Inmaculada Solís, responsable de Microbiología de Iproma Castellón nos explica el proceso de acreditación de una técnica alternativa al cultivo, para la detección y cuantificación de Legionella, la separación inmunomagnética. El único test certificado y validado para poder realizar esta detección y cuantificación de legionella en aguas es Legipid que está basado en la tecnología antígeno-anticuerpo y es capaz de detectar tanto células viables como las viables pero no cultivables, y a diferencia de la PCR no detecta células muertas.

1. ACREDITACIÓN DE MÉTODO SIM
(Separación Inmuno Magnética) EN
LABORATORIO: Caso Práctico.
Inma Solís
ACREDITACIÓN DE MÉTODO SIM
Magnética) EN
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017

2. Índice
Introducción
Histórico SIM - Legipid®
Legislación aplicable
Validación – AcreditaciónValidación – Acreditación
Trabajos realizados
Legipid®
Legislación aplicable
Acreditación
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017
Acreditación

3. 01 Introducción
25 años de experiencia25 años de experiencia
I+D+i
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4. 01 Introducción
NECESIDAD: satisfacción cliente
Rapidez: agilidad en la toma de decisiones
Fiabilidad: técnica sensible, buena recuperación, informe de validación
Bajo coste: reactivo + tiempo de ensayo + equipamiento + entrenamien
Acreditable: según ISO 17025 por ENACAcreditable: según ISO 17025 por ENAC
NECESIDAD: satisfacción cliente
Fiabilidad: técnica sensible, buena recuperación, informe de validación
Bajo coste: reactivo + tiempo de ensayo + equipamiento + entrenamiento
Acreditable: según ISO 17025 por ENAC
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017
Acreditable: según ISO 17025 por ENAC
Adecuado al fin previsto

5. 01 Introducción
NECESIDAD: fin previsto
Objetivo de la
técnica
Aislamiento de la
bacteria
Identificación de la
bacteria aislada
Target de la
determinación
Célula
cultivable
Ácidos nucleicos libres
o extraídos en células
viables y no viables
Estrategia de
Extraer y AMPLIFICAR
bacteria aislada
Detección rápida del
nivel en la muestra
ambiental
viables y no viables
Célula intacta libre
(potencialmente
infectiva)
Estrategia de
detección
Aislar y CRECER la
bacteria en cultivo
Extraer y AMPLIFICAR
una secuencia génica
Fin previsto
Cumplimiento
legislativo
Epidemiológico:
Confirmar la sospechauna secuencia génica
Concentrar y
CAPTURAR la célula
libre
Confirmar la sospecha
Preventivo: evitar el
nivel infectivo
(contención primaria)
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6. 02 Histórico SIM – Legipid ®
Año 2009 – Validación Kit
Año 2010 – Ejercicio Intercolaborativo
Año 2011 – Certificación AOAC
Año 2013 – RD piscinas (RD 742/2013)
Año 2015 – NT 32 ENAC
Año 2017 – UNE 10030:2017
Legipid ®
Validación Kit
Ejercicio Intercolaborativo
Certificación AOAC
RD piscinas (RD 742/2013)
NT 32 ENAC
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017
UNE 10030:2017

7. 02 Histórico SIM – Legipid ®
Evolución muestras Legionella
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Nºmuestrasanalizadas
0
1000
2000
Año 2010 Año 2011 Año 2012 Año 2013
L.pneu 704 840 236 385
L.sp 663 1556 1885 3083
Legipid ®
Evolución muestras Legionella
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Año 2013 Año 2014 Año 2015 Año 2016 Año 2017
754 776 861 2048
4619 5179 5352 4604

8. 02 Histórico SIM – Legipid ®
103 104
102 102
IMS: LEGIPID
Legipid ®
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9. 03 Legislación aplicable
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10. 03 Legislación aplicable
Cuantitativo
Recuperación
Reproducibilidad
Cualitativo
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Límite de detección

11. 03 Legislación aplicable
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12. 04 Validación – Acreditación
IMS – LEGIPID ®
Certificado AOAC nº 111101
Acreditación
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13. 04 Validación – Acreditación
IMS – LEGIPID ®
Certificado AOAC nº 111101
Validación inicial: 2 laboratorios ISO 17025
Sensibilidad
Especificidad
Falsos positivosFalsos positivos
Falsos negativos
Eficiencia
Acreditación
17025
95,3 %
88,4 %
11,6 %
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11,6 %
4,7 %
92,4 %

14. 04 Validación – Acreditación
IMS – LEGIPID ®
Certificado AOAC nº 111101
Validación inicial: 2 laboratorios ISO 17025
Estudio intercolaborativo 12 laboratorios
2 blancos
2 muestras valor
asignado 2,88 log
95,8 % concordancia100 % concordancia
Acreditación
ISO 17025
laboratorios
3 muestras valor
asignado 3,82 log
2 muestras valor
asignado 2,23 log
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017
91,7 % concordancia 91,7 % concordancia

15. 04 Validación – Acreditación
IMS – LEGIPID ®
Certificado AOAC nº 111101
Validación inicial: 2 laboratorios ISO 17025
Estudio intercolaborativo 12 laboratorios
Estudio inclusividad / exclusividad
64 cepas colección y
ambientales Legionellaambientales Legionella
NO pneumophila
Acreditación
ISO 17025
laboratorios
58 cepas detectadas
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017
58 cepas detectadas
(91 % )

16. 04 Validación – Acreditación
IMS – LEGIPID ®
Acreditación
Recuperación con muestras reales (sin inocular)
1
1,5
2
2,5
3
Ɩ Legipid-Cultivo Ɩ, log CFU
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017
0
0,5
Natural M1 M2

17. 04 Validación – Acreditación
IMS – LEGIPID ®
Certificado AOAC nº 111101
Validación inicial: 2 laboratorios ISO 17025
Estudio intercolaborativo 12 laboratorios
Estudio inclusividad / exclusividad
Recuperación con muestras reales (sin
Acreditación
ISO 17025
laboratorios
(sin inocular)
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18. 04 Validación – Acreditación
IMS – LEGIPID ®
Acreditación
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017

19. 04 Validación – Acreditación
Cuantitativo
Recuperación
Reproducibilidad
Acreditación
Cualitativo
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017
Límite de detección

20. 04 Validación – Acreditación
1 ml 1 ml (1/10)
Legipid: log UFCeq1,……………………………………….…..., log
UFCeq10
9 ml
agua destilada
10 x 9 ml L0
Paso 1: Titulación
Acreditación
,……………………………………….…..., log
Calcular
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Calcular
, s
Rango alto

21. 04 Validación – AcreditaciónAcreditación
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22. 05 Trabajos realizados
Estudios en duchas y lavapiesEstudios en duchas y lavapies
temporada de baño.
Estudios aguas utilizadas
Estudios en hospitales,
lavapies de playas antes de empezar lalavapies de playas antes de empezar la
utilizadas en el riego de campos de golf
SIM en la prevención de la Legionelosis. Castellón, 11-Julio-2017
, hoteles y balnearios

23. 05 Trabajos realizados
PARÁMETROS CULTIVO EN PLACA
ISO 11731
TÉCNICAS
MOLECULARES
(PCR y PMA
TIEMPO de
RESULTADO
10-15 DÍAS 3-6 HORAS
CUALIFICACIÓN DEL
OPERARIO
MEDIA ALTA
ESPECIFICIDAD MEDIA ALTA
AUTOMATIZACIÓN NO SI
INSTRUMENTAL
ESPECÍFICO
NO SÍ
TRAINING MEDIO ALTO
Limite de detección es teórico según
volumen sembrado de muestra.
El límite de detección real no proporciona
cumplimiento al RD 865/2003.
TRAINING MEDIO ALTO
LOD BAJO / MEDIO
(teórico / real)
BAJO (PCR)
MEDIO (PMA
ACREDITABLE SI SI (PCR)
Difícil (PMA
TÉCNICAS
MOLECULARES
(PCR y PMA-PCR)
TÉCNICA
FISH
LEGIPID
6 HORAS 4-6 HORAS 60 - 90 MINUTOS
ALTA ALTA BAJA
ALTA ALTA ALTA
NO SI
SI NO
ALTO MEDIO / ALTO BAJO
Limite de detección es teórico según
volumen sembrado de muestra.
El límite de detección real no proporciona
cumplimiento al RD 865/2003.
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ALTO MEDIO / ALTO BAJO
BAJO (PCR)
MEDIO (PMA-PCR)
MEDIO / ALTO
(células)
MEDIO – BAJO
(UFC equivalentes)
(PCR)
Difícil (PMA-PCR)
Difícil SI