

4.  Hay métodos biológicos, químicos y físicos.
 El método ideal debe mostrar alta eficiencia de
transfección, baja toxicidad de las células, efectos
mínimos en la fisiología normal, y además de ser
reproducible y fácil de usar

6. Diagrama de flujo de Transfección
Cultivo de tejidos.
Conteo de Células
Resuspender las células en buffer de
electroporación
Añadir ácidos nucleicos
Transfectar células
Células en Placa

7. Analisis
Actividad
del Gen
Reportero
Western
Blot
Microscopía
Citometria
de Flujo
PCR de
tiempo real
Expresión
de
proteína
Expresión
de Gen

8. METODOS BIOLÓGICOS
 El método más utilizado es la transfección
mediada por virus
 Es altamente eficiente, y es fácil de lograr una
expresión sostenible de la expresión in vivo
de transgenes debido a la naturaleza viral de
la integración en el genoma huésped

9. Vectores Virales
Retrovirus:
 Virus Murino de Leucemia (MuLV)
 Virus de Inmunodeficiencia humana (HIV)
 Virus limfotrópico de céluasT humano (HTLV)
Virus de ADN:
 Adenovirus
 Virus adeno-asociado (AAV)
 Virus de herpes simple (HSV)

10.  Retrovirus: una clase de virus que puede crear
copias de ADN de doble cadena a partir de sus
genomas de ARN, estas copias pueden ser
integradas en los cromosomas de las células
huésped. El HIV es un retrovirus
 Adenovirus: Una clase de virus con genomas de
ADN de doble cadena que causan infecciones
respiratorias, intestinales y de ojos en humanos.
El virus del resfriado común es un adenovirusl

12.  Virus adeno-asociados: Una clase de virus
pequeño de una sola cadena de ADN que
puede insertar su material genético a un sitio
específico en el cromosoma 19.
 Virus del Herpes simple: Una clase de virus
de doble cadena de ADN que infecta un tipo
de células en particular, las neuronas.

13. VectorViral Tamaño del
Inserto de
ADN
Tipo
Celular
Expresión Inconveniencias
Retroviral 8 kb Celulas en
División
Estable Sitios de
inserción al azar
Lentivirus 9 kb Celulas en
divisón y sin
divisón
Estable Sitios de
inserción al
azar
Adenovirus 8 kb Celulas en
divisón y sin
divisón
Transitoria Altamente
inmunogenico

14. VectorViral Tamaño del
Inserto de
ADN
Tipo
Celular
Expresión Inconveniencias
Virus adeno-
asociado
(AAV)
5 kb Celulas en
divisón y sin
divisón
Estable,
localización
específica
de sitio
Requiere la
ayuda de un virus
auxiliar para
crecer, dificultad
de remover el
virus auxiliar
Virus de
Herpes
simpléx
30-40 kb Celulas en
divisón y sin
divisón
Transitoria No hay expresión
de genes durante
la infección
latente
VirusVaccinia 25 kb Celulas en
divisón
Transitoria Potenciales
Efectos
citopatologicos

15.  El retrovirus murino de leucemia (retrovirus
leukemia virus MLV) ha sido usado como un
vector viral para establecer expresión
sostenible de expresión de transgenes
 MLV integra su ADN en el genoma huésped,
por lo tanto el ADN integrado es expresado
en el huésped.
 El ADN del MLV se replica al mismo tiempo
que el genoma de la célula huésped
 Consecuentemente este se segrega en las
células hijas, lo cual permite la expresión
sostenible de la expresión del transgen

16. Desventajas
 Inmunogenicidad y citotoxicidad.
 Reacción inflamatoria
 Inserción de mutaciones, como los vectores
virales se integran en el genoma huésped al
azar, esto puede causar una disrupción de
genes encargados de suprimir tumores,
activar oncogenes o interrumpir genes
esenciales
 El empaquetamiento del virus tiene un
espacio limitado para un gen foráneo y
mantener la infectividad

17. Métodos Químicos
 Por lo general utilizan un polimero
catiónico: fosfato de calcio, lípido
catiónico o un aminoácido catiónico
 Los químicos cargados positivamente
forman complejos químicos/ácidos
nucleicos con ácidos nucleicos
cargados negativamente.
 Estos complejos cargados
positivamente son atraídos a las
membranas cargadas negativamente.

18. EFICIENCIA DE LOS METODOS DE
TRANSFECCIÓNQUÍMICOS
Depende:
 proporción de ácidos nucleicos/químicos
 pH de la solución
 Condiciones de las membranas celulares

19.  Desventaja: eficiencia de transfección baja
(comparada con los métodos de virus)
 Ventajas: Baja citotoxicidad, sin mutagénesis,
no hay acarreo de ADN extra y sin limitación
de tamaño de los ácidos nucleicos

20. Lipid-Mediated Gene Delivery
(Lipofección o Transfección de genes
basados en liposomas)
 Utiliza lípidos para causar
que la célula absorba ADN
exógeno.
 Transferencia de material
genético hacia las células
utilizando liposomas, los
cuales son vesículas que
pueden fusionarse con la
membrana celular ya que
ambos están hechos de
una membrana de
fosfolípidos

21. Ventajas de los Lípidos Desventajas
 Entrega de ácidos
nucleicos en una placa de
cultivo con alta eficiencia
 Facil de usar, pasos
mínimos requeridos,
adaptable a sistemas de
métodos “high
throughput”
 Utilizar un lípido de alta
actividad reducirá el costo
del lípido y del ácido
nucleico, y logrará
resultados efectivos
 No aplica para todos los
tipos celulares

22. Fosfato de Calcio
 Este protocolo involucra el
mezclado del ADN con
cloruro de calcio, añadiendo
este de una manera
controlada a una solución
reguladora salina/fosfato, y
permitir a la mezcla incubarse
a temperatura ambiente.
 Este paso genera un
precipitado que es dispersado
a las células en cultivo.
 El precipitado es absorbido
por las células vía endocitosis
o fagocitosis.

23. Ventajas Desventajas
 Económico.
 Alta eficiencia (depende
del tipo de célula).
 Puede ser aplicado a un
amplio intervalo de tipos
celulares.
 Puede ser usado para
transfección transitoria y
transfección estable.
 Consistencia en el reactivo
es crítica para la
reproducibilidad.
 Pequeños cambios en el pH
(+/-0.1) puede
compromoter la eficiencia
de transformación.
 Tamaño y calidad del
precipitado son cruciales.
 No se puede usar en medio
RPMI, debido a la alta
concentración de fosfato
en el medio

25. Polímeros Catiónicos
 Estos, a diferencia de los lípidos catiónicos no
contienen una porción hidrofóbica y son
completamente solubles en agua.
 Estos tienen la habilidad de condensar mas
eficientemente el ADN que los lípidos
catiónicos.

26. DEAE-Dextran
 El complejo positivo formado por
ADN:polimero forma una asociación cercana
con la membrana cargada negativamente.

27. Desventajas Desventajas
 Económico.
 Fácil de realizar y rápido.
 Puede ser aplicado a una
amplia variedad de tipos
celulares
 Altas concentraciones de
DEAE-Dextran pueden ser
tóxicas para las células.
 Eficiencias de transfección
varian con cada tipo
celular.
 Solo puede ser usada para
transfección transitoria.

28. Métodos Físicos
 Microinyección
 Biobalística
 Electroporación
 Transfección basada en laser

29. Microinyección
 Inyección directa de ácidos nucleicos en el
citoplasma o núcleos
 Este método demanda especialización y es
costoso.
 Laborioso (una célula a la vez).

30. Biobalística
 Emplea partículas de oro que se conjugan con
ácidos nucleicos.
 Estos conjugados son “disparados” a
recipientes celulares a alta velocidad
 Este método es directo y confiable pero causa
daño físico a las muestras

31. 1. Precipite el ADN en las partículas de oro
2. Cargue el ADN/oro en los tubos
3. Rote los tubos para cubrir de ADN/oro en la
superficie interna.
4. Corte los tubos en cartuchos
5. Cargue los cartuchos en la pistola de genes
6. Entregue el ADN a las células

32. 1. Las partículas de oro recubiertas de ADN (microacarreador) son esparcidas
sobre el área central de un disco de plástico fino (macroacarreador).
2. El disco cargado de ADN es colocado en un soporte dentro del equipo.
3. El sistema usa helio de alta presión, liberado por un disco de ruptura y vacío
parcial para propulsar el macroacarreador cargado con el microacarreador
hacia las células .
4. El macroacarreador es detenido a corta distancia por una pantalla de
detención.
5. Las partículas de oro recubiertas de ADN continuan viajando hacia el
objetivo para penetrar las células.
6. La cámara de muestra esta sujeta a vacio parcial.

33. Electroporación
 Un pulso eléctrico corto causa una disrupción
en la membrana celular y abre poros en la
membrana, a través de los cuales los ácidos
nucleicos pueden pasar.
 Es capaz de transfectar una gran cantidad de
células en un periodo corto de tiempo, una
vez que las condiciones optimas de
electroporación son alcanzadas

34. 1. La electroporación expone a la
célula a un campo eléctrico de alta
intensidad que desestabiliza
temporalmente a la membrana
2. Durante este tiempo la membrana
es altamente permeable a
moléculas exógenas presentes en
el medio
3. El ADN se mueve hacia la célula a
través de estos poros.
4. Cuando el campo eléctrico es
apagado, los poros de la
membrana se resellan, encerrando
al ADN dentro de la célula

35. Ventajas Desventajas
 No altera la estructura
biológica o de función de
las células.
 Fácil de realizar.
 Alta Eficiencia.
 Puede ser aplicado a un
amplio número de tipos
celulares
 Mortalidad Celular

36. Factores que afectan la transfección
 En la célula huésped: salud de la célula,
cultivo celular
 Del material genético: Calidad y cantidad del
ADN

37. Salud Celular
 Las células deben de crecer en medio
adecuado con todos los factores necesarios
 Los cultivos deben estar libres de
contaminación
 Medio fresco debe ser utilizado si este
contiene componentes químicos inestables
como timina
 Las células deben ser incubadas a 37°C con un
porcentaje de CO2 de 5 a 10% y un 100% de
humedad relativa

38. Cultivo Celular
 Muy pocas células causan que el cultivo
celular crezca pobremente sin contacto el
contacto de célula a célula.
 Por el contrario, muchas células resultan en
inhibición por contacto, haciendo a las células
resistentes al consumo de ADN y otras
macromoléculas.
 Es decir, las células deben ser transfectadas a
un 40 a 80% de confluencia.

39. Cultivo Celular
Las células en división asimilan el ADN mejor.
(El rompimiento y perforación de la membrana
nuclear durante la mitosis habilita la entrega
nuclear)

40. Cultivo Celular
 El número de pasajes debe de ser bajo (<50)
 Las características de las células pueden
cambiar con el tiempo con líneas celulares
inmortalizadas y las células pueden no
responder a las mismas condiciones de
transfección.

41. Calidad y Cantidad del ADN
 Usar plásmidos de ADN de alta calidad que
estén libres de proteína, ARN y químicos para las
transfecciones. (La remoción de endotoxinas
debe ser parte del procedimiento de
preparación).
 Por lo general el ADN es suspendido en agua
estéril o bufferTE a una concentración final de
0.2-1 mg/mL
 La cantidad óptima de ADN puede variar
dependiendo del tipo de ADN, método/reactivo
de transfección, línea celular y número de
células

42. Bibliografía
 www.biorad.com/transfection
 Tae Kyung Kim, James H. Eberwine, Mammalian Cell
Transfection: the present and the future, Anal BioanalChem
(2010) 397:3173–3178, DOI 10.1007/s00216-010-3821-6
 Sophie Mehier-Humbert, Richard H. Guy, Physical
methods for gene transfer: Improving the kinetics of gene
delivery into cells, Advanced Drug Delivery Reviews 57
(2005) 733– 753
 JianYang, Ming Hong Shen, Polyetylene Gycol-
Mediated Cell Fusion in Methods in Molecular Biology,
vol. 325: Nuclear Reprogramming: Methods and
Protocols Edited by: S. Pells © Humana Press Inc.,
Totowa, NJ