En este trabajo diseñamos y validamos un ensayo de PCR en Tiempo Real dirigido al gen lipL32/hap1 para el diagnóstico de Leptospirosis y Empleamosr la qPCR como herramienta para llegar directamente al cultivo microbiológico de Leptospiras patógenas.

1. www.aleidavillaespinosa.com

2. Esta enfermedad es
transmitida por la orina
y fomites de animales
salvajes y domésticos,
en especial ratas, perros
y otros 160 mamíferos.
Las variaciones en los
ecosistemas por el
clima, las migraciones,
invasión de selvas
vírgenes o las
actividades socio-
culturales cambian las
interacciones entre los
seres vivos y modifican
las condiciones
medioambientales,
lo cual afecta a las
poblaciones de
reservorios y modifican
la transmisión de la
Leptospirosis.

3. La fuente de infección
para los humanos es el
contacto directo con
los animales
infectados o sus
orinas, o por contacto
indirecto a través del
agua o tierra
contaminada
La exposición humana a la Leptospirosis no
está limitada a la ocupación sino a la
contaminación medioambiental, en especial
durante la época de lluvias, cuando la
infección en los ROEDORES es llevada al
ambiente urbano.

4. División: Procariotas
Clase: Schizomicete
Orden: Spirochaetales
Familia. Leptospiraceae
L. Interrogans sensu lato *
L. Biflexa sensu lato **
• >250 serovares en 25 serogrupos
•** > 60 serovares en 38 serogrupos
El cultivo bacteriológico es la prueba
de referencia para demostrar la
presencia del microorganismo.
La microaglutinación (MAT) es el
método serológico más empleado y la
técnica de referencia en todos los
laboratorios especializados para los
estudios epidemiológicos o.
Inmunofluorescencia Aglutinación microscópicaTinción de plata Campo oscuro
TAXONOMIA POR RELACIONES ANTIGÉNICAS El cultivo bacteriológico es la
prueba de referencia para
demostrar la presencia del
microorganismo.
El serovar es el taxón básico

5. Nefritis interticial Nefrosis hemoglobinúrica Colestasis biliar Necrosis hepáticaNefritis intesticialIctericia renal
Genes para diagnóstico molecular
Leptospiras sp: gyrB; rrs (16 S rRNA gene); secY
Leptospiras patógenas: lcY; lipL32/ hap 1; lihgA; ligB
LipL32 es la proteína más abundante en las cepas
patógenas.
LipL32 es una lipoproteína de la membrana externa
de asociada a la hemólisis, cuya secuencia y
expresión está altamente conservada entre las
especies patógenas de Leptospiras, tanto en cultivos,
como durante la infección de los hospedadores.
La LipL32, induce respuestas inflamatorias a través de la liberación de sustancias quimiotácticas que contribuyen al daño
tisular
TAXONOMIA POR RELACIONES GENÓMICAS
GENOMOSPECIES
L. PATÓGENAS L. NO PATÓGENAS
L. alstonii (Genomospecie 1) L. biflexa
L. alexanderi L. wolbachii
L. santarosai L. meyerii
L. borgpetersenii L. yanagawae (Genomospecie 5)
L. interrogans L. kemetyi
L. noguchii L. vanthielii (Genomospecie 4)
L. Kirschneri L. terpstrae (Genomospecie 3)
L. Wolffii
L INTERMEDIUS
L. inadai
L. fainei
L. broomii
Comité Internacional de Taxonomía de Leptospira 2007

6. Varios ensayos de PCR se han descrito para la identificación del
DNA de Leptospira, pero muy pocos se han evaluado en estudios
clínicos antes de emplearlos ampliamente en el diagnóstico.
www.aleidavillaespinosa.com

7. gen clonado pLep 242 bp

8. Leptospiras patógenas
ESPECIES SEROVARES
L. borgpetersenii Hardjo
L. interrogans Canicola
L. interrogans Pomona
L. Kirshneri Grippotyphosa
L. interrogans Icterohaemorrhagiae
L. interrogans Autumnalis
L. interrogans Bratislava
L. interrogans Hardjo bovis
L. borgpetersenii Castellonis
Leptospiras no
patógenas
ESPECIES SEROVARES
L. biflexa Patoc I (2)
L. wolbachi Codice
L. tepstrae Hualin
L. genomospecie 5 Sao Pablo
Leptospiras
INTERMEDIUS
L. inadai Lyme

9. Las muestras de los casos positivos en qPCR se cultivaron en los medios EMJH y Fletcher
suplementados con suero de conejo, Tween 80-albúmina y 5Flu. Se incubaron a 30º C (± 2)
y se estudiaron en microscopía de campo oscuro durante 12 semanas. La identificación se
hizo con MAT y sueros serovar específico de referencia.
Cultivo microbiológico

10. Los resultados confirman que lip32/hap1 gene es un factor de virulencia putativo
altamente conservado en especies patógenas de Leptospiras y no tiene genes
ortólogos en especies no patógenas y saprofitas que codifiquen para esta lipoproteína.
(CVs) intra-ensayo 9,8% - 31; (CVs) inter-ensayo 12,6% -24,5%
Leptospiras patógenas qPCR lip32/hap1

11. .- Leptospiras patógenas fueron diagnosticada en
las especies bovinos, porcinos y equinos.
.- Leptospiras patógenas fueron identificadas en
casos de abortos, inespecíficos y ambientales en
muestras de tejidos, exudados, leche, orina y agua.
Especies n casos Positivos % Positivos
Bovinos 429 8 1,86%
Porcinos 200 12 6,00%
Ovinos 169 0 0,00%
Caninos 27 0 0,00%
Caprinos 27 0 0,00%
Equinos 10 2 20,00%
Conejos 10 0 0,00%
TOTAL 872 22 2,52%
Proceso n casos Porcentaje Positivos % Positivos
Abortos 508 58,26% 16 3,15%
Infertilidad 156 17,89% 0 0,00%
Inespecífico 66 7,57% 3 4,55%
Ambiental 139 15,94% 3 2,16%
Respiratorio 3 0,34% 0 0,00%
Tipo muestra n casos Porcentaje Positivos % Positivos
Tejidos 438 50,23% 15 3,42%
Exudados 295 33,83% 4 1,36%
Sangre y Sueros 38 4,36% 0 0,00%
Leche 65 7,45% 1 1,54%
Orina 24 2,75% 1 4,17%
Agua 1 0,11% 1 100%
Semen 11 1,26% 0 0,00%

12. Con una qPCR comercial
Los cultivos se transformaron positivos a partir de 4-
5 días post inoculación.
Logramos obtener20 cepas de campo que amplifican
frente al gen lip32/hap1 con títulos > 109
Estos aislamientos se identificaron en 6 serovares de
Leptospiras patógenas mediante MAT .
La presencia del gen lip32/hap1 en los cultivos de
hospedadores susceptibles, verifica en forma objetiva la
virulencia de los aislamientos.
Portugal Hardjo y Pomona.
Ciudad Real Hardjo Canicola, Grippo
Ávila serjoe Hardjo
Córdoba Hardjo priaj
Badajoz Hardjo y Pomona
Lleida Icterohaemorrhagiae
Mallorca Porcinos Bratislava
Huelva Hardjo y Pomona
Salamanca Canicola e Icterohae
Sevilla Hardjo, Pomona, Bratislava
Cultivo de Leptospiras
Cepas de campo
Distribución de positivos

13. C
O
N
C
L
U
S
I
O
N
E
S
1.- Nuestra qPCR posibilitó el diagnóstico rápido,
sensible y específico de Leptospiras patógenas.
2.- La eficiencia del cultivo de Leptospiras aumenta
cuando se realiza con muestras positivas en la PCR en
tiempo real lipL32 /hap 1gene .
www.aleidavillaespinosa.com