2. INTRODUCCION
• EL daño de los radicales libres y las especies reactivas del oxigeno se ha
relacionado con algunos trastornos neurodegenerativos y canceres y la
oxidación de lipoproteínas de baja densidad es un factor importante en la
promoción de la enfermedad cardiaca coronaria (CHD) y la
arterosclerosis.
• Las dietas ricas en frutas y verduras y bajas en colesterol y grasas están
inversamente correlacionadas con las incidencias de cardiopatías
coronaria y cancer. Los antioxidantes naturales de frutas y verduras
proporcionan una medida de protección que retarda el proceso de daño
oxidativo.
• La actividad antioxidante de los extractos acuosos de plantas no ha
sido ampliamente estudiada, debido a la presencia de azúcares y
vitaminas antioxidantes solubles en agua que pueden enmascarar la
actividad de los polifenoles. La polaridad y la complejidad de los extractos
de agua pueden dificultar el aislamiento de componentes puros. Sin
embargo, los extractos acuosos de frutas a menudo contienen potentes
antioxidantes polifenólicos, como antocianinas y taninos. El estudio
actual se centra en los pigmentos de antocianina polar que están
presentes en las fracciones de agua después de dividir los extractos
metanólicos con hexano y acetato de etilo (EtOAc).
3. Materiales y
métodos
• FRUTAS
Variedades de frutas fueron recolectados en el Fruit and Spice Park en Homestead,
Florida y Mammea americanaL (Mamey Americana);. se recolectó en The Kampong
en Coconut Grove, Fl
gaultheria y Sambucus , fueron recolectados en el oeste de los Estados Unido.
Theobroma grandiflorum Schum. fue recolectado en la Guayana Francesa.
Las frutas se congelaron inmediatamente después de la recolección y se enviaron al
laboratorio donde se mantuvieron en frío (-20-C) almacenamiento oscuro hasta su
procesamiento. Se prepararon especímenes de prueba y se depositaron en el
herbario del Jardín Botánico de Nueva York.
• QUIMICOS Y SUMINSTROS
La resina Diaion HP-20SS se adquirió de Supelco (PA, EE. UU.) y la
1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) de Sigma (MO, EE. UU.).
Sephadex LH-20 (25–100metrom) fue fabricado por Pharmacia Fine Chemicals (NJ,
EE. UU.) ,
fase reversa C18gel de sílice (40metrom) por JT Baker (NJ, EE. UU.), y RP18F254
cromatógrafo de capa fina
Las placas de fotografía (TLC) (espesor de capa de 1 mm) fueron fabricadas por EM
Science (Alemania).
4. Preparación
de la muestra
• Los frutos fueron despepitados y
homogeneizados en una licuadora con metanol
(MeOH) y extraídos exhaustivamente.
• Los extractos se concentraron al vacío a
temperaturas no superiores a 40-C y
resuspendido en H2O.
• La solución acuosa resultante luego se repartió
secuencialmente con hexano y EtOAc antes de
separarse sobre Diaion HP-20SS (Figura 1).
5. Cromatografía
de interacción
hidrofóbica
• La resina Diaion HP-20SS (4 g) se empaquetó
en cartuchos de 12 ml y se acondicionó
secuencialmente con MeOH (50 ml, 15 min) y
H2O (50 ml, 10 min).
• Las fracciones acuosas semipurificadas de
cada especie (200 mg) se resuspendieron en
H2O (4 ml) y se aplicó a la columna HP-20SS y
se dejó adsorber sobre la resina durante 20
min. La columna se disolvió con 15 ml de H2O
(2,7 volúmenes de columna) a razón de 15
ml/h; luego secuencialmente con 9 ml cada
uno de H2O:MeOH (1:1) MeOH; MeOH:
acetona (1:1) y acetona.
6. Ensayo de
eliminación de
radicales libres
DPPH
• Las fracciones de H2O:MeOH se ensayaron para determinar la actividad
eliminadora de radicales libres mediante el ensayo DPPH. Las fracciones de
H2O:MeOH se resuspendieron en MeOH. DPPH etanólico (400uM) en la mezcla
de reacción. Se combinaron diluciones en serie de la muestra de prueba con la
solución de DPPH en una placa de microtitulación de 96 pocillos. Se usó MeOH
como control negativo y ácido ascórbico α tocoferol se utilizaron como
controles positivos.
• Las mezclas de reacción se incubaron durante 30 min a 37°C y el cambio de
absorbancia se midió a 517 nm.
• Los valores medios se obtuvieron a partir de experimentos por triplicado. El
porcentaje de inhibición se calculó usando la ecuación,
% inhibición =C[(C-S)/C] X 100
donde C es la absorbancia neta del control y S es la absorbancia neta
de la muestra.
El porcentaje de inhibición se graficó frente a la concentración, y la
ecuación de la línea se usó para obtener el IC50 valor.
• Un valor IC50 más bajo indica un mayor poder de actividad antioxidante.
7. Ensayo de
eliminación de
radicales libres
DPPH
• Las fracciones de H2O:MeOH se ensayaron para
determinar la actividad eliminadora de radicales
libres mediante el ensayo DPPH. Las fracciones de
H2O:MeOH se resuspendieron en MeOH. DPPH
etanólico (400uM) en la mezcla de reacción. Se
combinaron diluciones en serie de la muestra de
prueba con la solución de DPPH en una placa de
microtitulación de 96 pocillos. Se usó MeOH como
control negativo y ácido ascórbico α tocoferol se
utilizaron como controles positivos.
• Las mezclas de reacción se incubaron durante 30 min
a 37°C y el cambio de absorbancia se midió a 517 nm.
• Los valores medios se obtuvieron a partir de
experimentos por triplicado. El porcentaje de
inhibición se calculó usando la ecuación,
% inhibición =C[(C-S)/C] X 100
donde C es la absorbancia neta del control
y S es la absorbancia neta de la muestra.
El porcentaje de inhibición se graficó frente
a la concentración, y la ecuación de la línea se
usó para obtener el IC50 valor.
• Un valor IC50 más bajo indica un mayor poder de
actividad antioxidante.
8.
9. Eliminación
de
azúcares y
ácido
ascórbico
• Muchas de las 12 frutas en este estudio tienen un alto
contenido de azúcar, con carbohidratos que representan, en
promedio, el 14% del peso de la fruta fresca (Mortón, 1987). En
el esquema de extracción y partición utilizado en este estudio (
Figura 1), los carbohidratos se reparten en las fracciones acuosas.
• Los azúcares y el ácido ascórbico pueden estar presentes en
estas fracciones acuosas semipurificadas y pueden enmascarar la
actividad antioxidante de los polifenoles que pueden estar
presentes en la fracción. Por esta razón, se eliminó la vitamina C
y los carbohidratos de estas fracciones acuosas semipurificadas,
utilizando la resina Diaion HP-20SS. Los azúcares y la vitamina C
se eluyen en el H2La fracción O de la columna Diaion HP-20SS y
los polifenoles se eluyen en el H2 Fracciones O:MeOH y MeOH.
• El rendimiento del Diaion HP-20SS H2 o fracción deG. chalónfue el
más bajo, con solo el 24 % de las fracciones acuosas
semipurificadas eluidas en el Diaion HP-20SS H2O fracción. Diaion
HP-20SS es un método simple y efectivo para separar azúcares y
vitamina C de los constituyentes polifenólicos de fracciones acuosas
de extractos de frutas.
10. Ensayo de
eliminación
de radicales
DPPH
• El color del extracto acuoso puede ser útil para identificar frutas
con alta actividad antioxidante debido a las antocianinas, pero hay
ejemplos de extractos activos que no son de color rojo púrpura.
Las antocianinas son los pigmentos de frutas de color rojo púrpura
más comunes y se han estudiado ampliamente por su contenido
de antocianinas antioxidantes. Las frutas que no son de color rojo
púrpura pueden contener otros potentes antioxidantes
polifenólicos.
• Las actividades de estos extractos son comparables con el ácido
ascórbico (tabla 1) y resultados de antocianinas previamente
publicados (Wang et al., 1997). El tiempo de retención de HPLC y
los perfiles de absorbancia UV-Vis confirmaron la presencia de
cianidina-3-glucósido enM. cauliflora y C. cainito (Fig. 3). SoloE.
uniflora contenía delphinidin-3-glucósido. Se continuará con el
trabajo de aislamiento para determinar qué antocianinas
contribuyen a la actividad antioxidante de los frutos. Los
componentes antioxidantes deM americana, que no parecen ser
antocianinas, actualmente están siendo aisladas e identificadas
por nuestro laboratorio
11. tabla 1
Resultados
DPPH de
H2Fracciones
de O:MeOH
Table 1
DPPH results of H2O:MeOH fractions Columna1 Columna2 Columna3
Latin binomial Common name Family IC50
(mg/ml ±SD)
Blighia sapida Akee
Sapindaceae 6.6
±1.1
Chrysophyllum cainito Star-apple Sapotaceae 7.9
±0.3
Eugenia uniflora Surinam cherry Myrtaceae 4.0
±2.2
Gaultheria shallon Salal Ericaceae 5.9
±0.3
Malpighia glabra Barbados cherry Malpighiaceae 13.9
±1.3
Mammea americana Mammee apple Clusiaceae 7.9
±2.7
Mangifera indica Mango Anacardiaceae 145
±20
Manilkara zapota Sapodilla Sapotaceae 50.8
±4.5
Muntingia calabura Jamaica cherry Elaeocarpaceae 6.5
±0.6
Myrciaria cauliflora Jaboticaba Myrtaceae 6.2
±0.7
Sambucus caerulea Blue elder Caprifoliaceae 16.9
±0.6
Theobroma grandiflorum Cupuac¸ u Sterculiaceae 177.0
±12
Fig. 2. Cyanidin-3-O-b-glucopyranoside (A) and
delphinidin-3-O-b-glucopyranoside (B).
12.
13.
14.
15.
16. Conclusión
• La resina Diaion HP-20SS proporciona un método eficaz para eliminar azúcares y ácido
ascórbico de los antioxidantes polifenólicos en extractos a sirve como un primer paso en
la purificación de los polifenoles.
• El procedimiento ha dado como resultado la identificación de la antocianina, cianidina-3-
glucósido, de las fracciones acuosas semipurificadas de cereza de Surinam, caimito y
jaboticaba y delfinidina-3-glucósido, de cereza de Surinam.
• Los planes futuros incluyen la identificación de los constituyentes antioxidantes
restantes en las fracciones acuosas semipurificadas y el estudio de los efectos
anticancerígenos de estos extractos acuosos y componentes purificados in vitro,
mediante el análisis de la proliferación celular y el ciclo celular, así como ensayos de
receptores bioquímicos. cuosos de plantas y
