Este documento presenta información sobre química biológica y cinética enzimática. Brevemente describe que el cuerpo humano consume aproximadamente 420 kJ de energía por hora a través de eventos electroquímicos en la mitocondria que generan un voltaje de 0.2V y una corriente de 500 amperios. Luego presenta conceptos clave como metabolismo, catabolismo, anabolismo y la historia del descubrimiento de las enzimas y sus características. Finalmente, explica conceptos de cinética enzimática
4. El cuerpo humano en descanso consume, aproximadamente,
420 kJ de energía por hora, un requerimiento que es
ligeramente mayor que el de una bombita de 100W.
Los requerimientos energéticos del cuerpo humano, se
obtienen de los eventos electroquímicos en la mitocondria,
que aporta un modesto voltaje de, aproximadamente, 0.2V
(en la casa es de 220V) pero una corriente de 500Amp,
representando el movimiento transmembrana de,
aproximadamente, 3 x 1021 protones por segundo.
Este es el movimiento que energiza la síntesis de ATP.
4
5.
6. METABOLISMO:
Proceso global por el cual los organismo
vivientes adquieren y usan la energía libre
para llevar a cabo sus funciones.
CATABOLISMO
ANABOLISMO
6
11. Un poco de historia…
Se reconocen catalizadores biológicos al
estudiar la degradación de carnes por
secreciones estomacales
Se observa conversión de almidón a azúcar
por saliva y extractos vegetales
La fermentación de azúcar a
alcohol por levaduras es catalizada
por fermentos que son
inseparables de las células vivas
de levadura
1700s
1800s
1850s
11
12. Un poco de historia…
Buchner: extractos de levaduras pueden
fermentar azúcar a alcohol
Sumner: aísla y cristaliza ureasa todas
las enzimas son proteínas
Pepsina, tripsina y otras enzimas digestivas
se aíslan y cristalizan y son proteínas
1897
1926
1930s
ENZIMAS (Gk enzymos = levado)
Kühne
1930s Haldane: interacciones débiles entre
enzima y sustrato podrían usarse para
catalizar reacción
12
14. ¿ Qué sabemos hoy de las enzimas ?
Exceptuando las ribozimas, son todas proteínas
Actividad catalítica requiere proteína nativa
Tamaño muy variable: PM entre 104 - 106
Algunas requieren componente químico adicional
para su actividad
COFACTOR o COENZIMA
14
20. ¿ Qué son las vitaminas
?
Compuestos que son esenciales para la salud y
que no pueden ser sintetizados por el
organismo
Deben ser incorporados en la
dieta
Su deficiencia genera enfermedades por
carencia
Se dividen en dos grupos de acuerdo con su
28. Un ejemplo…la hexoquinasa
ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-fosfat
E.C.2.7.1.1.
transferasa
fosfotransferasa
P-transferasa con HO como aceptor
D-glucosa como aceptor del P
29. Las enzimas son catalizadores
extraordinarios
Especificidad
Magnitud de la aceleración de la velocidad de reacción
Condiciones de funcionamiento
29
34. La enzima estabiliza el Estado de
Transición
S
P
ES
EST
EP
ST
Dirección de Reacción
Energía libre (G)
Energía
de
activación
(no
catálisis)
Energía
de
activación
(catálisis)
Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell
37. El sitio activo…
Proporciona una superficie catalítica
Estabiliza estado de transición
Transforma el estado de transición en producto
B
B
A Superficie catalítica
A
Juang RH (2004) BCbasics
37
38. ¿ Cómo estabiliza el sitio activo el estado de
transición ?
Evita influencia del agua
Posee grupos reactivos
+
-
Juang RH (2004) BCbasics
Optimiza interacción con S
38
39. La enzima no es perfectamente complementaria al
sustrato sino al estado de transición
(Linus Pauling, 1946)
Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.252
X
Ajuste inducido
(Koshland, 1958)
39
43. El sitio activo…
Proporciona una superficie catalítica
Estabiliza estado de transición
Transforma el estado de transición en producto
B
B
A Superficie catalítica
A
Juang RH (2004) BCbasics
43
47. Victor Henri: reacción E + S →
ES etapa necesaria en catálisis
enzimática
Michaelis y Menten: Teoría General de la
Catálisis Enzimática
1903
1913
Cinética enzimática: los
protagonistas…
48. Las condiciones de M-M
rápida lenta*
ESTADO ESTACIONARIO: producción y
consumo del complejo ES proceden a la misma
velocidad se mantiene constante la
concentración de ES
E + S ES
k1
k2
E + P
k3
k4
48
49. S P
E
ES
Tiempo de reacción
Concentración
Juang RH (2004) BCbasics
ET
EE 49
54. ATP + D-glucosa ADP + D-glucosa-6-P
¿Se acuerdan de la hexoquinasa?
Especifidad
55. Y siguiendo con la hexoquinasa…
¡un ejemplo de especificidad INCREIBLE!
Glucosa Alosa Manosa
8 8.000 5 mM
CHO
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
CHO
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
CHO
HO-C-H
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
H2-C-OH
Juang RH (2004) BCbasics
Km
66. Recopilando…
Vmax
Km S
vo
1/S
1
vo
Doble recíproca
Gráfico Directo
1) Usar una cantidad definida de Enzima → E
2) Agregar sustrato en varias concentraciones → S
3) Determinar Producto a Tiempo Fijo (P/t)→ vo
4) Estimar Vmax y Km
1
Vmax
- 1
Km
1/2
Juang
RH
(2004)
BCbasics
66
67. 67
ISOENZIMAS
Las isoenzimas o isozimas son enzimas que difieren en la secuencia
de aminoácidos, pero que catalizan la misma reacción química. Son
variantes o isoformas de las enzimas.
Estas enzimas suelen mostrar diferentes parámetros cinéticos
(i.e. diferentes valores de KM), o propiedades de regulación
diferentes.
La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo
para satisfacer las necesidades particulares de un determinado
tejido o etapa del desarrollo.
68. Isoenzimas
Volvemos a la hexoquinasa…
¡La hexoquinasa humana tiene 4
isoenzimas!
Tejido cerebro
múscul
eritrocit
músculo,
eritrocito
eritrocit Hígado,
páncreas
Isoenzi
ma
I II III IV
(glucoquina
Km para
glucosa
0,061
mM
0, 34 0,038
mM
7,6 mM
Km para
ATP
1,2 mM 1,0 mM 3,05 0,2 mM
69. Isoenzimas
Y ya que estamos con la hexoquinasa…
¡La hexoquinasa humana tiene 4
isoenzimas!
Tejido cerebro
múscul
eritrocit
músculo,
eritrocito
eritrocit Hígado,
páncreas
Isoenzi
ma
I II III IV
(glucoKas
Km para
glucosa
0,061
mM
0, 34 0,038
mM
7,6 mM
Km para
ATP
1,2 mM 1,0 mM 3,05 0,2 mM
(Glu) reposo = 5 mM (Glu) posprandial ≥ 10 mM
77. ¿¿Cómo medimos la cantidad de
enzima?
UNIDAD ENZIMÁTICA: katal (IUPAC)
77
78. UNIDAD ENZIMÁTICA (UE)
Cantidad de enzima que cataliza formación de
determinada cantidad de producto en la unidad de
tiempo, en condiciones de velocidad máxima (condiciones
óptimas de reacción)
UE
Proteína (mg)
Actividad
Específica =
78
84. Inhibición de la actividad
enzimática
Inhibidores
irreversibles
Inhibidores
reversibles
NOTA: ACE = enzima convertidora de
angiotensina (ECA) pero también AS (cartas)
85. Algunos inhibidores son irreversibles…
Se unen covalentemente (o no) o
destruyen grupo funcional clave para
catálisis
Inhibidores suicidas
Diseño racional de fármacos
85
86. Un ejemplo real…la Enfermedad del Sueño
Trypanosoma brucei
Inhibidor suicida de la Ornitín decarboxilasa
primera enzima en biosíntesis poliaminas
Difluorometilornitina
86
90. Existen distintos tipos de inhibición reversible…
I
I
S
S
S I
I
I I
I
S
Competitiva No-competitiva Incompetitiva
E
E
Sitio diferente
Compite por
Sitio activo
Inhibidor
Sustrato
Dibujo
Guía
Ecuación
y
Descripción
[I] se une a [E] libre solo,
y compite con [S];
aumento de [S] elimina
la Inhibición por [I].
[I] se une a [E] libre o [ES]
complejo; aumento de [S] no
elimina [I] inhibición.
[I] se une al [ES] complejo
Solo; aumento [S] favorece
la inhibición por [I].
E + S→ES→E + P
+
I
↓
EI
←
↑
E + S→ES→E + P
+ +
I I
↓ ↓
EI+S→EIS
←
↑ ↑
E + S→ES→E + P
+
I
↓
EIS
←
↑
E
I
S
Juang RH (2004) BCbasics
90
94. Km
Inhibición Reversible
I I
I Competitiva No-competitiva Incompetitiva
Gráfico
Directo
Doble
Recíproca
Vmax Vmax
Km Km’ [S], mM
vo
[S], mM
vo
I I
Vmax’
Vmax no cambia
Km aumenta
Vmax disminuye
Km no cambia Vmax & Km disminuyen
I
1/[S]
1/Km
1/vo
1/Vmax
I
I
1/vo
1/Vmax
1/[S]
1/Km 1/[S]
1/Km
1/Vmax
1/vo
= Km’
Juang RH (2004) BCbasics
94
95. Una aplicación clínica y curiosa de la
inhibición competitiva…
¡ Emborrachar a los individuos intoxicados con metanol !
metanol Formaldehído
Alcohol
deshidrogenasa
etanol es inhibidor competitivo
Infusión lenta y continuada de etanol ☺
95
97. Otra aplicación clínica importante de la inhibición
competitva: las sulfamidas
-COOH
H2N-
-SONH2
H2N-
Precursor
Acido
fólico
Sulfanilamida
Acido p-aminobenzoico (PABA)
Bacterias necesitan
PABA para
biosíntesis de ácido
fólico
Estructura similar al PABA,
inhibe el crecimiento bacteriano.
Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197
97
103. Inhibidores Irreversibles
1) Se unen irreversiblemente a o
destruyen un grupo funcional clave
para catálisis
Aspirina
Ciclooxigenasa
Serina
104. Cinética Michaeliana: Resumen
vo=
Vmax [S]
Km + [S]
Km
Vmax &
1er orden
Orden cero
Competitiva
No-competitiva
Incompetitiva
Directo
Doble recíproca
Afinidad con
substrato
Velocidad
Máxima
Inhibición
k3 [Et]
kcat
Número de
recambio
kcat/Km
UE
1 mmol
min
Significa:
Juang RH (2004) BCbasics
104
105. 105
Pregunta:
En presencia de un inhibidor irreversible, disminuye la
Vm y se mantiene Km.
En presencia de un inhibidor reversible no competitivo
puro, disminuye la Vm y se mantiene Km.
¿Cómo diferenciarían, cinéticamente, uno del otro?
106. Grupos específicos en el sitio activo
contribuyen a la catálisis a través de
distintos mecanismos
Catálisis covalente
Catálisis con ión metálico
Catálisis ácido-base
106
116. Mecanismo Concertado de Catálisis
1
2
3 4
5
O-
H
+ H
COO-
(270)
Glu
(248)
Tyr
O-
H
His
(196)
His (69)
Glu
(72)
+Arg (145)
Carboxipeptidasa A
C-terminal
SITIO
ACTIVO
Chequear por
C-terminal
Sitio para
especificidad
Bolsillo
del Sitio
Activo
Cadena
peptidica del
Sustrato
R
N
C
N C
COO-
O-
C
2+
Zn
Juang
RH
(2004)
BCbasics
116
117. O O
N–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C
R H R’
Quimotripsina Tiene Un Sitio de Especificidad
O-
C
Ser
Sitio Activo
Sitio de
Especificidad Sitio Catalítico
Juang RH (2004) BCbasics
117
118. Especificidad de la Familia de Ser-Proteasas
COO-
C
Asp
Sitio Activo
Tripsina Quimotripsina Elastasa
corta en Lys, Arg corta en Trp, Phe, Tyr corta en Ala, Gly
Bolsillo No-polar
Bolsillo
Profundo
y
Cargado
Negativamente
Bolsillo Poco Profundo
y
no-polar
O O
–C–N–C–C–N–
C
C
C
C
NH3
+
O O
–C–N–C–C–N–
C
O O
–C–N–C–C–N–
CH3
Juang
RH
(2004)
BCbasics
118
119. Especificidad Espacial
B
C
D
B
C
D
B
C
D
Estos dos triángulos
no son idénticos
A
La estructura tetrahédrica
de los orbitales del carbono
tiene una tensión estérica
que conforma la unidad
base de la conformación
proteica
Juang RH (2004) BCbasics
sp3
Superficie Enzima
119
123. Enzimas Alostéricas
Proteínas multiméricas y complejas
Modulador y S se unen a distintas subunidades
Modulador puede ser positivo o negativo
Un sitio específico para cada modulador
Unión modulador produce cambio conformacional que altera
actividad enzimática
Modulador puede ser el mismo S
(homotrópico) o no (heterotrópico) 123
128. Dos modelos para explicar este
comportamiento…
Concertado
(Monod)
Ajuste inducido
(Koshland)
2 formas R y T en equilibrio que
se desplaza a un lado u otro
según presencia modulador
1 forma única que va ajustando su
actividad de acuerdo con entrada
modulador
S y modulador + sólo se unen a R
Modulador – sólo se une a T
128
130. El modelo concertado o de simetría (Monod) se basa en los
siguientes postulados:
1. Cada subunidad puede existir en dos conformaciones
diferentes, R y T. Estas designaciones, hoy consideradas
simplemente como etiquetas, originalmente indicaban
Relajada y Tensa, porque la proteína necesita relajarse para
unir al sustrato, rompiendo alguna de las interacciones que
mantienen su estructura nativa, a fin de establecer nuevas
con el sustrato.
2. Todas las subunidades de la molécula deben estar en la
misma conformación, en todo tiempo; por lo tanto, para una
proteína dimérica, los estados conformacionales R2 y T2 son
los únicos permitidos, la conformación mixta RT está
prohibida. Esta condición es mucho más restrictiva para más
de dos subunidades. Por ejemplo, para n = 4, los estados
permitidos son R4 y T4, estando prohibidos R3T, R2T2 y RT3.
3. Los dos estados de la proteína están en equilibrio, con una
constante de equilibrio L = [T2]/[R2].
4. Un ligando puede unirse a una subunidad en cualquiera de
las conformaciones, pero las constantes de disociación
intrínsecas son diferentes:
KR =[R][A]/[RA] para cada subunidad R,
KT = [T][A]/[TA] para cada subunidad T.
130
132. En cada ecuación, el factor “estadístico” 2, ½ o 1 resulta de
la definición de las constantes de disociación intrínsecas KR
y KT, en términos de los sitios individuales aunque las
expresiones se escriben para las moléculas completas.
Por ejemplo,
KR = [R][A]/[RA] = 2[R2][A]/[R2A],
porque hay dos sitios vacíos en cada molécula R2 y uno
ocupado en cada molécula R2A.
La ocupación fraccional y se define como la fracción de
sitios ocupados por ligando y toma la forma siguiente:
En el numerador, se contabiliza la concentración de cada
molécula de acuerdo con el número de sitios ocupados que posee
(por lo tanto, no se consideran las moléculas vacías), pero en el
denominador cada molécula se considera de acuerdo con
cuántos sitios contiene, estén ocupados o no, por lo que cada
concentración se multiplica por el mismo factor 2.
Sustituyendo, resulta:
132
134. Generalizando la ecuación para n subunidades:
Podemos ver que, si n = 1, esta ecuación se convierte en la clásica no cooperativa de Michaelis y Menten.
134
135. En la forma más restrictiva del modelo de Monod (concertado), el sustrato
solamente puede unirse a la forma R (Relajada o activa), por lo tanto puede decirse
que la KT es infinita (constante de disociación para la forma Tensa o inactiva).
Luego:
Esto da como resultado una curva de
saturación sigmoidea, indicativa de
cooperatividad positiva.
135
136. Como no todos los comportamientos cooperativos podían ser explicados por el
modelo concertado (Monod), aparece el modelo secuencial de ajuste inducido
(Koshland), donde cada subunidad puede estar en forma R o T:
136
137. En este caso, considerando que la afinidad intrínseca para cada sitio varía en función
de la ocupación y la proximidad a la subunidad ocupada, la ecuación de ocupación
resulta (para una enzima dimérica):
137
145. Efecto
Curva
Sigmoidea
Si exageramos
la curva
sigmoidea
Vemos el punto
On/Off
claramente
Efector positivo (ATP)
lleva curva sigmoidea
a hiperbólica
Efector Negativo
(CTP) mantiene
Una enzima alostérica
puede “detectar” la
concentración en el
ambiente y ajustar su
actividad
CTP
ATP
vo
vo
[Sustrato]
Off On
Juang RH (2004) BCbasics
145
146.
147. Enzimas reguladas por
clivaje proteolítico
Regulación irreversible
Proteólisis expone sitio activo
Se necesita otro mecanismo para inactivar
Inhibidor que se une fuertemente a sitio activo
147
