Este documento presenta los resultados de un estudio sobre la resistencia fenotípica a cinco antimicrobianos de cepas de Brachyspira aisladas de cerdos en España, estudiadas mediante citometría de flujo. Se encontró resistencia a tilosina, clindamicina y lincomicina en algunas cepas, mientras que todas fueron sensibles a valnemulina. La citometría de flujo fue un método objetivo y reproducible para determinar la susceptibilidad antimicrobiana en Brachyspira.

1. Antibiotic susceptibility of porcineAntibiotic susceptibility of porcine
Brachyspiras isolated in Spain.Brachyspiras isolated in Spain.
Study by flow cytometryStudy by flow cytometry..
Aleida Villa Espinosa and Elena Gracia Curras.
EXOPOL. Autovacunas y Diagnóstico. Pol. Río Gállego, 50840 San Mateo de Gállego, Zaragoza.

2. IntroducciónIntroducción..
El control de la disentería y las infecciones por espiroquetasen los
cerdos, se ha visto comprometido por la aparición de cepas con
fenotipos resistentes a los antibióticos más utilizados.
Las nuevas cepas tienen ventajas biológicas que incluyen alteraciones
fenotípicas en virulencia y / o resistencia a las drogas.
Determinar los patrones de susceptibilidad antimicrobiana de los
aislados de campos nos permitirá:
a) Conocer las diferencias fenotípicas entre las parientes y las cepas
variantes.
b) Identificar tempranamente los clones resistentes y tomar las
medidas necesarias para evitar su diseminación.
c) Elegir la mejor opción terapéutica.
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3. Por ello es necesario monitorear los niveles de resistencia
antimicrobiana de las cepas circulantes y comparar y estandarizar
los métodos de laboratorio.
Las guías metodológicas para gérmenes anaerobios y las
recomendaciones para la interpretación de los test no incluyen
métodos estandarizados para el análisis antimicrobiano de las
espiroquetas intestinales de los cerdos.
No existen aislamientos estándar de las especies de Brachyspiras
aprobados para realizar estos test.
En nuestro conocimiento no existen trabajos anteriores que
utilizaran la citometria de flujo par el test de susceptibilidad
antimicrobiana en Brachyspiras spp. u otras bacterias anaerobias.
Tampoco existen trabajos publicados sobre la susceptibilidad
antimicrobiana de los aislados de campo de Brachyspira spp en
España.

4. ObjetivosObjetivos..
En este trabajo se muestran los resultados de la
resistencia fenotípica y la concentración mínima
inhibitoria de cinco antimicrobianos frente a
Brachyspira sp. aisladas en porcinos, estudiados
mediante citometría de flujo y pruebas de exclusión
con yoduro de propidio.
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5. Principio del métodoPrincipio del método
Los test de resistencia fenotípica cuantifican la capacidad de los
microorganismos de multiplicarse en presencia de varias
concentraciones de drogas específicas y ofrecen una medida
directa de la susceptibilidad antiomicrobiana.
La multiplicación exponencial es controlada en presencia de la
droga y para cada aislamiento se determina la concentración que
inhibe el crecimiento en un 50%. (IC50). Comparado con un
control sin la droga o una cepa de referencia.
La Citometría de Flujo mide el crecimiento bacteriano y los daños
directos e indirectos de la membrana celular inducidos por el
antibiótico.
Las células sanas excluyen el Ioduro de propidio (Pi) y no
muestran fluorescencia. El Pi puede ser excitado por el láser de
argón y es suficiente para detectar las células dañadas o muertas.

6. 214 Aislamientos de Brachyspira sp. Mayo 2001 - Mayo 2003 en 21 provincias españolas.
* 170 B. hyodysenteriae.
44 Otras especies * B.innocens. * B. intermedia. * B. murdochii. * B. pilosicoli.
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7. Panel de agentes antimicrobianos.Panel de agentes antimicrobianos.
Fumarato hidrogenado de Tiamulina no recubierta. Lab. Calier, S.A.
Valnemulin hyrocloride. Novartis Animals Health GMBH.
Fumarato de Tilosin. SIGMA T 6134
Lincomicin hydrocloride. Pfizer Salud Animal
Clindomicin hydrocloride. Pfizer Salud Animal

8. Se estudiaron 40 aislamientos de B. hyodysenteriae y 10 de otras especies.
2 cepas de colecciones de referencia: Control de Calidad.
B. hyodysenteriae P 234 (Cortesia de Dr. JR. Thomsom. Scottsh Agricultural College Veterinary Science
Division. Reino Unido.
B. pilosicoli. RW2. (Cortesia de Ing. J. Hommez. Lab. WZWO Torhout. Bélgica.
Microdiluciones en Caldo BHI. +10% SFB.Microdiluciones en Caldo BHI. +10% SFB.

9. Clindamicine: 0,0625; 0,125; 0,250; 0,5; 1; 2; 4; 8.
Lincomicin: 0,5; 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64.
Tiamulin: 0,031; 0,0625; 0,125; 0,250; 0,5; 1; 2; 4.
Tilosin: 2; 4; 8; 16; 32; 64;128; 256.
Valnemulin: 0,031; 0,0625; 0,125; 0,250; 0,5; 1; 2; 4.
ConcentracionesConcentraciones
finalesfinales µg / ml.µg / ml.
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10. El Tiempo de incubación seleccionado para la prueba de sensibilidad
antimicrobiana fue 48h. Crecimiento exponencial superior a 2 log de base 10.

11. Adquisición alta velocidad durante 1 minuto. Rango de flujo 120 ± 0,20 µl. Umbral 150. FSC /
SSC y fluorescencia 2 (Pi) en escala logarítmica.
Citómetro FACScan con láser Ión-Argón. Programas informáticos Cell Quest y Paint A Gate
Cuantificación del crecimiento bacteriano y la mortalidad enCuantificación del crecimiento bacteriano y la mortalidad en
citometría de flujocitometría de flujo

12. Inóculo inicial = tiempo 0. Valores promedio de 52 aislamientos de
Brachyspiras 8,9 x 105
± 1,24 x 106
Población final = Tiempo 48h. Crecimiento. sin antibióticos.
Promedio de 52 aislamientos de Brachyspiras 1,7x 108
± 1,5 x 109

13. Ejemplo de cepa resistente
Ejemplo de cepa sensible

14. Resistencia fenotípica 3/50
MIC 50 < 0,0625 µg/ml
MIC 90 = 1 µg/ml
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m

15. Resistencia fenotípica 1/50
MIC 50 < 0,5 µg/ml
MIC 90 = 16 µg/ml

16. Resistencia fenotípica 1/50
MIC 50 <0,031 µg/ml
MIC 90 = 0,031 µg/ml

17. Resistencia fenotípica 6/50
MIC 50 = 16 µg/ml
MIC 90 = 128 µg/ml
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18. Resistencia fenotípica 0/50
MIC 50 < 0,031 µg/ml
MIC 90 < 0,031 µg/ml

19. Tabla 1Tabla 1..
MIC 50, MIC90 y Resistencia fenotípica de Brachyspira sp. porcina mediante
Citometría de flujo. Correlación con las concentraciones de referencias en el colon
y/o sangre. Efectividad en el tratamiento clínico.
Citometría de flujo n= 50Agente
antimicrobiano
MIC50
μg ml-1
MIC90
μg ml-1
Resistencia
fenotípica
Concentraciones
reportados en
colon porcino4
μg ml-1
Efectividad en el
tratamiento clínico
Clindamicin < 0,0625 1 6% NR uso humano
Lincomicin < 0,5 16 2% 34,51 alta
Tiamulin < 0,031 0,125 2% 2,16 alta
Tilosin 16 128 12% 2* Baja- media
Valnemulin <0,031 < 0,031 0% 1,68 alta
www.aleidavillaespinosa.com * Máxima concentración en la sangre

20. Tabla 2Tabla 2..
Denominación Resistenciafenotípica Localizacióngeográfica
B.hyodysenteriae. 30106 Clindamycin-Lincomycin-Tilosin Navarra
B.hyodysenteriae30219 Clindamycin-Tilosin Salamanca
B.hyodysenteriae32972 Clindamycin–Tiamulin-Tilosin Girona
B.hyodysenteriae37499 Tilosin Teruel
B,murdochii33023 Tilosin Navarra
B.pilosicoli 34444 Tilosin Badajoz
B.pilosicoliRW2 Tilosin Bélgica
Relación epidemiológica de las cepas de Brachyspiras resistentes
encontradas en este estudio

21. Tabla 3Tabla 3..
MIC50 μg ml-1
Métodos
Clindamycin Lincomycin Tiamulin Tilosin Valnemulin
País, número de
aislamientos y
período de
obtención.
Diluciones en
caldo / CF
< 0,0625 < 0,05 < 0,031 16 < 0,031 España
(n =50) 2001 -2003
>4 NR 0,125 > 256 < 0,031 Suecia
(n = 46) 1997 –2000
Diluciones en
caldo /
turbidez* 16 64 1 > 256 0,5 Australia 15
(n = 76) 1986 - 2000
Diluciones en
agar / UFC**
NR 32 - 64 < 0,06 128 NR Bélgica 12
(n = 53) 1995 - 1996
Difusión en
discos***
NR 0,10 - 50 0,05 –
0,020
0,05 -
100
NR Hungria
22
(n = 332) 1978 – 1992
Homogeneidad de las MICs. Brachyspira spp. aisladas con varios métodos. en
diferentes países y períodos de tiempo.

22. ConclusionesConclusiones..
1) Hemos encontrado diferentes grados de resistencia fenotípica para
Tilosin, Clindamicin, Lincomicin y Tiamulin mientras todos los aislamientos
de Brachyspira estudiados fueron sensibles a Valnemulin.
2) Las MIC50 mostraron una buena correlación con las concentraciones de
referencia en el colón de los cerdos alimentados con piensos medicados en
dosis terapéuticas.
3) La Citometría de Flujo fue objetiva, altamente reproducible y fácilmente
adaptada para el género Brachyspira.
4) La Citometría de Flujo puede proponerse como una alternativa sensible a
las técnicas de rutina para estudiar la susceptibilidad a los agentes
antimicrobianos de Brachyspira sp.
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23. Por los antibióticos empleados en este estudio.
Dr. Carmen Llongueras. Departamento I + D Laboratorio Calier S.A.
Dr. Xavier Piqué. Customer service. Novartis Animal Health GMBH, España.
Dr. Paloma Suarez. Pfizer Salud Animal. Alcobendas Madrid, España.
Por las cepas de colecciones para el control de calidad.
Dr. JR Thomsom. Scottish Agricultural College Veterinary Science Division. Reino
Unido y Ing. J. Hommez. Lab. WZWO. Torhout. Bélgica.
AgradecimientosAgradecimientos..
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