biomol

1. * Interacción DNA-DNA (hibridación por complementariedad de cadena)
* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Detectar la presencia de un gen, etc.
Gel Agarosa Southern BLOT
Todos los
DNA
DNA
de interés
Resultado
1. Electroforesis en gel de agarosa
moléculas
de DNA
SOUTHERN BLOT
2. Transferencia a membrana
moléculas
de DNA
3. Hibridación con la sonda radioactiva
DNA
interés
…ATTGCA…
…TAACGT…
Sonda
de DNA 32P
4. Revelado
DNA
interés
32P

2. * Interacción RNA-DNA (hibridación)
* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA concreta mediante el uso de
sondas de DNA específicas (muy sensible)
* Expresión génica
NORTHERN BLOT
2. Transferencia a membrana
moléculas
de RNA
Gel Agarosa Northern BLOT
Todos los
RNA
RNA
de interés
Resultado
1. Electroforesis en gel de agarosa
moléculas
de RNA
3. Hibridación con la sonda radioactiva
RNA
interés
…AUUGCA…
…TAACGT…
Sonda
de DNA 32P
4. Revelado
RNA
interés
32P

3. PCR
Fundamentos, variantes y aplicaciones

4. REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
1985 - Mullis & Falloona
Amplificación enzimática de un fragmento de DNA
(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”)

5. Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades
• La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección 5’
3’
• Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una
cadena nueva utilizando una hebra molde
• Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan
un iniciador (primer o cebador de extensión)
• La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA-
dependiente.

6. Cadena líder
(Leading Strand)
Primer (riboNTPs)
Fragmento de Okasaki
Cadena rezagada (Lagging
Strand)
Basta un primer
LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´ 3´.

7. Eventos en la Replicación del DNA:
• Apertura de las cadenas (orígen de replicación)
• Colocación de los iniciadores (primers de RNA)
( La cadena líder utilizará un solo iniciador mientras que las
cadenas rezagadas utilizarán varios iniciadores de RNA.)
• Síntesis de cadenas de DNA (partiendo de los iniciadores)
• Eliminación de los iniciadores de RNA.
• Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA
ligasa)

8. ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN
LA SINTESIS DEL DNA POR PCR
 Hebra Templado
 Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de
nucleótidos complementaria a la hebra templado.
La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesis
de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
 dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
 DNA Polimerasa

9. PCR
Melting
94 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
5’
3’
3’
5’
DNA de cadena
doble

10. PCR
Melting
94 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
3’
5’
5’
3’
Calor
DNA de
cadena simple

11. PCR
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
3’
5’
5’
3’
5’
5’
Melting
94 oC
Hibridación
de primers

12. PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
30 ciclos
3’
5’
5’
3’
Calor
Calor
5’
5’
5’

13. PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’

14. PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Calor
Calor

15. PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’

16. Fragmentos de tamaño
definido
PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Temperatura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’

17. El numero de copias del DNA delimitado por los primers se
duplica en cada ciclo de PCR.
0
# ciclos
Numero de copias
1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64

18. VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS
 ALTA SENSIBILIDAD
 ALTA ESPECIFICIDAD
 RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o
productos amplificados previamente)

19. TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR
 RT-PCR : detección de mRNA
 PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
 PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea
 In situ PCR : detección en tejido mismo, ubicación del fragmento
 IC-PCR : inmunocaptura previa a PCR
 PCR-RFLP : polimorfismo genético (usado más que RAPDs)
 Real Time PCR : cuantificación de copias iniciales – en tiempo real

20. PCR Multiplex
- Varias secuencias target en forma simultánea.
- La eficiencia de amplificación de ambos targets no es
necesariamente la misma:
- Secuencia de DNA de los diferentes targets
(%GC)
- Temperatura de hibridación de los diferentes
primers
- Tamaño de las diferentes secuencias target
- Artefactos / dímeros entre diferentes primers.

21. mRNA
cDNA (simple cadena)
cDNA (doble cadena)
PCR
RT-PCR
Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
• PCR
OBJETIVO:
Detección de la expresión de un gen – por
presencia de mRNA

22. Transcripción Reversa
1. Purificación de RNA mensajero
2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)

25. RAPD of P. aeruginosa

26. APLICACIONES DE PCR EN MEDICINA
• Detección de cantidades mínimas (diagnóstico temprano en
pacientes asintomáticos)
• Monitoreo de terapia (por ej. disminución de carga viral)
• Evaluación de terapia - pronostico de recaída
• Detección de cepas resistentes a antibióticos
• Detección temprana de Citomegalovirus y otros patógenos en
pacientes con transplante de órganos (por inmunosupresión
y mayor riesgo a infecciones latentes)

27. MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER
SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR
•Sangre - Bacterias
•Mucosa - Hongos
•Tejido - Parásitos
•Orina - Virus
•Heces - Mutaciones en Genes
•Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de
genes

28. USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR
EN LA SOCIEDAD
• Medicina : Diagóstico Molecular:
Enfermedades geneticas
Enfermedades infecciosas
• Identificación genética y filiación (Pruebas de paternidad,
medicina forense, pedigree de animales, etc...)
• Mejoramiento genético en animales y plantas
• Productos biomédicos
• Terapia génica

29. REAL TIME PCR
INTRODUCCION
- PCR (estandar)
- RT-PCR
- PCR Cuantitativo (end point analysis)
- PCR en tiempo real (análisis de la cinética de reacción)
- ventajas
- desventajas
- aplicaciones

30. Cuantificación de copias de mRNA
1. Diferencias en la expresión de genes (por efecto de drogas por
ejemplo)
2. La poca cantidad de mRNA disponible en ciertos procedimientos:
•células obtenidas por LCM (laser capture microdissection)
•cantidades pequeñas de tejidos
•células primarias